Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare gli effetti mediati dal recettore GABA B negli interneuroni positivi alla parvalbumina dell'ippocampo identificati. Ciò si ottiene producendo prima fette acute di ippocampo di alta qualità. Il secondo passo consiste nell'utilizzare un videomicroscopio per selezionare i neuroni in base all'espressione venosa di YFP e alle caratteristiche note dei neuroni positivi all'albumina parallela.

Successivamente, si ottengono registrazioni di patch clamp su cellule intere e si utilizza la stimolazione extracellulare o le registrazioni accoppiate per esaminare gli effetti mediati dal recettore GABA B. Il passo finale consiste nel visualizzare i neuroni e confermare che i neuroni registrati sono in realtà par albumina positivi e sono neuroni inibitori parasomatici o dendritici. In definitiva, questo metodo consente la caratterizzazione degli effetti inibitori mediati dal recettore GABA B e consente una classificazione inequivocabile degli interneuroni registrati.

Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo interneuronale. Ad esempio, come gli interneuroni comunicano tra loro, come la loro eccitabilità, la loro produzione sinaptica è controllata da sistemi neuromodulatori. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sul GABAergico, il controllo dell'ippocampo nei neuroni, può essere applicato anche ad altre regioni del cervello, sistemi neuromodulatori o tipi di cellule.

Prendi il cervello di un ratto transgenico di 17-24 giorni che esprime YFP venoso fluorescente conservato in saccarosio carbogeno semicongelato, un CSF usando un bisturi, rimuovi il terzo frontale della corteccia, il cervelletto, e separa gli emisferi. Rimuovere la superficie dorsale della corteccia per fornire una superficie piana per incollare il cervello per il sezionamento. Incollare gli emisferi sullo stadio viome con il bagno viome riempito con saccarosio nativo di carbogeno rozen.

Un liquido cerebrospinale ha tagliato fette trasversali di 300 micrometri della formazione ippocampale. Trasferire ogni fetta in una camera di contenimento sommersa contenente saccarosio di carbogeno, A CSF a 35 gradi Celsius. 30 minuti Dopo aver messo l'ultima fetta nel saccarosio riscaldato, A CSF trasferisce le fette a temperatura ambiente per la conservazione.

Estrarre le pipette patch dai capillari di vetro in modo da ottenere una resistenza della pipetta da due a quattro mega ohm. Una volta riempita, trasferisci una fetta di ippocampo nella camera di registrazione, tenendola in posizione con un anello di platino infilato con singole fibre di seta. Posizionare la camera nella configurazione di registrazione e iniziare la perfusione con il CSF di registrazione A riscaldato dal carbogeno a una velocità di flusso da cinque a 10 millilitri al minuto.

Utilizzare una videocamera per valutare la qualità della fetta in ottica I-R-D-I-C con un ingrandimento dell'obiettivo di 40x. Supponiamo che la fetta sia di buona qualità. Se un gran numero di cellule parametalliche di ca one rotonde moderatamente contrastate possono essere osservate nel parametro dello strato a profondità da 20 a 30 micrometri al di sotto di una superficie liscia e leggermente craterizzata.

Utilizzando l'illuminazione epifluorescente, identificare i presunti interneuroni a picco rapido come quelli che esprimono YFP venoso con grandi somatici multipolari all'interno o vicino allo strato parama. Successivamente, riempire le pipette patch con una soluzione contenente una concentrazione di cloruro bassa e fisiologicamente rilevante per l'identificazione delle correnti post-sinaptiche e posizionarla nel supporto della pipetta sul tavolino di testa. Quindi applicare una bassa pressione positiva attraverso la linea del tubo.

Abbassare la pipetta sulla superficie della fetta, leggermente spostata rispetto al centro del neurone selezionato. Aumentare la pressione a 70-80 millibar e abbassare rapidamente la pipetta attraverso la fetta fino a poco sopra il soma della cellula selezionata. Premere la pipetta contro la membrana cellulare per produrre una fossetta su di essa.

Eseguire rapidamente questo passaggio. Per evitare l'etichettatura della biotina delle celle vicine, creare una tenuta giga ohm rilasciando la pressione e applicando contemporaneamente un comando di tensione negativa di 20 millivolt alla pipetta. Una volta iniziata la sigillatura, ridurre il comando di tensione al potenziale di membrana a riposo previsto, in genere tra 70 e 60 millivolt negativi.

Ora applicare un breve impulso di pressione negativa per rompere il cerotto di membrana, ottenendo così l'intera configurazione cellulare. Utilizzando la modalità current clamp, è possibile identificare i neuroni inter a picco rapido in base alla loro risposta a una famiglia di impulsi di corrente iperpolarizzanti o depolarizzanti. Per osservare le risposte evocate sinapticamente, posizionare un elettrodo di stimolazione extracellulare nella fetta al confine tra lo strato radio e la registrazione molecolare dello strato di laminazione.

In modalità voltage clamp, utilizzare uno stimolatore a tensione costante isolato per erogare treni singoli o da 200 hertz di cinque stimoli elettrici da 50 volt agli assoni pre-sinaptici ogni 20 secondi. Successivamente, applicare gli antagonisti del recettore ionotropico del glutammato al bagno per rivelare i mono isolati. IPSC sinaptico.

Isolare ulteriormente l'IPSC mediata dal recettore GABA B con l'applicazione di un antagonista del recettore GABA A. Per avviare le registrazioni accoppiate. In primo luogo, stabilire una registrazione dell'intera cellula di un interneurone presinaptico come prima e confermare il fenotipo a picco rapido.

