Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza per l'isolamento delle popolazioni cellulari Scleractiniane
31 maggio 2020
I coralli creano ecosistemi di biodiversità importanti sia per l'uomo che per gli organismi marini. Tuttavia, ancora non comprendiamo il pieno potenziale e la funzione di molte cellule coralline. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato per l'isolamento, l'etichettatura e la separazione delle popolazioni di cellule coralline rocciose.
Questo protocollo facilita l'identificazione e l'isolamento delle popolazioni di cellule coralline vive a un livello di descrizione non precedentemente possibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'accesso a un livello di specificità cellulare che fino ad ora è stato per lo più irraggiungibile. A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Shannon Saigh, un'associazione di ricerca della risorsa condivisa di citometria a flusso presso il Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Per impostare il citometro di flusso per l'ordinamento delle celle di corallo vive, aprire un nuovo modello di progetto nel software del citometro a flusso e selezionare i laser appropriati per l'analisi nel pannello laser. Quindi, create un grafico a dispersione laterale rispetto a quello forward nei grafici appropriati per impostare la strategia di gating e analisi. Per l'analisi citometrica del flusso e lo smistamento delle cellule coralline vive, caricare il campione di cellule non contaminate di controllo nella camera campione del citometro e avviare il processo di lettura.
Poiché le cellule coralline sono particolarmente fragili, mantenere bassa la pressione del citometro per prevenire la llisi cellulare. Nel grafico a dispersione, regolare la tensione del moltiplicatore di foto per centrare i punti e iniziare a registrare gli eventi. Nel grafico a dispersione avanti contro laterale, create un gate attorno alle celle intorno al 10-4° segno sull'asse x a dispersione in avanti.
Sostituire l'esempio di controllo con il primo campione di celle macchiate e registrare circa 10.000 celle prima di fermarsi. Quindi eseguire il gate degli eventi univoci per il gruppo di campioni macchiato. Per ordinare le cellule coralline vive, dopo aver selezionato la popolazione cellulare di interesse nel software del citometro di flusso, posizionare un tubo di microcentrifugo contenente da 250 a 500 microlitri della soluzione di raccolta appropriata nella camera di raccolta del citometro per ogni popolazione da ordinare.
Una volta che è passata una quantità appropriata di tempo per eliminare i detriti, inizia a ordinare la popolazione desiderata da raccogliere ovunque da 10.000 a diversi milioni di cellule. Ogni volta che viene utilizzata una nuova macchia, specie o cernita, ordinare almeno 20.000 cellule di interesse in 500 microlitri di mezzo di colorazione per consentire l'esecuzione di un controllo di purezza sulla popolazione di interesse e rianalizzare le celle ordinate per confermare che gli eventi vengono letti all'interno del cancello utilizzato per lo smistamento iniziale. Per gli studi in vitro, conservare le cellule ordinate sul ghiaccio fino a quando non vengono trasferite in un'incubatrice o in un ambiente sterilizzato.
Per introdurre altre particelle non cellulari che non condividono la stessa forma o granularità delle cellule coralline, è possibile rimuovere dall'analisi creando una selezione di gate su un grafico a dispersione avanti e laterale. Le cellule morte possono essere escluse confrontando il segnale DAPI delle sospensioni cellulari non macchiate e macchiate usando un istogramma e snodiando le cellule ad alta esprimezione DAPI. In parallelo, le cellule che ospitano la simbiodeneasia dell'autofluorescenza possono essere rimosse sgando contro le cellule con il segnale alto nel canale rosso lontano.
Dopo questo processo di gating iterativo, le cellule rimanenti rappresentano le popolazioni intatte di cellule coralline vive prive di simbiodeneasia. Queste cellule possono quindi essere classificate in sottopopolazioni cellulari diverse macchiando caratteristiche quali l'attività reattiva delle specie di ossigeno e/o il contenuto di lisosomio. È fondamentale ricordare che alcune cellule sono più fragili di altre ed eseguire questo processo con la massima attenzione possibile.
Una volta isolate, cellule specifiche possono essere utilizzate per saggi funzionali x-vivo come la creazione di colture cellulari e la creazione di profili trascritomici.
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Panoramica
Questo studio affronta la necessità di una migliore comprensione delle cellule coralline, che sono cruciali per la biodiversità negli ecosistemi marini. Gli autori presentano un protocollo innovativo per l'isolamento e l'etichettatura di popolazioni cellulari di coralli scleractiniani, ottenendo un livello senza precedenti di specificità cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia dei coralli
- Tecniche di isolamento cellulare
- Biodiversità degli ecosistemi
Sfondo
- I coralli formano ecosistemi essenziali per la vita marina.
- Le conoscenze attuali sulle funzioni cellulari dei coralli sono limitate.
- L'isolamento di popolazioni cellulari coralline specifiche è fondamentale per ulteriori ricerche.
