Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare gli effetti mediati dai recettori GABA B in interneuroni ippocampali positivi per la parvalbumina. Questo viene ottenuto innanzitutto producendo fette ippocampali acute di alta qualità. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare un microscopio video per selezionare i neuroni in base all'espressione venosa di YFP e alle caratteristiche note degli interneuroni positivi per la parvalbumina.

In seguito vengono effettuate registrazioni con tecnica del patch clamp su cellule intere e si utilizza o una stimolazione extracellulare o registrazioni accoppiate per esaminare gli effetti mediati dai recettori GABA B. L'ultimo passaggio consiste nel visualizzare i neuroni e nel confermare che i neuroni registrati siano effettivamente positivi per l'albumina parva e che si tratti di neuroni inibitori para-somatici o dendritici. In definitiva, questo metodo permette la caratterizzazione degli effetti inibitori mediati dai recettori GABA B e consente una classificazione inequivocabile degli interneuroni registrati.

Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo dei neuroni intercalari. Ad esempio, come i neuroni intercalari comunicano tra loro, come la loro eccitabilità e il loro output sinaptico sono controllati dai sistemi neuromodulatori. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sul controllo GABAergico dei neuroni intercalari dell'ippocampo, può essere applicato anche ad altre regioni cerebrali, sistemi neuromodulatori o tipi cellulari.

Prelevare il cervello di un ratto transgenico di 17-24 giorni che esprime la proteina fluorescente YFP venosa, mantenuto in saccarosio semicongelato con carbogeno, utilizzando un bisturi; rimuovere il terzo anteriore della corteccia, il cervelletto e separare gli emisferi. Rimuovere la superficie dorsale della corteccia per ottenere una superficie piana su cui incollare il cervello per la sezionatura. Incollare gli emisferi sulla piattaforma del viome con il bagno del viome riempito di saccarosio nativo con carbogeno congelato.

Un taglio di LCR prepara fette trasversali di 300 micrometri dell'formazione ippocampale. Trasferire ogni fetta in una camera di mantenimento immersa contenente saccarosio carbogenato, un LCR a 35 gradi Celsius. Dopo 30 minuti dal posizionamento dell'ultima fetta nel saccarosio riscaldato, trasferire le fette a temperatura ambiente per la conservazione.

Prelevare pipette per il patch da capillari di vetro in modo da ottenere una resistenza della pipetta compresa tra due e quattro megaohm. Dopo averle riempite, trasferire una sezione ippocampale nella camera di registrazione, fissandola in posizione con un anello di platino al quale sono attaccati singoli fili di seta. Posizionare la camera nell'apparato di registrazione e iniziare la perfusione con soluzione fisiologica artificiale (CSF) riscaldata e saturata con carbogeno, a un flusso compreso tra cinque e dieci millilitri al minuto.

Utilizzare una videocamera per valutare la qualità della sezione in ottica I-R-D-I-C con un ingrandimento dell'obiettivo di 40x. Si consideri che la sezione sia di buona qualità qualora sia possibile osservare un elevato numero di cellule parametali di forma rotondeggiante e con contrasto moderato nello strato parametrale, a una profondità compresa tra 20 e 30 micrometri al di sotto di una superficie liscia e leggermente craterizzata.

Utilizzando un'illuminazione epifluorescente, identificare i presunti interneuroni a scarica rapida come quelle cellule che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) con corpi cellulari multipolari di grandi dimensioni nello strato parama o nelle sue immediate vicinanze. Successivamente, riempire le pipette per il patch con una soluzione contenente una bassa concentrazione di cloruro fisiologicamente rilevante, al fine di identificare le correnti postsinaptiche, e posizionarle nel portapipetta sullo stadio della testa. Applicare quindi una bassa pressione positiva attraverso la linea del tubo.

Abbassi la pipetta sulla superficie della sezione, leggermente spostata rispetto al centro del neurone selezionato. Aumenti la pressione a 70-80 millibar e abbassi rapidamente la pipetta attraverso la sezione fino a posizionarla appena sopra il soma della cellula selezionata. Prema la pipetta contro la membrana cellulare per produrre una piccola depressione.

Eseguire questo passaggio rapidamente. Per evitare l'etichettatura con biotina delle cellule adiacenti, creare un sigillo gigaohm rilasciando la pressione e applicando contemporaneamente un comando di tensione negativo di 20 millivolt alla pipetta. Una volta iniziato il sigillamento, ridurre il comando di tensione al potenziale di membrana a riposo previsto, tipicamente compreso tra -70 e -60 millivolt.

Ora applicare un breve impulso di pressione negativa per rompere il patch della membrana, ottenendo così la configurazione whole cell. Utilizzando la modalità di clampaggio della corrente, identificare i neuroni intercalati a spiking rapido in base alla loro risposta a una serie di impulsi di corrente da iperpolarizzanti a depolarizzanti. Per osservare le risposte evocate sinapticamente, posizionare un elettrodo di stimolazione extracellulare nella sezione al confine tra lo strato radiatum e lo strato molecolare lacunosum.

In modalità voltage clamp, utilizzare uno stimolatore elettrico costante isolato per somministrare, ogni 20 secondi, singoli stimoli elettrici o treni di cinque stimoli elettrici a 50 volt a 200 hertz agli assoni pre-sinaptici. Successivamente, applicare antagonisti dei recettori ionotropici del glutammato nel bagno al fine di rivelare l'IPSC monosinaptico isolato.

Isolare ulteriormente l'IPSC mediato dal recettore GABA B mediante l'applicazione di un antagonista del recettore GABA a. Per iniziare le registrazioni accoppiate, stabilire innanzitutto una registrazione in configurazione whole cell di un interneurone pre-sinaptico come in precedenza e confermare il fenotipo a spiking rapido.

