Name: Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Scopri come rilevare lo splicing alternativo durante la transizione epitelio-mesenchimale utilizzando un modello EMT inducibile con cellule epiteliali mammarie umane. Questo metodo combina qRT-PCR e immunoblotting per analizzare le modifiche degli isoformi.

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Gli autori desiderano ringraziare Wensheng Liu per l'inestimabile aiuto con l'imaging cellulare. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01 CA182467), dell'American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), della Lynn Sage Foundation e della A Sister's Hope Foundation.

1 Cella Cultura della EMT induzione Nota: EMT può essere indotta da trattamenti di TGFβ o espressione ectopica di fattori di trascrizione Twist, Chiocciola, o Zeb1 / 2 in cellule epiteliali. Descritto in questo protocollo è un sistema EMT inducibile mediante espressione della proteina di fusione Twist-ER in cellule immortalizzate umane epiteliali mammarie (HMLE / Twist-ER, un dono di Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Al 4-hydroxytamoxifen (TAM) il trattamento, la proteina di fusione Twist-ER trasloca nel nucleo di guidare la trascrizione e risultati in una transizione completa EMT in 12-14 giorni 9,11,29. Altri sistemi inducibili EMT, come HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFβ, e MCF10A / TGFβ, si possono trovare nelle nostre precedenti pubblicazioni 11,30. <ol><li> Mantenere le cellule HMLE / Twist-ER in mammaria mezzo di crescita delle cellule epiteliali privo di siero (MEGM) in un incubatore a 37 ° C con il 5% di CO 2. Passage le cellule ogni 2-3 giorni quando raggiungono l'80% di confluenza. Incubare le cellule con tripsina 0,15% a 37 ° C per 5-10 minuti, quindi inattivare la tripsina con siero di vitello al 5% / DMEM. Spin le cellule e risospendere in MEGM. Cellule portapiatti in un nuovo piatto di coltura tissutale con un rapporto di 1 a 4. </li><li> Sciogliere TAM in etanolo per ottenere una soluzione 200 mM. Proteggere TAM dalla luce e conservare a -20 ° C. Prima dell'uso, appena aggiungere TAM in MEGM materie ad una diluizione 1: 10.000 per effettuare una concentrazione finale di 20 nM TAM. </li><li> Per l'induzione di EMT, piastra cellule 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti in duplice copia. Celle di coltura con 20 supporti nM TAM-contenenti MEGM. </li><li> Piatto cellule 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER in un piatto di 10 centimetri in duplice copia e il trattamento di cellule con 0,01% di etanolo come controllo non-TAM-trattati. </li><li> Due giorni dopo l'incubazione, scattare foto sotto un microscopio ottico a 10X di ingrandimento per registrare cambiamenti morfologici delle cellule. </li><li> Aspirare il mezzo da un piatto di controllo o di TAM-trattaticellule. Lavare le cellule con PBS freddo e celle raccolto da demolizione metà della piastra in tampone di lisi RNA per l'isolamento dell'RNA e l'altra metà in tampone RIPA per l'analisi di proteine. </li><li> Cellule passaggio dal controllo o piatti TAM-trattati con 1,6 x 10 6 cellule ri-placcatura in un piatto di 10 centimetri in duplice copia. Continuamente trattare le cellule con 20 nM TAM o di un veicolo. </li><li> Ripetere i passaggi da 5 a 7 una volta ogni due giorni fino al giorno 14, in cui il tempo, le cellule Twist-ER TAM-trattati mostrano una mesenchimale morfologia fusiforme, mentre le cellule di controllo del veicolo trattate mantengono la morfologia epiteliale ciottoli-like. </li></ol> 2 Caratterizzazione di EMT Nota: A completamento della EMT è indicato da: (1) cambiamenti morfologici delle cellule da una morfologia epiteliale ciottoli come a un aspetto fibroblastica-come a forma di fuso; (2) Perdita di localizzazione E-caderina a giunzioni cellula-cellula; e (3) L'espressione commutazione di marcatori EMT, definito dalla perditadi marcatori epiteliali e aumento dei marcatori mesenchimali. Cellulari cambiamenti morfologici vengono acquisite da microscopio ottico a 10X di ingrandimento nel corso del tempo di induzione EMT, descritto nella Sezione 1 Immuno-fluorescenza rilevamento di E-caderina in cellule-giunzioni è descritto in questa sezione. L'espressione di markers di EMT viene rilevato mediante immunoblotting. Marcatori epiteliali comuni sono E-caderina, γ-catenina, e occludina, e marcatori mesenchimali includono fibronectina, N-caderina e vimentina. Procedure generali di immunoblotting sono descritti nella sezione 4. <ol><li> Al giorno 12 del trattamento TAM, semi di 1 x 10 5 cellule su un vetro coprioggetti circolare 12 millimetri disposte in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. </li><li> 48 ore dopo che le cellule di semina, medie Aspirare e lavare con pre-riscaldato PBS. </li><li> Fissare le cellule con pre-riscaldato paraformaldeide 4% per 15 min. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS. </li><li> Incubare le cellule con 0,2% Triton X-100 in PBS per 15minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS. </li><li> Incubare le cellule a 5% BSA / PBS per 1 ora a temperatura ambiente per bloccare legame non specifico. </li><li> Incubare le cellule con l'anticorpo E-caderina primario in una diluizione 1:50 in 1% BSA / PBS in una camera di umidificata O / N a 4 ° C. NOTA: L'intervallo per la diluizione anticorpo primario è normalmente compreso tra 1:50 e 1: 200, e la diluizione ottimale per ogni anticorpo deve essere determinato sperimentalmente. </li><li> Decantare l'anticorpo primario e lavare le cellule tre volte con PBS. </li><li> Incubare le cellule con l'anticorpo secondario fluorescente marcato in una diluizione 1: 500 per 1 ora a temperatura ambiente. Da questo punto in poi, proteggere le cellule dalla luce. </li><li> Decantare l'anticorpo secondario e lavare tre volte con PBS. </li><li> Cellule macchia con 0,1-1 g / ml DAPI o Hoechst per 10 min. </li><li> Lavare le cellule con PBS per tre volte. </li><li> Montare coprioggetto con una goccia di mezzo di montaggio, e coprioggetto tenuta con smalto. </li><li> Osservare le cellule e prendereimmagini sotto un microscopio a fluorescenza 63X. </li></ol> Colorazione con anticorpi supplementari può essere eseguita per confermare il fenotipo EMT. Ad esempio, N-caderina e α-actina del muscolo liscio possono essere colorati per un fenotipo mesenchimale 29,31,32. Riorganizzazione della struttura del citoscheletro può essere monitorato mediante colorazione delle cellule con falloidina per la F-actina 11. Inoltre, saggi di motilità cellulare e la resistenza delle cellule morte possono essere eseguite per esaminare le proprietà del EMT 11. 3 Rilevamento di Splice Isoforme Utilizzo qRT-PCR saggi <ol><li> Disegno Primer NOTA: Le coppie di primer deve essere accuratamente studiato per amplificare isoforme di splicing distinti. Exon skipping, l'evento splicing alternativo più comunemente osservato, è illustrata qui come esempio per illustrare la strategia di progettazione di primer. Figura 1A mostra una quattro esone pre-mRNA, con il terzo esone come esone variabile. L'inclusione dell'esone 3 risultati inla produzione di un giunto isoforma più lunga, mentre skipping dell'esone 3 genera una giuntura isoforma più corta. I primer devono essere progettati per distinguere l'isoforma esone-3-incluso e esone-3-saltato isoforma, e per rilevare la trascrizione completa della mRNA. <ol><li> Per il rilevamento di inclusione dell'esone, progettare con cura un primer in avanti all'interno della variabile esone 3, e un primer reverse all'interno della vicina esone costitutiva 4, permettendo l'amplificazione specifica della variabile isoforma esone-incluso. Assicurarsi di non progettare sia in avanti e reverse primer all'interno dello stesso esone variabile al fine di evitare i prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA genomico o pre-mRNA. </li><li> Per amplificare specificamente esone eventi saltare, di design uno dei primer che abbracciano la giunzione dell'esone costitutiva 2 e esone 4 che altrimenti sarebbe distrutto quando esone variabile 3 è incluso. Progettare l'altro fondo all'interno del esone costitutiva 4 Come tale, i prodotti di PCR vengono generati solo quando la variabile esone 3 è excluded e la costitutiva esone 2 e l'esone 4 sono successivamente uniti. </li><li> Per rilevare le trascrizioni totali del gene, disegnare i primer entro due esoni costitutivi 1 e 2 Pertanto, i prodotti di PCR sono amplificati da tutte le isoforme. </li><li> Assicurarsi che la temperatura di fusione (Tm) per tutti i primer è di circa 55 ° C, la lunghezza di ogni primer è di circa 18-22 nucleotidi, e la dimensione dei prodotti di PCR è compresa tra 80 e 150 paia di basi. </li></ol></li><li> Estrazione di RNA: RNA estratto utilizzando un kit di totale isolamento di RNA (vedi tabella dei Materiali). <ol><li> Raccogliere le cellule in 350 microlitri di buffer di lisi RNA. </li><li> Aggiungere 350 ml di etanolo al 70% al lisato e mescolare accuratamente. </li><li> Trasferire il campione alla colonna di purificazione dell'RNA. </li><li> Centrifugare a 10.000 xg per 1 min e scarto flow-through. </li><li> Lavare la colonna una volta con 500 ml di RNA di lavaggio buffer di I e due volte con RNA tampone di lavaggio II. </li><li> Rimuovere il tampone di lavaggio RNA residuoII dalla colonna mediante centrifugazione a velocità massima per 2 min. </li><li> Trasferire la colonna in una nuova provetta da 1,5 ml, aggiungere acqua priva di nucleasi 50 microlitri al centro della matrice colonna ed eluire l'RNA per centrifugazione a velocità massima. </li></ol></li><li> Sintesi di cDNA First-strand <ol><li> Determinare la concentrazione e la qualità di RNA con la misura di assorbimento UV. NOTA: Buona RNA qualità dovrebbe avere un / 280 nm rapporto di assorbanza 260 nm di circa 2.0. </li><li> Impostare trascrittasi inversa (RT) reazioni che contengono 250 ng di RNA totale, 0,05 mg primer esameriche casuale, 50 pmol MgCl 2, 10 pmol dNTP, 2 microlitri di buffer 5 × GoScript, e 1 ml RT enzima in un volume finale di 20 ml. </li><li> Eseguire reazioni RT a 42 ° C per 1 ora, seguito da incubazione a 70 ° C per 5 minuti per inattivare l'enzima RT. </li></ol></li><li> Real-time PCR <ol><li> Impostare 20 microlitri reazioni che consistono di 10 microlitri SYBR master mix verde,0.1-1.0 modello cDNA microlitri, e 5 pmol avanti e indietro primer. </li><li> Eseguire PCR in tempo reale con 40 cicli dei seguenti passi: 95 ° C denaturazione per 10 sec, 58 ° C ricottura per 10 sec e 60 ° C per 30 sec estensione. Eseguire reazioni PCR in triplice copia. </li><li> Controllare le curve di dissociazione e fare in modo che un singolo picco si osserva per ogni set di primer. </li><li> Ottenere i valori di ciclo di quantificazione (Cq) calcolando i secondi valori derivati ​​curve di amplificazione. </li><li> Calcolare la quantità relativa (RQ) del mRNA bersaglio in campioni indotto, rispetto al campione uninduced utilizzando il 'delta delta Cq (ΔΔCq)' metodo come mostrato dalla seguente formula. Utilizzare geni housekeeping, come GAPDH o TBP, come riferimento. </li></ol></li></ol><img alt="Equazione 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg"> Per calcolare con maggiore precisione i valori relativi delle isoforme di splicing, tegli usa di più geni di riferimento dovrebbe essere considerato. I risultati possono essere analizzati utilizzando un metodo di quantificazione del valore assoluto modificato descritto da Pfaffl et al 33,34. 