Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare i cambiamenti nello splicing alternativo durante l'EMT. Ciò si ottiene utilizzando un modello EMT inducibile in cui l'espressione della proteina di fusione si attorciglia. Nelle cellule epiteliali mammarie umane le cellule innescano la terapia EMT dopo il trattamento con tamoxifene come seconda fase.

L'espressione delle isoforme di splicing viene analizzata mediante R-T-P-C-R quantitativo utilizzando set di primer isoforma specifici, che rivelano cambiamenti di splicing alternativi a livello di RNA. Successivamente, l'abbondanza di proteine corrispondenti a ciascuna isoforma viene determinata mediante immuno blotting al fine di confermare l'espressione delle isoforme di splicing a livello proteico, si ottengono risultati che mostrano cambiamenti nello splicing alternativo nei geni di interesse durante l'EMT, sulla base di analisi quantitative R-T-P-C-R e immuno blotting, Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello splicing alternativo RN e dell'EMT, come il modo in cui lo splicing alternativo è regolato durante l'EMT e come questa regolazione influisce sull'EMT e sui processi patologici correlati all'EMT. Le implicazioni di questa tecnica sono orientate verso la terapia del cancro perché l'EMT svolge un ruolo importante nel promuovere l'invasione tumorale e le metastasi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla giunzione alternativa durante l'EMT. Il metodo per la rilevazione dell'MRA isoforma specifica può essere applicato anche in altri sistemi, come lo studio dello splicing alternativo nella differenziazione neuronale e il programma di morte cellulare. Il primo passo consiste nel preparare le cellule che esprimono la proteina di fusione twist ER, seminare le cellule in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri in duplicato, quindi preparare e proteggere la luce la soluzione di tamoxifene per indurre la transizione mesenchimale epiteliale o EMT, trattare le cellule con 20 mezzi di comunicazione contenenti tamoxifene nanomolare per un gruppo di controllo non trattato con tamoxifene, aggiungere lo 0,01% di etanolo a un ulteriore set di cellule due giorni dopo l'incubazione.

Scatta foto al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x per registrare eventuali cambiamenti morfologici. Quindi, lavare le celle con PBS freddo. Raschiare le cellule da una metà della piastra nel tampone di lisi dell'RNA per l'isolamento dell'RNA e l'altra metà in 100 microlitri di tampone ripa ghiacciato per l'analisi delle proteine, far passare le cellule di entrambi i gruppi come mostrato in precedenza e trattare continuamente con tamoxifene o veicolo a 20 nanomolari.

Ripetere questi passaggi a giorni alterni fino al giorno 14, momento in cui le cellule ER twist trattate con tamoxifene dovrebbero mostrare una morfologia mesenchimale a forma di fuso. Mentre i controlli trattati con il veicolo dovrebbero mantenere la morfologia epiteliale simile a quella dei ciottoli. Qui un NNA a quattro esoni viene utilizzato come esempio per il rilevamento dell'inclusione dell'esone.

Progettare un primer diretto all'interno dell'esone tre variabile e un primer inverso all'interno del vicino esone costitutivo quattro. Consentire l'amplificazione specifica dell'isoforma inclusa dell'esone variabile per amplificare in modo specifico gli eventi di salto dell'esone. Primer di progettazione che coprono la giunzione dell'esone due e dell'esone quattro costitutivi che altrimenti verrebbero distrutti quando è incluso l'esone tre variabile.

Progettare l'altro primer all'interno dell'esone quattro costitutivo per rilevare i trascritti totali del gene ed evitare prodotti di PCR amplificati dal DNA genomico o prem NA.Design primer all'interno di due esoni costitutivi quando sono pronti. Segue le procedure standard di estrazione dell'RNA per isolare l'RNA dai campioni di cellule raccolti in precedenza. Determinare la concentrazione e la qualità dell'RNA mediante assorbimento UV per sintetizzare il primo filamento CD NA impostare le reazioni di trascrittasi inversa in un volume finale di 20 microlitri.

Eseguire reazioni RT a 42 gradi Celsius per un'ora, seguite da incubazione a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Per inattivare l'enzima RT in tempo reale. La PCR ha impostato reazioni da 20 microlitri che consistono in 10 microlitri di master mix cyber green, da 0,1 a 1,0 microlitri di modello CD NA e cinque primer diretti e inversi di picomoli.