Successivamente, applicare un cerotto a una cellula parametallica CA entro una distanza compresa tra 20 e 100 micrometri dall'interneurone che tiene il interneurone presinaptico. In modalità pinza amperometrica. Applicare brevi impulsi di corrente depolarizzante della soglia SRA per suscitare potenziali d'azione nell'interneurone.

Se è presente una connessione sinaptica, i potenziali d'azione nell'interneurone provocano IPC nella cellula parametallica bloccata in tensione. Una volta stabilita una connessione, suscitate coppie di potenziali d'azione nell'interneurone presinaptico a picco rapido con un tipico protocollo di impulsi accoppiati di due stimoli depolarizzanti con un intervallo di 50 millisecondi. Dopo aver raccolto le tracce di controllo, applicare l'agonista selettivo del recettore GABA B baclofene al liquido cerebrospinale A perfondente, attivando così i recettori GABA B.

Successivamente, applicare l'antagonista CGP 55 8 45 per bloccare completamente gli effetti mediati dal recettore. Una volta completata la registrazione, estrarre lentamente la pipetta dal corpo della cella in voltage clamp. All'aumentare della resistenza misurata in serie, ridurre la tensione della membrana a 40 millivolt negativi per sigillare la membrana somatica formando un cerotto esterno verso l'esterno.

Dopo le registrazioni, fissare le fette mediante immersione in para formaldeide al 4% con tampone fosfato molare 0,1 molare durante la notte a quattro gradi Celsius tampone fosfato di lavaggio, quindi in soluzione salina tamponata con fosfato e blocco con siero di capra normale al 10% 0,03% TRITTON X 100 e 0,05% azoturo di sodio per un'ora a temperatura ambiente per etichettare per l'espressione di par albumina, utilizzare un anticorpo monoclonale di topo anti parvalbumina diluito in una soluzione contenente il 5% di siero di capra normale, lo 0,3% di TRITTON X 100 e lo 0,05% di sodio azide in PBS, incubare gli anticorpi primari per due o tre giorni a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, sciacquare accuratamente le fette in PBS, applicare anticorpi secondari fluorescenti anti-US insieme a una proteina legante la biotina coniugata a un fluorocromo e incubare in una soluzione contenente il 3% di siero di capra normale, lo 0,1% di tritton X 100 e lo 0,05% di sodio diluito in PBS, incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo sciacquare abbondantemente le fette due o tre volte con PBS seguito da due o tre risciacqui in tampone fosfato.

Montare le fette su vetrini e utilizzare un distanziatore di agar da 300 micrometri per evitare che la fetta collassi. Quindi coprire le fette con un mezzo di montaggio fluorescente e sigillare con smalto per unghie. Valutare l'immunoreattività dell'albumina par dell'interneurone con un alto ingrandimento e apertura numerica.

Le cellule obiettivo del cristallino sono ritenute immunoreattive per la par albumina. Se si osserva che l'immunomarcatura si allinea con le strutture marcate con la biotina, prendere una serie di immagini dell'asse Z con un microscopio confocale a scansione laser, imaging fluorescente Aden per l'identificazione morfologica e la ricostruzione tridimensionale. Quindi ricostruisci l'immagine in neurone in tre dimensioni, incorporando l'arborizzazione dendritica e assonale.

Qui viene mostrata la risposta sinaptica composta di un interneurone a picco rapido in risposta a un singolo stimolo extracellulare. Applicazione degli antagonisti del recettore ionotropico del glutammato, DNQX e A PV isolati, la corrente post-sinaptica inibitoria monos sinaptica o l'applicazione IPSC dell'antagonista del recettore gabaa. Gazin ha abolito la componente veloce dell'IPSC.

Un treno di cinque stimoli ha rivelato una IPSC mediata dal recettore GABA B lento, che è stata bloccata dalla successiva applicazione di CGP. Queste tracce mostrano potenziali d'azione nelle PSC presinaptiche, interneuronali a rapido spiking e I unitarie a breve latenza in cellule parametalliche CA 1 in condizioni di controllo dopo bagno, applicazione di baclofene e successiva applicazione di CGP. Si noti che il baclofene riduce l'ampiezza dell'IPSC di circa il 50%, mentre l'antagonista del recettore GABA B ha portato a un recupero quasi completo dell'ampiezza dell'IPSC.

Un grafico dell'andamento temporale dell'ampiezza IPSC mostra l'effetto del baclofene e del CGPA che si schizza rapidamente tra i neuroni mostrati a un ingrandimento di 20 x aveva un somata situato al bordo dello strato radio e una bambola parama dell'area ca one con dendriti che corrono verticalmente e si estendono su tutti gli strati. Mentre la maggior parte dell'assone si trova all'interno e intorno allo strato del corpo cellulare, come tipico per le cellule a cesto, un'immagine con ingrandimento 60 x mostra tipici cesti di assoni che si formano attorno a un presunto parametallo salata, contrassegnati dall'asterisco arancione. Una ricostruzione tridimensionale dello stesso interneurone è mostrata qui con il soma e i dendriti in nero e l'assone in rosso.

Gli strati del ca one sono delineati in blu Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in un giorno con l'analisi morfologica post-dottorato eseguita su più fette contemporaneamente dopo il suo sviluppo. Questo approccio combinato ha aperto la strada ai ricercatori dei microcircuiti ippocampali e corticali per esplorare la diversità fisiologica morfologica e l'interrelazione struttura-funzione dei tipi interneuroni.