Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza per l'isolamento delle popolazioni cellulari Scleractiniane
May 31st, 2020
I coralli creano ecosistemi di biodiversità importanti sia per l'uomo che per gli organismi marini. Tuttavia, ancora non comprendiamo il pieno potenziale e la funzione di molte cellule coralline. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato per l'isolamento, l'etichettatura e la separazione delle popolazioni di cellule coralline rocciose.
Questo protocollo facilita l'identificazione e l'isolamento delle popolazioni di cellule coralline vive a un livello di descrizione non precedentemente possibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'accesso a un livello di specificità cellulare che fino ad ora è stato per lo più irraggiungibile. A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Shannon Saigh, un'associazione di ricerca della risorsa condivisa di citometria a flusso presso il Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Per impostare il citometro di flusso per l'ordinamento delle celle di corallo vive, aprire un nuovo modello di progetto nel software del citometro a flusso e selezionare i laser appropriati per l'analisi nel pannello laser. Quindi, create un grafico a dispersione laterale rispetto a quello forward nei grafici appropriati per impostare la strategia di gating e analisi. Per l'analisi citometrica del flusso e lo smistamento delle cellule coralline vive, caricare il campione di cellule non contaminate di controllo nella camera campione del citometro e avviare il processo di lettura.
Poiché le cellule coralline sono particolarmente fragili, mantenere bassa la pressione del citometro per prevenire la llisi cellulare. Nel grafico a dispersione, regolare la tensione del moltiplicatore di foto per centrare i punti e iniziare a registrare gli eventi. Nel grafico a dispersione avanti contro laterale, create un gate attorno alle celle intorno al 10-4° segno sull'asse x a dispersione in avanti.
Sostituire l'esempio di controllo con il primo campione di celle macchiate e registrare circa 10.000 celle prima di fermarsi. Quindi eseguire il gate degli eventi univoci per il gruppo di campioni macchiato. Per ordinare le cellule coralline vive, dopo aver selezionato la popolazione cellulare di interesse nel software del citometro di flusso, posizionare un tubo di microcentrifugo contenente da 250 a 500 microlitri della soluzione di raccolta appropriata nella camera di raccolta del citometro per ogni popolazione da ordinare.
Una volta che è passata una quantità appropriata di tempo per eliminare i detriti, inizia a ordinare la popolazione desiderata da raccogliere ovunque da 10.000 a diversi milioni di cellule. Ogni volta che viene utilizzata una nuova macchia, specie o cernita, ordinare almeno 20.000 cellule di interesse in 500 microlitri di mezzo di colorazione per consentire l'esecuzione di un controllo di purezza sulla popolazione di interesse e rianalizzare le celle ordinate per confermare che gli eventi vengono letti all'interno del cancello utilizzato per lo smistamento iniziale. Per gli studi in vitro, conservare le cellule ordinate sul ghiaccio fino a quando non vengono trasferite in un'incubatrice o in un ambiente sterilizzato.
Per introdurre altre particelle non cellulari che non condividono la stessa forma o granularità delle cellule coralline, è possibile rimuovere dall'analisi creando una selezione di gate su un grafico a dispersione avanti e laterale. Le cellule morte possono essere escluse confrontando il segnale DAPI delle sospensioni cellulari non macchiate e macchiate usando un istogramma e snodiando le cellule ad alta esprimezione DAPI. In parallelo, le cellule che ospitano la simbiodeneasia dell'autofluorescenza possono essere rimosse sgando contro le cellule con il segnale alto nel canale rosso lontano.
Dopo questo processo di gating iterativo, le cellule rimanenti rappresentano le popolazioni intatte di cellule coralline vive prive di simbiodeneasia. Queste cellule possono quindi essere classificate in sottopopolazioni cellulari diverse macchiando caratteristiche quali l'attività reattiva delle specie di ossigeno e/o il contenuto di lisosomio. È fondamentale ricordare che alcune cellule sono più fragili di altre ed eseguire questo processo con la massima attenzione possibile.
Una volta isolate, cellule specifiche possono essere utilizzate per saggi funzionali x-vivo come la creazione di colture cellulari e la creazione di profili trascritomici.
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Panoramica
Questo studio affronta la necessità di una migliore comprensione delle cellule dei coralli, che sono cruciali per la biodiversità negli ecosistemi marini. Gli autori presentano un nuovo protocollo per l'isolamento e l'etichettatura delle popolazioni di cellule di corallo pietroso, raggiungendo un livello di specificità cellulare senza precedenti.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Biologia dei coralli
- Tecniche di isolamento cellulare
- Biodiversità dell'ecosistema
Contesto
- I coralli formano ecosistemi essenziali per la vita marina.
- La conoscenza attuale delle funzioni delle cellule coralline è limitata.
- L'isolamento di specifiche popolazioni di cellule coralline è vitale per ulteriori ricerche.
Metodi utilizzati
- Citometria a flusso per il smistamento di cellule vive
- Corallo pietroso come organismo modello
- Strategia di gating per l'identificazione e l'isolamento di tipi cellulari specifici
Principali risultati
- Il protocollo consente l'identificazione e lo smistamento di popolazioni di cellule coralline vive.
- Garantisce purezza e vitalità delle cellule smistate per futuri saggi.
- Facilita lo studio delle subpopolazioni e delle loro funzioni.
Conclusioni
- Lo studio presenta un metodo affidabile per l'isolamento delle cellule coralline, migliorando il potenziale di ricerca.
- I risultati forniscono preziose intuizioni sulla biologia dei coralli e sulla salute dell'ecosistema.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from complex tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and mechanistic de-risking. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables high-resolution cellular interrogation, supporting predictive confidence in pathway-specific responses. This capability is directly applicable to biopharma discovery workflows requiring precise functional assays and transcriptomic profiling of rare or fragile cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution by isolating live populations for functional validation.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating viable cell subpopulations from debris, dead cells, and symbiont-associated signals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating purified inputs for downstream assays that clarify target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for reproducible functional assays and dose-response profiling.
- Operational Value: Establishes gating strategies that ensure assay readiness and minimize variability across experimental runs.
- Scalability: Allows collection of sufficient cell numbers (10,000 to several million) for multi-well screening and omics applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of disease-relevant cell populations for mechanistic follow-up.
- Biomarker Alignment: Facilitates staining for stress-response markers (e.g., reactive oxygen species, lysosome content) to correlate cellular phenotypes with functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Purified populations improve data reliability in preclinical models, reducing false positives from heterogeneous samples.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling precise cellular inputs at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating live coral (or analogous mammalian) cell populations for pathway-specific functional interrogation.
- Screening: Delivers standardized, gated cell populations that enhance assay reproducibility and quantitative readout reliability.
- Analytics: Generates high-purity samples enabling accurate transcriptomic, proteomic, or metabolic profiling to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through consistent preparation of viable, stress-responsive cell subsets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across projects requiring subcellular resolution, independent of model system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing noise from non-target cells and enabling mechanistic de-risking of targets.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible gating, low-pressure sorting, and viability-preserving collection methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner biological data, reducing late-stage failure risk from flawed target assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable subpopulation-specific data that informs advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, including laser selection, voltage optimization, and scatter plot gating for fragile cells.
- Dependent on instrumentation capable of low-pressure sorting and multi-parameter detection (forward/side scatter, fluorescence channels).
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, collection media, and gating thresholds to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cell fragility across species or conditions, requiring iterative optimization of shear stress and staining duration.
- Limited by sample preparation quality; enzymatic or mechanical dissociation must preserve epitope integrity and cell viability for accurate sorting.
