Name: Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dellippocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Impara la registrazione patch-clamp whole-cell da interneuroni dell'ippocampo identificati morfologicamente e neurochimicamente. Questo metodo permette di caratterizzare gli effetti mediati dai recettori GABA B nei circuiti inibitori.

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Gli autori desiderano ringraziare Ina Wolter per la sua eccellente assistenza tecnica. VGAT-Venus ratti transgenici sono stati generati da Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi e Y. Kawaguchi in Istituto Nazionale per le Scienze Fisiologiche, Okazaki, Giappone, utilizzando pCS2-Venere fornito dal Dr. A. Miyawaki.

Dichiarazione Etica: tutte le procedure e animale manutenzione sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali, la legge tedesca Animal Welfare, il Consiglio direttiva 86/609 / CEE per quanto riguarda la protezione degli animali europea, e le linee guida delle autorità locali (Berlino, T-0215/11 ) 1 Preparazione di fette acuta-ippocampali <ol><li> Prendete un topo transgenico (da 17 a 24 giorni di età), che esprime la proteina fluorescente Venere / YFP sotto il promotore vGAT, che etichetta la maggior parte di interneuroni inibitori corticali 13. Decapitare il ratto. Rapidamente sezionare il cervello (&lt;40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% di CO 2) fluido a base di saccarosio-artificiale cerebrospinale (saccarosio-ACSF, Figura 1A). </li><li> Valutare il cervello di ratto sezionato per Venus / YFP fluorescenza con 505 nm lampada e 515 filtro per le emissioni LED, montata su un paio di occhiali. </li><li> Rimuovere il terzo anteriore della corteccia e cerebEllum; quindi separare gli emisferi, il tutto con un bisturi. Rimuovere la superficie dorsale della corteccia per fornire una superficie piana per incollare il cervello giù, come descritto in precedenza 14. </li><li> Tagliare a fette trasversali (300 micron) della formazione dell&#39;ippocampo su un vibratome, gli emisferi devono essere circondati da semifrozen, carbogenated saccarosio-ACSF (Figura 1B) 14. Rimuovere ulteriori regioni di rostrale della corteccia, mesencefalo e tronco encefalico. Trasferire ogni fetta di una camera di contenimento sommerso contenenti saccarosio-ACSF, che è carbogenated e riscaldato a 35 ° C. </li><li> Lasciate le fette di recuperare a 35 ° C per 30 minuti dal momento dell&#39;ultima fetta di entrare nel ACSF riscaldato. Fate questo in modo da riattivare i processi metabolici e facilitare la richiusura dei processi neuronali tagliati. Poi il trasferimento a temperatura ambiente per lo stoccaggio (Figura 1C). </li></ol> 2 Fabbricazione e riempimento di registrazione Pipettes <ol><li> Pupipette di patch ll da capillari di vetro, in modo che una resistenza pipetta di 2-4 MW si raggiunge quando riempita di filtrato (filtro a siringa, dimensione dei pori: 0,2 micron) soluzione intracellulare contenente 0,1% biocitina (per l&#39;etichettatura intracellulare). Mantenere la soluzione intracellulare raffreddato in ghiaccio per impedire il degrado dei suoi componenti. </li><li> Riempire pipette di patch per l&#39;identificazione delle correnti post-sinaptiche con una soluzione contenente un basso Cl fisiologicamente rilevanti - concentrazione (E R (Cl) = -61 mV; vedi elenco soluzione). </li><li> Per le registrazioni coppie di identificare le risposte recettore mediata presinaptiche, riempire pipette di patch con la soluzione intracellulare con bassa capacità di Ca 2 + buffer per evitare interferenze con il rilascio del trasmettitore presinapticamente, così come 4 volte superiore Cl - concentrazione (E R (Cl) = -20 mV) per migliorare il rapporto segnale-rumore di IPSCs osservati 5 consentano una valutazione accurata di resp farmacologicaonsiveness. Si noti che la modifica Cl - concentrazione può alterare IPSC cinetica 15. </li></ol> 3. cellule intere patch-clamp Registrazione da FS-INS <ol><li> Carbogenate ACSF e alimentare attraverso il sistema di perfusione alla camera di registrazione, per mezzo di una pompa peristaltica (che rimuove anche ACSF dalla camera di registrazione attraverso una linea di aspirazione, la Figura 2A). Accendere tutte le apparecchiature