4 Esame di Splice Isoforme a livello proteico <ol><li> Raccogliere le cellule in 100 microlitri di buffer RIPA ghiacciato. </li><li> Impostare lisati su ghiaccio per circa 10 min. </li><li> Centrifugare a 14000 g per 10 min a 4 ° C, e raccogliere il surnatante. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​mediante saggi Bradford. </li><li> Diluire i campioni di proteine ​​in tampone di caricamento SDS e caricare 20-40 mg di proteine ​​in gel 10% SDS-PAGE. </li><li> Eseguire gel SDS-PAGE a 20 mA per 1.5 ore. </li><li> Trasferimento proteine ​​di membrane PVDF in un sistema di trasferimento umida a 4 ° C per 3 ore a 85 V. Regolare il tempo di trasferimento secondo il peso molecolare delle proteine ​​bersaglio. </li><li> Membrana blocco in 5% di latte senza grassi per 30 minuti a 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la membrana with un anticorpo primario a 4 ° CO / N. La gamma di diluizione anticorpo primario è normalmente compresa tra 1: 200 e 1: 5.000, determinare la diluizione ottimale per ciascun anticorpo sperimentalmente. La diluizione di anticorpi utilizzati in questo protocollo può essere trovato in "Tabella di reagenti e attrezzature specifiche". <ol><li> Per rilevare isoforme di splicing, utilizzare anticorpi specifici che riconoscono una particolare isoforma. In alternativa, utilizzare un anticorpo che riconosce l'epitopo nella costitutiva esone regione codificante e rilevare le isoforme di splicing simultaneamente in base alle loro dimensioni diverse proteine. </li><li> Allo stesso tempo, monitorare EMT mediante immunoblotting per i marcatori di EMT. Utilizzare E-caderina, γ-catenina, e occludina come marcatori epiteliali, e fibronectina, N-caderina e vimentina come marcatori mesenchimali. </li></ol></li><li> Membrana Lavare tre volte con TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7.4) in un intervallo di 5 min. </li><li> Incubare la membrana con una formica secondario HRP-coniugatoiBody in una diluizione 1: 10.000 per 1 ora a RT. </li><li> Membrana Lavare tre volte con TBS-T in un intervallo di 5 min. </li><li> Visualizzare proteina con un sistema di rilevazione chemiluminescenza ed esporre la membrana di un film autoradiografia. </li></ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Sleeman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+networks+orchestrate+epithelial-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).</li>
<li>Yang, J., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev Cell. 14, 818-829 (2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+master+regulator+of+morphogenesis%2C+plays+an+essential+role+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.</a> Cell. 117, 927-939 (2004).</li>
<li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).</li>
<li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).</li>
<li>Comijn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-handed+E+box+binding+zinc+finger+protein+SIP1+downregulates+E-cadherin+and+induces+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion.</a> Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).</li>
<li>Bolos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions%3A+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).</li>
<li>Eger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeltaEF1+is+a+transcriptional+repressor+of+E-cadherin+and+regulates+epithelial+plasticity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).</li>
<li>Shapiro, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-driven+alternative+splicing+program+occurs+in+human+breast+cancer+and+modulates+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype.</a> PLoS Genet. 7, e1002218(2011).</li>
<li>Warzecha, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ESRP-regulated+splicing+programme+is+abrogated+during+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition.</a> EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).</li>
<li>Brown, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+splice+isoform+switching+in+human+and+mouse+epithelium+is+essential+for+epithelial-mesenchymal+transition+and+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+RNA+splicing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).</li>
<li>Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+RNAs+transcribed+from+the+human+abl+gene+and+from+the+bcr-abl+fused+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene.</a> Cell. 47, 277-284 (1986).</li>
<li>Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+HLA-A+and+-B+antigens+via+an+alternative+RNA+splicing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway.</a> J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).</li>
<li>Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+Qa%2FTla+class+I+major+histocompatibility+antigen+gene+is+a+general+feature+of+oncogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse.</a> Nature. 306, 756-760 (1983).</li>
