Preparazione del campione TMT per l'invio di strutture proteomiche e la successiva analisi dei dati

I principali vantaggi di questo protocollo sono che riduce i costi di etichettatura, migliora l'estrazione delle proteine e genera dati di alta qualità. I principali vantaggi del nostro protocollo sono l'elevata efficienza di etichettatura per i diversi tipi di campioni, la sua riproducibilità e l'acquisizione affidabile dei dati. Dopo aver isolato i campioni di tessuto muscolare del quadricipite da un topo eutanasiato secondo un protocollo approvato dalla IACUC, pesare 10 milligrammi di tessuto muscolare e utilizzare una pinzetta per separare le fibre muscolari.

Per creare un lisato, trasferire il campione di tessuto separato in un tubo a due millilitri contenente 200 microlitri di perline di silice di zirconia millimetrica e 500 microlitri di tampone di lisi CHAPS. Posizionare i campioni in un disgregatore perline ed eseguire due esecuzioni sequenziali di 45 secondi. Dopo il secondo ciclo, per rilasciare la proteina legata al DNA, sonicare il campione 10 volte per 10 secondi per sonicazione ad un'ampiezza del 50% con intervalli di 30 secondi sul ghiaccio.

Dopo l'ultima sonicazione, centrifugare il lysate e trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga. Per il trattamento reagente riducente/alchilante, trasferire 200 microgrammi di proteine per condizione in nuovi tubi di centrifuga e utilizzare un tampone di lisi CHAPS fresco per portare il volume finale in ogni tubo fino a 100 microlitri. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di TCEP a ciascun tubo e incubare i campioni a 55 gradi Celsius per un'ora.

Al termine dell'incubazione, sciogliere nove milligrammi di iodoacetamide in 132 microlitri di TEAB da 100 millimolare e proteggere dalla luce la risultante soluzione di iodoacetamide da 375 millimolare. Quindi aggiungere cinque microlitri di iodoacetamide a ciascun campione e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce. Per la precipitazione metanolo/cloroformio, aggiungere 400 microlitri di metanolo a ciascuno 100 microlitri di proteine e vortice brevemente i campioni.

Per incorporare i liquidi depositati ai lati dei tubi campione, centrifugare brevemente i campioni e aggiungere 100 microlitri di cloroformio a ciascun tubo. Dopo un breve vortice, centrifugare rapidamente di nuovo i tubi per raccogliere il liquido ai lati dei tubi e aggiungere 300 microlitri d'acqua ai campioni. Vortice vigorosamente per ottenere soluzioni omogenee e centrifugare i campioni per un minuto nelle stesse condizioni di centrifuga.

Alla fine della centrifuga, trasferire accuratamente i tubi su un rack senza disturbare gli strati e rimuovere con cura il supernatante. Aggiungere 300 microlitri di metanolo alle restanti fasi inter e inferiori e vortice di nuovo vigorosamente i campioni. Centrifugare i campioni per due minuti e aspirare con cura i supernatanti.

Quindi aspirare delicatamente più liquido possibile da ogni campione sotto un flusso d'aria fino a quando i pellet sono solo un po 'umidi. Valutare l'idratazione ogni due minuti per circa 10 minuti. Se necessario, i pellet possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione.

Per digerire la proteina, rimescolare il pellet precipitato in 100 microlitri del tampone di lysis TEAB e aggiungere 100 microlitri di soluzione di stoccaggio della tripside sul fondo di una fiala di vetro di tripside da 100 microgrammi. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, aggiungere 2,5 microlitri della soluzione di tripina appena preparata per 100 microgrammi di proteine a ciascun campione e incubare i campioni a 37 gradi Celsius durante la notte. Per l'etichettatura peptidica, sciogliere ogni flaconcino a tag TMT da 0,8 milligrammi con 41 microlitridi di acetonitrile anidro per etichetta e incubare i reagenti per cinque minuti a temperatura ambiente con vortici occasionali mantenendo le etichette protette dalla luce.

Al termine dell'incubazione, centrifugare brevemente le fiale e aggiungere con cura 41 microlitri di reagente per etichette TMT a ciascun campione di 100 microlitri per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, dissetare le reazioni con l'aggiunta di otto microlitri del 5% di idrossilammina per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi dividere i campioni in aliquote uguali in nuovi tubi di centrifuga per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius.

In questa acquisizione rappresentativa dei dati, sono stati analizzati 39.653 peptidi totali, di cui 4.457 avevano peptidi uguali o superiori a due peptidi unici e 3.829 includevano ioni reporter per tutti i canali. Un taglio del cambiamento di piega è stato utilizzato per determinare la distribuzione relativa delle proteine da malattie rispetto alle cellule sane con 296 proteine di abbondanza significativamente inferiore e 108 proteine di abbondanza significativamente più elevata osservate. L'analisi PANTHER ha mostrato una lista categorizzata di proteine basate su un'abbondanza significativamente inferiore o più elevata di cellule mascellate in base alla loro funzione molecolare.

L'analisi delle stringhe delle proteine di abbondanza significativamente inferiore o superiore identificò ulteriormente molteplici interazioni e forti associazioni tra proteine. Ulteriori metodi possono essere eseguiti per identificare le interazioni proteina-proteina, per classificare le interazioni per gruppi e per identificare le interazioni in una varietà di percorsi. Le tecniche di proteomica sono potenti strumenti all'interno dei campi di ricerca biomedica per comprendere i meccanismi di sviluppo delle malattie fornendo informazioni dettagliate sull'abbondanza delle proteine.