del setup in preparazione per la registrazione. </li><li> Trasferire una fetta di camera di registrazione e tenere in posizione con un anello in platino infilate con singole fibre di seta. Posizionare la fetta in modo che lo strato (str.) Pyramidale di CA1 scorre verticalmente attraverso il campo di vista, consentendo l&#39;accesso con 2 pipette sia alla str. radiatum e str. Oriens contemporaneamente (Figure 2C e 4A). </li><li> Posizionare la camera nel setup e avviare la perfusione di carbogenated e riscaldata (32-34 ° C) la registrazione di unCSF a una portata di 5-10 ml / min. </li><li> Valutare la qualità fetta sotto l&#39;ottica IR-DIC a 40X di ingrandimento obiettivo, e visualizzare con una camera CCD visualizzata su un display. Assumere buona qualità fetta se un gran numero di rotonde, moderatamente contrasto cellule CA1 piramidali CA1 (PC) può essere visto in str. pyramidale a profondità di 20-30 micron di sotto di una superficie liscia e leggermente crateri (Figura 2C). Fette di scarsa qualità contengono un gran numero di cellule altamente contrastati, rimpicciolite o gonfie, con una superficie fetta irregolare. </li><li> Identificare putativi interneuroni FS sotto illuminazione epifluorescenza come quelli che esprimono Venere / YFP (Figura 2B), con ampio somata multipolare dentro o vicino alla str. pyramidale. Selezionare le celle ragionevolmente profondo all&#39;interno della slice (50-100 micron, Figura 2C), al fine di preservare meglio l&#39;integrità morfologica. </li><li> Montare l&#39;elettrodo di registrazione nel supporto pipetta sulla headstage; poi apply bassa, pressione positiva (20-30 mBar) attraverso la linea tubo. Abbassare la pipetta alla superficie della fetta, leggermente spostata verso il centro del neurone selezionato. </li><li> Ottenere configurazione di registrazione whole-cell come descritto in precedenza 14,16 e vedi anche figure 2D e 2E: <ol><li> Obiettivo di una cella: Aumentare la pressione di 70-80 mBar e rapidamente abbassare la pipetta con la fetta appena sopra la soma della cella selezionata (Figura 2D, in alto). </li><li> Avvicinarsi alla cella: Premere la pipetta contro la membrana cellulare per produrre una &quot;fossetta&quot; su di esso (Figura 2D, in alto). Eseguire questo passaggio rapido, al fine di evitare l&#39;etichettatura biocitina delle cellule vicine. </li><li> Creare un sigillo giga-ohm: Rilasciare la pressione e contemporaneamente applicare un comando di tensione 20 mV alla pipetta. Una guarnizione giga-ohm (1-50 GΩ; la figura 2D, fondo e figura 2E centro) typicalleato si sviluppa rapidamente. Una volta sigillato, applicare la membrana a riposo previsto potenziale (tipicamente tra -70 e -60 mV) come comando di tensione. </li><li> Sfondare la patch: Una volta sigillato, rottura la patch di membrana con un breve impulso di pressione negativa; ottenendo così la configurazione whole-cell (Figura 2E, in basso). </li></ol></li><li> Compensare capacità whole-cell e la resistenza serie (S R). R s è normalmente 5-20 MW e stabile per un massimo di 120 min. Abbandonare le cellule se potenziale di membrana (V M) sul break-through è più depolarizzata a -50 mV; R S è inizialmente superiore a 30 MW; R o S cambia di più del 20% nel corso della registrazione. </li><li> Identificare FS-in da loro risposta (in modalità current-clamp) per una famiglia di iper per depolarizzanti impulsi di corrente (-250 a +250 pA, Figura 2F, in alto). FS-in sono relativamente depolarizzata V M (tipicamente -50 to -60 mV), a breve membrana costante di tempo (&lt;20 msec) e rispondere ad un 500 pA depolarizzante iniezione di corrente con un treno di potenziali d&#39;azione (AP) a frequenze&gt; 100 Hz 11 (Figura 2F, in basso), che sono marcatamente diversi da quelli in CA1 PC (Figura 2F, al centro). </li></ol> 4. extracellulare stimolazione elettrica per evocare risposte GABA B R-mediata <ol><li> Per osservare le risposte sinapticamente evocate, posizionare un elettrodo di stimolazione extracellulare (una pipetta di patch piena di 2 M NaCl; Resistenza: 0,1-0,3 MW) nella fetta al confine di str. radiatum e str. lacunosum-moleculare. Posizionare l&#39;elettrodo 200-300 micron laterale alla soma per evitare la stimolazione elettrica diretta della cellula e ridurre