<li>Barbaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+splice-site+mutations+in+WT1+are+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome.</a> Nat Genet. 17, 467-470 (1997).</li>
<li>Charlet, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+muscle-specific+chloride+channel+in+type+1+myotonic+dystrophy+due+to+misregulated+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing.</a> Mol Cell. 10, 45-53 (2002).</li>
<li>Hutton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+missense+and+5%27-splice-site+mutations+in+tau+with+the+inherited+dementia+FTDP-17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.</a> Nature. 393, 702-705 (1998).</li>
<li>Kohsaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+9+mutations+in+the+WT1+gene%2C+without+influencing+KTS+splice+isoforms%2C+are+also+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome.</a> Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).</li>
<li>Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+splicing+regulated+by+a+CUG-binding+protein+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy.</a> Science. 280, 737-741 (1998).</li>
<li>Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+regulation+of+insulin+receptor+alternative+splicing+is+associated+with+insulin+resistance+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy.</a> Nat Genet. 29, 40-47 (2001).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+tau+gene+in+familial+multiple+system+tauopathy+with+presenile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonic+dystrophy+evidence+for+a+possible+dominant-negative+RNA+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation.</a> Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).</li>
<li>Graubert, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+the+U2AF1+splicing+factor+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 44, 53-57 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+SF3B1+mutation+in+myelodysplasia+with+ring+sideroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts.</a> N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+pathway+mutations+of+splicing+machinery+in+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.</a> Nature. 478, 64-69 (2011).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133, 704-715 (2008).</li>
<li>Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+represses+the+splicing+regulator+epithelial+splicing+regulatory+protein+1+to+promote+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition.</a> J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).</li>
<li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).</li>
<li>Zavadil, J., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+epithelial-to-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.</a> Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).</li>
<li>Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qBase+relative+quantification+framework+and+software+for+management+and+automated+analysis+of+real-time+quantitative+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.</a> Genome Biol. 8, R19(2007).</li>
<li>Boutz, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+post-transcriptional+regulatory+switch+in+polypyrimidine+tract-binding+proteins+reprograms+alternative+splicing+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons.</a> Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).</li>
<li>Salomonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+regulates+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).</li>
<li>Calarco, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vertebrate+nervous+system+alternative+splicing+and+development+by+an+SR-related+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein.</a> Cell. 138, 898-910 (2009).</li>
<li>Grabowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+takes+shape+during+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing takes shape during neuronal development.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).</li>
<li>Seol, D. W., Billiar, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-9+variant+missing+the+catalytic+site+is+an+endogenous+inhibitor+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis.</a> J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+endogenous+dominant-negative+short+isoform+of+caspase-9+that+can+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis.</a> Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).</li>
<li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Bcl-2-related+genes+functional+consequences+and+potential+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37, 331-340 (2005).</li>
<li>Cheng, C., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD44+alternative+splicing+by+SRm160+and+its+potential+role+in+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La procedura qui descritta consente il rilevamento di splicing alternativo in un modello EMT inducibile. Come tali, le alterazioni dinamiche di espressione delle isoforme di splicing possono essere catturate nel corso tempo di EMT. Questo metodo ha vantaggi rispetto all&#39;uso di epithelial- diverso o linee di cellule mesenchimali-che rappresenta per il confronto di splicing alternativo, perché background genetici distinti da linee cellulari connessi alle Nazioni Unite potrebbero influenzare indebitamente splicing alte...