Successivamente, effettuare una registrazione su una cellula parametale CA a una distanza di 20-100 micrometri dall'interneurone che contiene l'interneurone presinaptico. In modalità voltage clamp in corrente. Applicare brevi impulsi di corrente depolarizzanti al livello di soglia SRA per indurre potenziali d'azione nell'interneurone.

Se è presente una connessione sinaptica, i potenziali d'azione nell'interneurone determinano correnti postsinaptiche (IPC) nella cellula parametamerica ca uno mantenuta in voltage clamp. Una volta stabilita la connessione, si inducano coppie di potenziali d'azione nell'interneurone presinaptico a scarica rapida mediante un protocollo standard di coppia di impulsi costituito da due stimoli depolarizzanti con un intervallo di 50 millisecondi. Dopo aver registrato i tracciati di controllo, si applichi l'agonista selettivo dei recettori GABA B, baclofene, all'ACSF in perfusione, attivando così i recettori GABA B.

Successivamente, applicare l'antagonista CGP 55 8 45 per bloccare completamente gli effetti mediati dal recettore. Una volta completata la registrazione, ritirare lentamente la pipetta dal corpo cellulare in regime di voltage clamp. Mentre la resistenza serie misurata aumenta, ridurre il voltaggio della membrana a meno 40 millivolt per sigillare la membrana somatica formando una patch outside-out.

Dopo le registrazioni, fissare le sezioni immergendole in paraformaldeide al 4% con tampone fosfato 0,1 M, lasciandole in incubazione tutta la notte a quattro gradi Celsius. Lavare successivamente con tampone fosfato, quindi con soluzione salina tamponata al fosfato, e bloccare con siero di capra normale al 10%, TRITON X-100 allo 0,03% e azoturo di sodio allo 0,05% per un'ora a temperatura ambiente. Per l'etichettatura dell'espressione della parvalbumina, utilizzare un anticorpo monoclonale murino anti-parvalbumina diluito in una soluzione contenente siero di capra normale al 5%, TRITON X-100 allo 0,3% e azoturo di sodio allo 0,05% in PBS. Incubare gli anticorpi primari per due o tre giorni a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, risciacquare accuratamente le sezioni in PBS, quindi applicare anticorpi secondari fluorescenti anti-topo insieme a una proteina legante la biotina, streptavidina, coniugata a un fluorocromo, e incubare in una soluzione contenente siero di capra normale al 3%, TRITON X-100 allo 0,1% e azoturo di sodio allo 0,05% diluiti in PBS, per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, risciacquare abbondantemente le sezioni due o tre volte con PBS, seguiti da due o tre risciacqui in tampone fosfato.

Montare le sezioni su vetrini e utilizzare un distanziatore in agar di 300 micrometri per impedire il collasso della sezione. Quindi coprire le sezioni con un mezzo di montaggio fluorescente e sigillare con vernice per unghie. Valutare l'immunoreattività alla parvalbumina dell'interneurone mediante ingrandimento elevato e apertura numerica.

Si considera che le cellule del nucleo cocleare superiore siano immunoreattive per la parvalbumina. Se l'etichettatura immunoistochimica risulta allineata con le strutture marcate con biotina, acquisire una serie di immagini lungo l'asse Z mediante microscopio confocale a scansione laser, rilevando il marcatore fluorescente Aden per l'identificazione morfologica e la ricostruzione tridimensionale. Successivamente, ricostruire l'immagine del neurone in tre dimensioni, includendo l'arborizzazione dendritica e assonica.

La risposta sinaptica composta di un interneurone a spiking rapido in risposta a un singolo stimolo extracellulare è mostrata qui. L'applicazione degli antagonisti dei recettori ionotropi del glutammato, DNQX e A PV isola, la corrente postsinaptica inibitoria monosinaptica o IPSC applicazione dell'antagonista del recettore gabaa. Gazin ha abolito la componente rapida dell'IPSC.

Una serie di cinque stimoli ha rivelato un IPSC lento mediato dai recettori GABA B, che è stato bloccato dall'applicazione successiva di CGP. Questi tracciati mostrano potenziali d'azione nel neurone intermedio pre-sinaptico a sparo rapido e IPSC unitari con latenza breve in cellule paramediali del CA1 in condizioni di controllo, dopo l'applicazione in bagno di baclofene e successiva applicazione di CGP. Si noti che il baclofene riduce l'ampiezza dell'IPSC di circa il 50%, mentre l'antagonista del recettore GABA B determina un recupero quasi completo dell'ampiezza dell'IPSC.

Un grafico temporale dell'ampiezza della corrente sinaptica inibitoria mostra l'effetto di baclofene e CGPA. Un interneurone a scarica rapida, mostrato a un ingrandimento di 20x, presentava il soma localizzato al confine tra lo strato radiatum e il paramedial del settore CA1, con dendriti che si estendevano verticalmente attraversando tutti i livelli. Mentre la maggior parte dell'assone si trova nel e intorno al livello dei corpi cellulari, tipico dei neuroni cestello, un'immagine a 60x mostra caratteristici cestelli di assoni che si formano intorno a putative cellule paramediali del CA1, indicate dall'asterisco arancione. Qui viene mostrata una ricostruzione tridimensionale dello stesso interneurone, con soma e dendriti in nero e assone in rosso.

I livelli del CA1 sono delineati in blu una volta padroneggiata la tecnica. Questa metodica può essere eseguita in un solo giorno, con l'analisi morfologica postdottorale effettuata su diverse sezioni contemporaneamente dopo il suo sviluppo. Questo approccio combinato ha aperto la strada ai ricercatori dei microcircuiti ippocampali e corticali per esplorare la diversità morfologica e fisiologica, nonché le interrelazioni struttura-funzione dei tipi di interneuroni.