al minimo gli artefatti di stimolazione (Figura 3a). </li><li> Una volta che l&#39;elettrodo di stimolazione viene posizionato, di ottenere la registrazione whole-cell dila cella scelto e valutare il fenotipo fisiologico in modalità current-clamp, come nella sezione 3.9 (Figura 3B). </li><li> Con il neurone registrato in voltage-clamp (V M -65 mV), consegnare la stimolazione elettrica degli assoni presinaptici a 50 V (~ 500 μA stimolo efficace) ogni 20 secondi, con un isolato a tensione costante stimolatore. Utilizzare solo stimoli (100 msec durata, Figura 3C, in alto) per osservare GABA B R IPSCs mediate, e interleave con treni di stimoli multipli (a 200 Hz) per produrre maggiore rilascio del trasmettitore. </li><li> Bagno applicare ionotropici antagonisti dei recettori del glutammato (AMPA dei recettori: DNQX [10 mM]; recettore NMDA: D-AP5 [50 mM]) per rivelare isolato monosinaptico IPSC (Figura 3C, medio-alta). Inoltre isolare il IPSC GABA B R-mediata con l&#39;applicazione di un bloccante GABA A R (gabazine [10 mM]; Figura 3C mezzo lower). </li><li> Confermare la conseguente lenta verso l&#39;esterno di corrente (Figura 3C inferiore, espanso) ad essere GABA B R-mediata dalla successiva applicazione di CGP-55845 [5 mM] (Figura 3C inferiore, giacente in grigio) </li></ol> 5. accoppiati registrazioni di sinapticamente accoppiate FS-IN e CA1 PC <ol><li> Valutare GABA B R-mediata controllo presinaptica della trasmissione sinaptica inibitoria con le registrazioni simultanee, eseguiti tra sinapticamente-accoppiati IN e PC coppie come descritto di seguito. </li><li> In primo luogo, stabilire una registrazione a cellula intera di un interneuroni presinaptico (come al punto 3) e confermare il fenotipo FS (Figura 4A). </li><li> Poi patchare un CA1 PC vicina (distanza 20-100 micron, Figura 4A) e applicare breve suprathreshold impulsi di corrente depolarizzante (durata 1 msec, 1-5 nA ampiezza) al presinaptica IN (tenutasi in modalità current-clamp) per suscitare AP. Se un co sinapticannection è presente, AP nel risultato IN nel IPSCs nel CA1 PC, tenutasi in voltage-clamp (compensare R S a circa il 80%). </li><li> Se necessario, riempire un nuovo elettrodo di registrazione e registrare da altri PC CA1 finché non si trova una connessione. </li><li> Una volta che la connessione è stabilita, suscitare coppie di AP nel presinaptico FS-IN per valutare sia la risposta sinaptica unitario e comportamento dinamico. Utilizzare un tipico protocollo accoppiato impulsi di 2 stimoli depolarizzanti con un intervallo di 50 msec (Figura 4B). </li><li> Raccogliere le tracce di controllo in condizioni basali. Quindi, applicare i GABA B baclofen R agonisti selettivi (10 micron) per la ACSF perfusione, attivando così GABA B Rs, seguita da antagonista CGP-55845 (5 mM), per bloccare completamente gli effetti del recettore mediata. Raccogliere ~ 50 tracce durante lo stato stazionario di ciascuna condizione di farmaco (Figura 4B e C). </li><li> Una volta che la registrazione è completata, sigillare la membrana somatica formando un Outside-out patch: Lentamente ritirare la pipetta dal corpo cellulare in V-clamp e come R S aumenta, ridurre la V M a -40 mV. Fate questo per facilitare la formazione del cerotto esterno-out; quindi rimuovere la pipetta dal bagno. </li></ol> 6 Analisi delle proprietà elettrofisiologiche <ol><li> NOTA: Una moltitudine di diversi pacchetti software sono disponibili per l&#39;acquisizione dei dati elettrofisiologici. Qui, WinWCP, viene utilizzato un programma di Windows nel pacchetto Strathclyde Elettrofisiologia software libero, che permette di registrare fino a 16 canali di ingresso analogici e l&#39;uscita di 10 segnali digitali. </li><li> Filtro passa-basso tutti i dati a 5-10 kHz e campione a 20 kHz. </li><li> Analizzare i dati fisiologici con una suite di analisi off-line. NOTA: Stimfit, un pacchetto software open source che include una shell Python, è usato in questo caso; comunque altre alternative possono essere facilmente utilizzati al posto. <ol><li> Analizzare membrana passiva proprietà di neuroni registrati, acquisite nel morsetto corrente, dal potenziale di membrana. </li><li> Misurare la media potenziale di membrana dalla linea di base delle risposte registrate dall&#39;inizio