La transizione epitelio-mesenchimale (EMT) è un programma di sviluppo che guida la morfogenesi di organi e rimodellamento tissutale durante l&#39;embriogenesi. Quando anormalmente attivato, EMT promuove la metastasi del tumore e degli organi fibrosi 1,2. Studi convincenti hanno descritto l&#39;importanza della regolazione trascrizionale durante il processo di EMT, definito da diversi fattori di trascrizione, come il Twist, Lumaca, e ZEB, che reprimono l&#39;espressione della proteina di giunzione adherens E-caderina, con conseguente perdita di un cobble- pietra come morfologia epiteliale e il guadagno di un a forma di fuso fenotipo mesenchimale 3-8. Recenti studi attraverso l&#39;analisi dell&#39;intero genoma di RNA hanno rivelato che esiste un gruppo di geni i cui modelli di splicing sono associati sia con fenotipi epiteliali e mesenchimali 9,10. Il lavoro dal nostro laboratorio funzionalmente collegato splicing alternativo e EMT. Studiando la superficie cellulare molecola di adesione CD44, abbiamo dimostrato che il CD44 Alternative splicing è strettamente regolata durante EMT, e più importante, che CD44 giuntura isoforma passaggio causalmente contribuisce alla EMT 11. Splicing alternativo rappresenta un modello diffuso e conservato di regolazione genica, in quanto fino al 95% dei geni multi-esone umani sono splicing alternativo 12-14. Generando più prodotti proteici da un singolo gene, splicing alternativo costituisce un meccanismo essenziale per la diversità di proteine, aggiungendo un ulteriore livello di complessità al genoma umano. Come tale, disregolazione di splicing alternativo potrebbe potenzialmente portare a profondi effetti biologici che causano malattie umane. Infatti, aberrante splicing alternativo nelle malattie è stato documentato da oltre un decennio 15-25, compresi recenti scoperte che le mutazioni in geni che codificano per le macchine spliceosoma trovano comunemente nelle sindromi mielodisplastiche 26-28. Pertanto, lo sviluppo di metodi affidabili per la rilevazione di i splicing alternativosoforms è di grande importanza nello studio dei processi biologici diversi, tra cui EMT. Qui forniamo un protocollo per rilevare i cambiamenti nella splicing alternativo utilizzando un modello di EMT inducibile. I metodi per la progettazione di primer PCR e rilevazione isoforme di splicing sono adatte non solo per lo studio di splicing alternativo durante EMT, ma anche per lo studio di splicing alternativo in altri processi biologici. Indagare splicing alternativo durante EMT è indispensabile al fine di comprendere meglio i meccanismi di EMT e metastasi tumorali, facilitando così lo sviluppo di strategie efficaci per il trattamento di metastasi del cancro.