Metodi Utilizzati
- Citometria a flusso per la selezione di cellule vive
- Corallo calcareo come organismo modello
- Strategia di gating per l'identificazione e l'isolamento di tipi cellulari specifici
Risultati principali
- Il protocollo permette l'identificazione e il sorting di popolazioni cellulari vive di corallo.
- Garantisce la purezza e la vitalità delle cellule ordinate per analisi future.
- Facilita lo studio delle sottopopolazioni e delle loro funzioni.
Conclusioni
- Lo studio presenta un metodo affidabile per l'isolamento di cellule coralline, migliorando il potenziale della ricerca.
- I risultati forniscono informazioni preziose sulla biologia dei coralli e sulla salute degli ecosistemi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'isolamento di popolazioni cellulari specifiche da tessuti complessi rimane una sfida fondamentale nella validazione precoce dei bersagli e nella riduzione dei rischi meccanicistici. Il sorting cellulare attivato da fluorescenza (FACS) consente un'analisi cellulare ad alta risoluzione, supportando una maggiore affidabilità predittiva nelle risposte specifiche per pathway. Questa capacità è direttamente applicabile ai flussi di lavoro di scoperta nell'industria biofarmaceutica, che richiedono saggi funzionali precisi e il profilo trascrittomico di tipi cellulari rari o fragili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche a risoluzione singola-cellula isolando popolazioni vitali per la validazione funzionale.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità meccanicistica separando le sottopopolazioni cellulari vitali da detriti, cellule morte e segnali associati a simbionti.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli generando input purificati per saggi successivi che chiariscono l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce sospensioni cellulari standardizzate e vitali, adatte a saggi funzionali riproducibili e alla profilazione dose-risposta.
- Valore operativo: Stabilisce strategie di selezione che garantiscono la prontezza del saggio e riducono al minimo la variabilità tra le diverse prove sperimentali.
- Scalabilità: Permette la raccolta di un numero sufficiente di cellule (da 10.000 a diversi milioni) per screening in piastre multipozzetto e applicazioni omiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica consentendo l'isolamento coerente di popolazioni cellulari rilevanti per la malattia, per successivi approfondimenti meccanicistici.
- Allineamento dei Biomarcatori: Permette la colorazione per marcatori della risposta allo stress (ad esempio, specie reattive dell'ossigeno, contenuto dei lisosomi) al fine di correlare i fenotipi cellulari con esiti funzionali.
- Progressione Basata sul Rischio: Le popolazioni purificate migliorano l'affidabilità dei dati nei modelli preclinici, riducendo i falsi positivi derivanti da campioni eterogenei.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La FACS si integra nel percorso di scoperta, dal test dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto guida e alla validazione preclinica, consentendo input cellulari precisi a ogni fase.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi isolando popolazioni cellulari vive di corallo (o sistemi cellulari analoghi nei mammiferi) per l’analisi funzionale specifica di singoli percorsi biologici.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari standardizzate e selezionate che migliorano la riproducibilità dei saggi e l'affidabilità delle misurazioni quantitative.
- Analisi: Genera campioni ad alta purezza che permettono un accurato profiling transcriptomico, proteomico o metabolico al fine di confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase iniziale della scoperta alla validazione preclinica attraverso la preparazione costante di sottoinsiemi cellulari vitali e sensibili allo stress.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile in diversi progetti che richiedono risoluzione subcellulare, indipendentemente dal sistema modello impiegato.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore Scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo il rumore proveniente da cellule non bersaglio e consentendo la riduzione meccanicistica dei rischi associati ai bersagli.
- Valore Operativo: Standardizza la preparazione dei campioni mediante un gating riproducibile, un sorting a bassa pressione e metodi di raccolta che preservano la vitalità cellulare.
- Valore Strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione fornendo dati biologici più puliti e riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate dovuto ad assunzioni errate sui bersagli.
- Impatto sul Portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio grazie a dati specifici per sottopopolazioni affidabili, che informano i criteri di avanzamento.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze specifiche nella configurazione della citometria a flusso, inclusa la selezione del laser, l'ottimizzazione della tensione e il gating nei plot di scattering per cellule fragili.
- È dipendente da strumentazione in grado di effettuare un sorting a bassa pressione e una rilevazione multiparametrica (scattering anterogrado/laterale, canali di fluorescenza).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di marcatura, i mezzi di raccolta e le soglie di gating, al fine di garantire la riproducibilità.
- Deve tenere conto della variabilità della fragilità cellulare tra specie o condizioni diverse, richiedendo un'ottimizzazione iterativa dello stress di taglio e della durata della marcatura.
- È limitato dalla qualità della preparazione del campione; la dissociazione enzimatica o meccanica deve preservare l'integrità dell'epitopo e la vitalità cellulare per un sorting accurato.