della registrazione. </li><li> Calcolare la resistenza di ingresso, utilizzando la legge di Ohm, dalla risposta di tensione ai più piccoli impulsi di corrente iperpolarizzanti (≤ -50 pA). Per migliorare rapporto segnale-rumore, la media più tracce. Nota: i nostri esempi sono tipicamente medie di 10-50 singoli spazza. </li></ol></li><li> Stimare il tempo membrana apparente costante montando una curva monoesponenziale al decadimento delle risposte ai più piccoli impulsi di corrente iperpolarizzanti. </li><li> Analisi del potenziale d&#39;azione della forma d&#39;onda per determinare la soglia, ampiezza (soglia di picco) e la durata (larghezza misurata a metà altezza) suscitata da soglia impulsi di corrente depolarizzante. </li><li> Analizzare GABA B R IPSCs mediate dalle registrazioni clamp di tensione. Filtro traccia off-line all&#39;indirizzo500 Hz (filtro gaussiano) e valutare l&#39;ampiezza di picco e la latenza del GABA B R risposta mediata (in medie di almeno 10 tracce). </li><li> Rileva l&#39;effetto del GABA B Rs sull&#39;uscita inibitorio di Ins come un cambiamento di ampiezza di picco delle IPSCs GABA A R-mediati misurati tra picco e precedente linea di base. Calcolare l&#39;ampiezza media da ≥50 tracce per il periodo di controllo e lo stato stazionario di tutte le epoche farmacologici. </li></ol> 7 Visualizzazione e immunocitochimica di FS-Ins <ol><li> Dopo le registrazioni, fissare le fette per immersione in paraformaldeide al 4% con 0.1 M tampone fosfato (PB, pH = 7,35) O / N a 4 ° C. </li><li> Se fette necessari possono essere trasferiti PB e conservati fino a ~ 1 settimana prima trasformazione. </li><li> Lavare le fette liberamente in PB fresco e successivamente a 0,025 M PB con il 0,9% di NaCl (PBS, pH = 7.35). </li><li> Per ridurre l&#39;anticorpo non specifico vincolante, bloccare le fette for 1 ora a temperatura ambiente in una soluzione contenente 10% di siero di capra normale (NGS), 0,3% Triton-X100 (un detergente per permeabilize membrane) e lo 0,05% NaN 3, costituito in PBS. </li><li> Per etichettare per l&#39;espressione PV, utilizzare un anti-PV topo monoclonale diluito in una soluzione contenente 5% NGS, 0.3% Triton-X100, 0,05% NaN 3, in PBS. Incubare anticorpi primari per 2-3 giorni a 4 ° C 12. Sciacquare accuratamente le fette in PBS. </li><li> Applicare anticorpi secondari anti-topo fluorescenti (ad es AlexaFluor-546.) Insieme alla biotina streptavidina-binding protein, coniugato a un fluorocromo (ad esempio, AlexaFluor-647); e incubare in una soluzione contenente 3% NGS, 0.1% Triton-X100, 0,05% NaN 3, diluito in PBS e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Liberamente sciacquare fette 2-3x con PBS seguiti da 2-3 risciacqui in PB. Montare le fette su vetrini. Utilizzare un agar distanziale 300 micron per evitare che la fetta di collassare. Fette di Cover-scivolo con una fluoresmezzo di montaggio cento e tenuta con unghie vernice. </li></ol> 8 Imaging e ricostruzione di Visualized FS-Ins <ol><li> Visualizza le fette con un microscopio confocale a scansione, con il giornalista fluorochome eccitato con la linea laser appropriata (diodo laser 635 nm per AlexaFluor-647; Elio-Neon 543 nm per AlexaFluor-546 etichettatura per il fotovoltaico e Argon 488 o 515 nm per Venus / YFP). </li><li> Prendere le immagini a un Z-risoluzione appropriata (tipicamente 0,5-1 micron passi, usando un obiettivo 20X) per produrre una Z-stack di tutta la cellula. Più pile sono normalmente necessari per l&#39;immagine tutta la cella, che può essere digitalmente cucita off-line utilizzando FIJI / software ImageJ (Figura 5A). </li><li> Ricostruire la cella dalla pila immagine cucita utilizzando un metodo di analisi semi-automatica (semplice plugin neuriti Tracer in FIJI / ImageJ pacchetto software 17, Figura C). </li><li> Infine, valutare il PV-immunoreattività della interneuron con una lente obiettivo ad alta apertura numerica (60X silicio-immersion, NA = 1.3). Rendere le immagini del soma, dendriti prossimali e assoni prossimale, o in alternativa di terminali assoni se washout somatica del fotovoltaico è troppo forte. Le cellule sono considerati immunoreattive per PV se immuno-etichettatura è visto ad allineare con le strutture biocitina marcati (Figura 5B). </li></ol>