<table><tbody><tr><td>4-idrossitamoxifene</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Preparare la soluzione madre sciogliendo il 4-idrossitamoxifene in etanolo a 200 &#956;M. Mantenere la soluzione a -20 &#176; C protetto dalla luce.</td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA totale E.Z.N.A. Kit di isolamento</td><td>dell'RNA totale</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td></tr><tr><td>Sistema di trascrizione inversa GoScript</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>Reagente per il test qRT-PCR</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Reagente per il test qRT-PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Roche</td><td></td><td>Attrezzatura per il test qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anticorpo CD44</td><td>R& D Systems</td><td>BBA10</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo E-caderina</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>4065</td><td>Diluizione 1:2.500 per immunoblotting; Diluizione 1:50 per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>&gamma;-catenina Anticorpo</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>2309</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo occludina</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo della fibronectina Anticorpo</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>Diluizione 1:5.000</td></tr><tr><td>Anticorpo N-caderina</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>Diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentin</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo GAPDH</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>Diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>Amasham ECL Western blotting reagente di rilevamento</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>sistema di chemiluminescenza</td></tr></tbody></table>

rilevamento di splicing alternativo durante epiteliale-mesenchimale transizione

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Lo splicing alternativo svolge un ruolo critico nella transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un programma cellulare essenziale che si verifica in vari processi fisiologici e patologici. Qui descriviamo una strategia per rilevare lo splicing alternativo durante l'EMT utilizzando un modello EMT inducibile esprimendo il repressore di trascrizione Twist. L'EMT è monitorata dai cambiamenti nella morfologia cellulare, dalla perdita della localizzazione della E-caderina nelle giunzioni cellula-cellula e dall'espressione commutata dei marcatori EMT, come la perdita dei marcatori epiteliali E-caderina e γ-catenina e l'aumento dei marcatori mesenchimali N-caderina e vimentina. Utilizzando set di primer isoforma-specifici, lo splicing alternativo degli mRNA interessati viene analizzato mediante RT-PCR quantitativa. La produzione di isoforme proteiche corrispondenti è convalidata da saggi di immunoblotting. Il metodo di rilevamento delle isoforme di splicing qui descritto è adatto anche per lo studio dello splicing alternativo in altri processi biologici.

Le procedure sopra descritte forniscono un metodo affidabile per rilevare splicing alternativo durante EMT. Risultati rappresentativi di CD44 giunzione commutazione isoforma durante EMT Twist-indotta sono riportati di seguito come esempio. EMT Twist-indotta nelle cellule HMLE / Twist-ER è stato caratterizzato da una transizione da un ciottolo-pietra come fenotipo epiteliale ad un fenotipo fibroblastica allungata (Figura 2A), l'assenza di marcatori epiteliali E-caderina, γ-ca...