Esegui la PCR in tempo reale con 40 cicli in triplice copia. Controllare le curve di dissociazione e assicurarsi che si osservi un singolo picco per ogni set di primer. Ottenere i valori del ciclo di quantificazione calcolando i valori della derivata seconda delle curve di amplificazione.

Calcolare la quantità relativa di mRNA bersaglio nei campioni indotti rispetto al campione non indotto utilizzando il metodo delta delta CQ, come mostrato da questa formula. Lasciare le cellule raccolte per l'analisi delle proteine su ghiaccio per circa 10 minuti prima di centrifugare e raccogliere il surnatante. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, diluire i campioni nel caricamento SDS, tamponare e caricare da 20 a 40 microgrammi di proteine in gel di pagina SDS al 10%.

Esegui i gel SDS a 20 milliampere per 1,5 ore. Trascorso questo tempo, trasferire le proteine alle membrane PVDF in un sistema di trasferimento umido a quattro gradi Celsius per tre ore a 85 volt. Regolare il tempo di trasferimento in base al peso molecolare delle proteine bersaglio.

Quindi, bloccare la membrana nel latte scremato al 5% per 30 minuti a un'ora. A temperatura ambiente, incubare la membrana con un anticorpo primario a quattro gradi Celsius durante la notte. L'anticorpo primario riconosce l'epitopo nella regione costitutiva del rivestimento dell'esone e rileva simultaneamente le isoforme delle slic in base alle loro diverse dimensioni proteiche.

Allo stesso tempo, monitorare l'EMT mediante immunoblotting. Per marcatori EMT. Utilizzare eec, ahern, gamma catenina e occludina come marcatori epiteliali e fibronectina n caderina e mentone come marcatori mesenchimali.

Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte con TBST a intervalli di cinque minuti. Successivamente, incubare la membrana con un anticorpo secondario coniugato HRP in una diluizione da uno a 10.000 per un'ora a temperatura ambiente. Trascorso questo tempo, lavare la membrana tre volte con TBST a intervalli di cinque minuti.

Infine, visualizzare le proteine con un sistema di rilevamento a chemiluminescenza ed esporre la membrana a una pellicola per autoradiografia. L'EMT indotta da torsione è stata caratterizzata da una transizione da un fenotipo epiteliale simile a un ciottolo a un fenotipo fibroblastico allungato, che mostra l'assenza di marcatori epiteliali, e caderina, gamma catenina e occludina, e la sovraregolazione di marcatori mesenchimali, fibronectina n caderina e vimentina. Inoltre, l'EMT è stata valutata in base alla perdita di localizzazione della caderina EC nelle giunzioni cellulari raffigurate.

Ecco i disegni dei primer per la rilevazione delle isoforme di splicing CD 44. Le posizioni dell'innesco sono indicate dalle frecce di colore diverso. I risultati delle analisi Q-R-T-P-C-R indicano una significativa diminuzione dell'mRNA di CD 44 V e un aumento dell'mRNA di CD 44 s dopo 14 giorni di trattamento con TAM.

Al contrario, il trascritto totale di CD 44 è rimasto invariato durante l'EMT coerentemente con i risultati di Q-R-T-P-C-R, il livello proteico di CD 44 V è diminuito notevolmente, mentre l'espressione della proteina CD 44 è stata notevolmente sovraregolata durante questa procedura. È importante ricordare che il successo dell'induzione dell'otorinolaringoiatria è molto cruciale. Pertanto, l'otorinolaringoiatria deve essere accuratamente confermata con vari metodi, come il rilevamento di cambiamenti nella morfologia cellulare, l'espressione dei marcatori ORL e la localizzazione di RIN sulla superficie cellulare.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il saggio di gestione del reporter di splicing per rispondere a ulteriori domande come, in che modo questi elementi agenti e i fattori di transazione influenzano la regolazione alternativa dello splicing dopo il suo sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA, della biologia dello sviluppo e della biologia del cancro per esplorare la regolazione alternativa dello splicing nei processi EMT durante il normale sviluppo e le metastasi del cancro.