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<li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit%2C+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic%2C+basket%2C+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Descriviamo un metodo che combina tecniche elettrofisiologiche e neuroanatomiche caratterizzare funzionalmente i neuroni morphologically- e neurochimico-identificati in vitro; in particolare i diversi tipi di INs inibitorie corticali. Gli aspetti principali della procedura sono: (1) pre-selezione dei potenziali INs; (2) la registrazione intracellulare e la visualizzazione dei neuroni; e infine (3) analisi morfologica e immunocitochimica di INs registrati. Sebbene questo studio ha affrontato PV-in in particolare, il prot...

Circuiti neuronali ippocampali sono da tempo oggetto di intenso esame, per quanto riguarda sia l&#39;anatomia e la fisiologia, a causa del loro ruolo essenziale nell&#39;apprendimento e nella memoria, così come la navigazione spaziale in entrambi gli esseri umani e roditori. Analogamente, l&#39;organizzazione laminare prominente, ma semplice dell&#39;ippocampo rende questa regione un soggetto privilegiato di studi che riguardano proprietà strutturali e funzionali di reti corticali. Circuiti dell&#39;ippocampo sono costituiti da cellule eccitatorie principali (&gt; 80%) e una più piccola (10-20%), ma altamente diversificata coorte di interneuroni inibitori 1-3. Interneuroni liberano acido γ-aminobutirrico (GABA) dai loro terminali assoni che agisce a ionotropici veloce recettori GABA A (GABA A Rs) e lenti metabotropici GABA B recettori GABA B (Rs) 4. Questi meccanismi inibitori controbilanciano di eccitazione e regolano l&#39;eccitabilità delle cellule principali, e quindi latempi ir e modello di scarico. Tuttavia, GABA rilasciato da interneuroni agisce non solo sulle cellule principali, ma anche sugli stessi interneuroni 5,6. Recettori pre e post-sinaptici mediano di regolazione di ritorno e inibitori delle interazioni reciproche tra i vari tipi di interneuroni. Questi meccanismi inibitori nelle reti interneuroni sono ritenuti essere centrale per la generazione e la sagomatura di modelli di attività della popolazione, in particolare le oscillazioni a frequenze diverse 7. Whole-cell patch-clamp registrazione è un metodo consolidato per l&#39;esame delle proprietà intrinseche e delle interazioni sinaptiche dei neuroni. Tuttavia, a causa della elevata diversità di tipi di interneuroni, ricerca di interneuroni inibitori richiede rigorosa identificazione delle cellule registrate. Come tipi di interneuroni dell&#39;ippocampo sono caratterizzati da elementi particolari morfologici e l&#39;espressione marcatore neurochimico, anatomico combinata e immunocitochimica eSAME può fornire un mezzo per determinare l&#39;identità precisa 6,8,9 interneuroni. Nel presente lavoro si descrive un approccio sperimentale in cui whole-cell patch-clamp da neuroni singoli o coppie sinapticamente-accoppiati sono combinati con etichettatura intracellulare, seguito dal post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica, permettendo la caratterizzazione di lenta GABA B recettore mediata effetti inibitori di interneuroni identificati. Come esempio, ci concentriamo su uno dei principali tipi di interneuroni, un sottoinsieme dei cosiddetti &quot;cellule canestro&quot; (BC), che innerva il soma e dendriti prossimali dei suoi obiettivi post-sinaptici ed è caratterizzata da un &quot;spike veloce&quot; (FS) scarico modello, un assone densamente che copre lo strato corpo cellulare, e l&#39;espressione della proteina legante il calcio parvalbumina (PV) 10,11. Questi interneuroni mostrano grandi correnti inibitorie post-sinaptiche, così come pre prominentemodulazione sinaptica della loro produzione sinaptica, in risposta al GABA B R di attivazione 12. La combinazione delle tecniche descritte qui può essere applicato altrettanto bene di indagare i meccanismi intrinseci o sinaptici in una varietà di altri tipi di neuroni identificati.