È stato dimostrato che la regolazione alternativa dello splicing contribuisce alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un programma cellulare essenziale in vari processi fisiologici e patologici. Qui descriviamo un metodo che utilizza un modello EMT inducibile per il rilevamento di splicing alternativo durante l'EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare i cambiamenti nello splicing alternativo durante l'EMT. Ciò si ottiene utilizzando un modello EMT inducibile in cui l'espressione della proteina di fusione si attorciglia. Nelle cellule epiteliali mammarie umane le cellule innescano la terapia EMT dopo il trattamento con tamoxifene come seconda fase.L'espressione delle isoforme di splicing viene analizzata mediante R-T-P-C-R quantitativo utilizzando set di primer isoforma specifici, che rivelano cambiamenti di splicing alternativi a livello di RNA. Successivamente, l'abbondanza di proteine corrispondenti a ciascuna isoforma viene determinata mediante immuno blotting al fine di confermare l'espressione delle isoforme di splicing a livello proteico, si ottengono risultati che mostrano cambiamenti nello splicing alternativo nei geni di interesse durante l'EMT, sulla base di analisi quantitative R-T-P-C-R e immuno blotting, Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello splicing alternativo RN e dell'EMT, come il modo in cui lo splicing alternativo è regolato durante l'EMT e come questa regolazione influisce sull'EMT e sui processi patologici correlati all'EMT. Le implicazioni di questa tecnica sono orientate verso la terapia del cancro perché l'EMT svolge un ruolo importante nel promuovere l'invasione tumorale e le metastasi.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla giunzione alternativa durante l'EMT. Il metodo per la rilevazione dell'MRA isoforma specifica può essere applicato anche in altri sistemi, come lo studio dello splicing alternativo nella differenziazione neuronale e il programma di morte cellulare. Il primo passo consiste nel preparare le cellule che esprimono la proteina di fusione twist ER, seminare le cellule in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri in duplicato, quindi preparare e proteggere la luce la soluzione di tamoxifene per indurre la transizione mesenchimale epiteliale o EMT, trattare le cellule con 20 mezzi di comunicazione contenenti tamoxifene nanomolare per un gruppo di controllo non trattato con tamoxifene, aggiungere lo 0,01% di etanolo a un ulteriore set di cellule due giorni dopo l'incubazione.Scatta foto al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x per registrare eventuali cambiamenti morfologici. Quindi, lavare le celle con PBS freddo. Raschiare le cellule da una metà della piastra nel tampone di lisi dell'RNA per l'isolamento dell'RNA e l'altra metà in 100 microlitri di tampone ripa ghiacciato per l'analisi delle proteine, far passare le cellule di entrambi i gruppi come mostrato in precedenza e trattare continuamente con tamoxifene o veicolo a 20 nanomolari.Ripetere questi passaggi a giorni alterni fino al giorno 14, momento in cui le cellule ER twist trattate con tamoxifene dovrebbero mostrare una morfologia mesenchimale a forma di fuso. Mentre i controlli trattati con il veicolo dovrebbero mantenere la morfologia epiteliale simile a quella dei ciottoli. Qui un NNA a quattro esoni viene utilizzato come esempio per il rilevamento dell'inclusione dell'esone.Progettare un primer diretto all'interno dell'esone tre variabile e un primer inverso all'interno del vicino esone costitutivo quattro. Consentire l'amplificazione specifica dell'isoforma inclusa dell'esone variabile per amplificare in modo specifico gli eventi di salto dell'esone. Primer di progettazione che coprono la giunzione dell'esone due e dell'esone quattro costitutivi che altrimenti verrebbero distrutti quando è incluso l'esone tre variabile.Progettare l'altro primer all'interno dell'esone quattro costitutivo per rilevare i trascritti totali del gene ed evitare prodotti di PCR amplificati dal DNA genomico o prem NA.Design primer all'interno di due esoni costitutivi quando sono pronti. Segue le procedure standard di estrazione dell'RNA per isolare l'RNA dai campioni di cellule raccolti in precedenza. Determinare la concentrazione e la qualità dell'RNA mediante assorbimento UV per sintetizzare il primo filamento CD NA impostare le reazioni di trascrittasi inversa in un volume finale di 20 microlitri.Eseguire reazioni RT a 42 gradi Celsius per un'ora, seguite da incubazione a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Per inattivare l'enzima RT in tempo reale. La PCR ha impostato reazioni da 20 microlitri che consistono in 10 microlitri di master mix cyber green, da 0,1 a 1,0 microlitri di modello CD NA e cinque primer diretti e inversi di picomoli.Esegui la PCR in tempo reale con 40 cicli in triplice copia. Controllare le curve di dissociazione e assicurarsi che si osservi un singolo picco per ogni set di primer. Ottenere i valori del ciclo di quantificazione calcolando i valori della derivata seconda delle curve di amplificazione.Calcolare la quantità relativa di mRNA bersaglio nei campioni indotti rispetto al campione non indotto utilizzando il metodo delta delta CQ, come mostrato da questa formula. Lasciare le cellule raccolte per l'analisi delle proteine su ghiaccio per circa 10 minuti prima di centrifugare e raccogliere il surnatante. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, diluire i campioni nel caricamento SDS, tamponare e caricare da 20 a 40 microgrammi di proteine in gel di pagina SDS al 10%.Esegui i gel SDS a 20 milliampere per 1,5 ore. Trascorso questo tempo, trasferire le proteine alle membrane PVDF in un sistema di trasferimento umido a quattro gradi Celsius per tre ore a 85 volt. Regolare il tempo di trasferimento in base al peso molecolare delle proteine bersaglio.Quindi, bloccare la membrana nel latte scremato al 5% per 30 minuti a un'ora. A temperatura ambiente, incubare la membrana con un anticorpo primario a quattro gradi Celsius durante la notte. L'anticorpo primario riconosce l'epitopo nella regione costitutiva del rivestimento dell'esone e rileva simultaneamente le isoforme delle slic in base alle loro diverse dimensioni proteiche.Allo stesso tempo, monitorare l'EMT mediante immunoblotting. Per marcatori EMT. Utilizzare eec, ahern, gamma catenina e occludina come marcatori epiteliali e fibronectina n caderina e mentone come marcatori mesenchimali.Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte con TBST a intervalli di cinque minuti. Successivamente, incubare la membrana con un anticorpo secondario coniugato HRP in una diluizione da uno a 10.000 per un'ora a temperatura ambiente. Trascorso questo tempo, lavare la membrana tre volte con TBST a intervalli di cinque minuti.Infine, visualizzare le proteine con un sistema di rilevamento a chemiluminescenza ed esporre la membrana a una pellicola per autoradiografia. L'EMT indotta da torsione è stata caratterizzata da una transizione da un fenotipo epiteliale simile a un ciottolo a un fenotipo fibroblastico allungato, che mostra l'assenza di marcatori epiteliali, e caderina, gamma catenina e occludina, e la sovraregolazione di marcatori mesenchimali, fibronectina n caderina e vimentina. Inoltre, l'EMT è stata valutata in base alla perdita di localizzazione della caderina EC nelle giunzioni cellulari raffigurate.Ecco i disegni dei primer per la rilevazione delle isoforme di splicing CD 44. Le posizioni dell'innesco sono indicate dalle frecce di colore diverso. I risultati delle analisi Q-R-T-P-C-R indicano una significativa diminuzione dell'mRNA di CD 44 V e un aumento dell'mRNA di CD 44 s dopo 14 giorni di trattamento con TAM.Al contrario, il trascritto totale di CD 44 è rimasto invariato durante l'EMT coerentemente con i risultati di Q-R-T-P-C-R, il livello proteico di CD 44 V è diminuito notevolmente, mentre l'espressione della proteina CD 44 è stata notevolmente sovraregolata durante questa procedura. È importante ricordare che il successo dell'induzione dell'otorinolaringoiatria è molto cruciale. Pertanto, l'otorinolaringoiatria deve essere accuratamente confermata con vari metodi, come il rilevamento di cambiamenti nella morfologia cellulare, l'espressione dei marcatori ORL e la localizzazione di RIN sulla superficie cellulare.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il saggio di gestione del reporter di splicing per rispondere a ulteriori domande come, in che modo questi elementi agenti e i fattori di transazione influenzano la regolazione alternativa dello splicing dopo il suo sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA, della biologia dello sviluppo e della biologia del cancro per esplorare la regolazione alternativa dello splicing nei processi EMT durante il normale sviluppo e le metastasi del cancro.