<table><tbody><tr><td>Ratti transgenici vGAT-venus</td><td></td><td></td><td>vedi Uematsu , &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>Occhiali per Venus (515 nm)</td><td>BLS Ltd., Ungheria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti da dissezione</td><td>&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>Per l'asportazione del cervello</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>O un altro vibratomo di fascia alta con oscillazione verticale minima</td></tr><tr><td>Camere di mantenimento per fette</td><td></td><td></td><td>Realizzate su misura in laboratorio</td></tr><tr><td>Microscopio verticale IR-DIC</td><td>Olympus, Giappone</td><td>BX50WI</td><td>Con sistema micromanipolatore; &lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; Luigs and Neumann, Kleindiek &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Telecamera CCD</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>Sistema LED a 505 nm</td><td>Cairn Research</td><td>OptiLED system</td><td>O lampada a mercurio o altro sistema LED &lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; CooLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>In alternativa 2 amplificatori Axopatch 200B&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Software di acquisizione WinWCP</td><td>John Dempster, Strathclyde University</td><td></td><td>Si può usare qualsiasi software di acquisizione di qualità, &lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; EPHUS, pClamp, Igor ecc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tiratore di elettrodi</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>Usato con filamento a scatola</td></tr><tr><td>Vetro per pipette borosilicato</td><td>Hilgenberg, Germania</td><td>1405020</td><td>2 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno, senza filamento</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>Altre pompe o alimentazione a gravità possono essere usate al posto</td></tr><tr><td>Termometro digitale</td><td></td><td></td><td>Realizzato su misura</td></tr><tr><td>Manometro digitale</td><td>Supertech, Ungheria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; target=&quot;_blank">Stimolatore isolato a tensione costante&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; target=&quot;_blank">DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Biocitina</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>Altrimenti nota come &amp;epsilon;-Biotinoyl-L-Lysine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DL-AP5(V) sale disodico</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>DNQX sale disodico</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120169</td><td>In alternativa NBQX o CNQX</td></tr><tr><td>Gabazina (SR95531)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120042</td><td>In alternativa bicucullina metiodide</td></tr><tr><td>R-Baclofen</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>CGP-55,845 cloridrato</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-PV da topo</td><td>Swant, Svizzera</td><td>235</td><td>Concentrazione di lavoro 1:5.000-1:10.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>Se si utilizza un roditore Venus o GFP, è consigliabile usare un canale rosso (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; 546 nm).</td></tr><tr><td>Siero normale di capra</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopia</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi marca di alta qualità</td></tr><tr><td>Coverslip di vetro</td><td></td><td></td><td>Di solito 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>Spaziatori in agar</td><td></td><td></td><td>Blocco di agar tagliato al vibratomo a 300 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Olympus, Giappone</td><td>Fluoview FV1000</td><td>O un altro sistema comparabile</td></tr><tr><td>Fiji (Fiji è semplicemente ImageJ)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>Vedi Schindelin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

whole-cell patch-clamp registrazioni da morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Interneuroni inibitori GABAergici svolgono un ruolo centrale nei circuiti neuronali del cervello. Interneuroni comprendono un piccolo sottoinsieme della popolazione neuronale (10-20%), ma mostrano un elevato livello di eterogeneità fisiologica, morfologica, e neurochimici, che riflettono le loro diverse funzioni. Pertanto, l&#39;indagine di interneuroni fornisce importanti informazioni ai principi di organizzazione e funzionamento dei circuiti neuronali. Ciò, tuttavia, richiede un approccio fisiologico e neuroanatomica integrato per la selezione e l&#39;identificazione dei tipi di interneuroni individuali. Whole-cell patch-clamp registrazione da acuta fettine di cervello di animali transgenici, che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto i promotori di marcatori specifici di interneuroni, fornisce un metodo efficace per individuare e caratterizzare elettrofisiologicamente proprietà intrinseche e sinaptiche di tipi di interneuroni specifici. Combinato con etichettatura colorante intracellulare, questo approccio può essere esteso con il post-hoc moanalisi rphological e immunocitochimica, consentendo l&#39;identificazione sistematica dei neuroni registrati. Questi metodi possono essere personalizzati per soddisfare una vasta gamma di questioni scientifiche riguardanti le proprietà funzionali dei diversi tipi di neuroni corticali.

A condizione che la qualità fetta è sensibilmente buona, la registrazione da entrambi CA1 PC e FS-in possono essere raggiunti con difficoltà minima. La linea di topo transgenico che esprime Venere / YFP sotto il promotore vGAT 13 non identifica inequivocabilmente FS-in, o anzi jacket. Tuttavia registrazioni da INs in ed intorno a str. piramidale, dove la densità di FS-in è in genere alta 1, si traduce in una elevata probabilità di selezionare FS-in (Figura 2B). FS-in posso...

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l&#39;identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare gli effetti mediati dai recettori GABA B in interneuroni ippocampali positivi per la parvalbumina. Questo viene ottenuto innanzitutto producendo fette ippocampali acute di alta qualità. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare un microscopio video per selezionare i neuroni in base all'espressione venosa di YFP e alle caratteristiche note degli interneuroni positivi per la parvalbumina.In seguito vengono effettuate registrazioni con tecnica del patch clamp su cellule intere e si utilizza o una stimolazione extracellulare o registrazioni accoppiate per esaminare gli effetti mediati dai recettori GABA B. L'ultimo passaggio consiste nel visualizzare i neuroni e nel confermare che i neuroni registrati siano effettivamente positivi per l'albumina parva e che si tratti di neuroni inibitori para-somatici o dendritici. In definitiva, questo metodo permette la caratterizzazione degli effetti inibitori mediati dai recettori GABA B e consente una classificazione inequivocabile degli interneuroni registrati.Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo dei neuroni intercalari. Ad esempio, come i neuroni intercalari c

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Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo protocollo descrive una tecnica chiamata elettrofisiologia del patch clamp a cellula intera, che è un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni di Mauthner e di altre cellule reticolospinali negli embrioni di zebrafish.

Elettrofisiologia del Patch Clamp a cellula intera: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

Questo video mostra una tecnica per la registrazione patch-clamp dalla superficie della membrana dendritica. Questo aiuta a esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e dei canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti nei neuroni dopaminergici.

Registrazioni Patch-Clamp dal dendrite di un neurone dopaminergico in una fetta di cervello

Il video dimostra un protocollo per studiare le interazioni sinaptiche e le risposte neuronali in una fetta di cervello ippocampale di topo trasfettata. Consiste nell'illuminare i neuroni sensoriali a lungo raggio per innescare i potenziali d'azione e nel registrare i potenziali eccitatori post-sinaptici risultanti nel neurone registrato utilizzando la tecnica del patch-clamp a cellula intera.

Fotostimolazione e registrazioni di patch clamp a cellule intere di neuroni in fette di ippocampo di topo

Questo video mostra la procedura per eseguire registrazioni elettrofisiologiche nei neuroni della substantia gelatinosa (SG) di fette di midollo spinale, utilizzando tecniche di patch-clamp a cellula intera per analizzare i modelli di attivazione dei neuroni. Questo metodo consente lo studio delle risposte neurali agli stimoli nei neuroni SG del midollo spinale.

Registrazione del patch clamp a cellula intera in un neurone di substantia gelatinosa di una fetta di midollo spinale

Questo video mostra la procedura per mappare le connessioni sinaptiche fissando una fetta di cervello, posizionando pipette per ottenere configurazioni di cellule intere e stimolando i neuroni presinaptici a registrare le risposte postsinaptiche, chiarendo così la connettività neuronale.

Registrazione accoppiata con patch clamp delle connessioni neuronali in fette cerebrali acute

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Le registrazioni di coppia sono registrazioni simultanee di patch clamp di intere cellule da due neuroni collegati sinapticamente, che consentono una precisa caratterizzazione elettrofisiologica e farmacologica delle sinapsi tra i singoli neuroni. Qui descriviamo la metodologia dettagliata e i requisiti per stabilire questa tecnica in colture organotipiche di fette di ippocampo in qualsiasi laboratorio attrezzato per l'elettrofisiologia.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Le registrazioni di patch-clamp e il riempimento simultaneo di biocitina intracellulare di neuroni accoppiati sinapticamente in fette cerebrali acute consentono un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere le fasi tecniche essenziali della registrazione elettrofisiologica da microcircuiti neuronali e la loro successiva analisi morfologica.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l'esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Le registrazioni subcellulari di patch-clamp offrono la possibilità di studiare le proprietà funzionali dei dendriti. Tuttavia, queste strutture fini non sono facilmente accessibili a causa del loro piccolo diametro. Il protocollo qui descritto mira a facilitare la raccolta di registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici in fette in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Il presente protocollo descrive come isolare e purificare la microglia ippocampale primaria da topi adulti, seguito da istruzioni per condurre registrazioni di patch-clamp su cellule intere su queste cellule isolate acutamente.

Isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti

Impara la registrazione patch-clamp whole-cell da interneuroni dell'ippocampo identificati morfologicamente e neurochimicamente. Questo metodo permette di caratterizzare gli effetti mediati dai recettori GABA B nei circuiti inibitori.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell'ippocampo

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