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Un metodo semplice è descritto per l'induzione della transizione epitelio mesenchimale (EMT) in una varietà di tipi cellulari. Metodi per l'analisi di cellule in EMT stati di immunocitochimica sono inclusi.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Questa relazione descrive un metodo bioingegneria per progettare e costruire nuovi fattori artificiali splicing (ASF) che specificamente modulano la giunzione di geni bersaglio in cellule di mammifero. Questo metodo può essere ulteriormente ampliata per progettare vari fattori artificiali di manipolare altri aspetti del metabolismo dell'RNA.

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

Presentiamo qui un metodo di coltura cellulare per indurre transizioni mesenchimali-epiteliale (MET) in cellule di sarcoma basato su espressione ectopica combinata di microRNA-200 familiari e grainyhead-like 2 (GRHL2). Questo metodo è adatto per una migliore comprensione dell'impatto biologico della plasticità fenotipica sull'aggressività cancro e trattamenti.

Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma

È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Descriviamo un flusso di lavoro sistematico per indagare la segnalazione di TGF-β e l'EMT indotto da TGF-β studiando l'espressione proteica e genica coinvolta in questa via di segnalazione. I metodi includono western blotting, un saggio di reporter luciferasi, qPCR e colorazione immunofluorescenza.

Studio della segnalazione β TGF e della transizione epiteliale-mesenchimale indotta da TGF-β nel cancro al seno e nelle cellule normali

Questo protocollo presenta uno strumento rapido e utile per valutare il ruolo di una proteina con funzione insolita nella regolazione dello splicing alternativo dopo il trattamento chemioterapico.

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Descriviamo metodi per studiare l'EndMT indotto da TGF-β2 nelle cellule endoteliali osservando i cambiamenti della morfologia cellulare ed esaminando i cambiamenti marcatori correlati all'endmt usando la colorazione dell'immunofluorescenza. L'editing genico CRISPR/Cas9 è stato descritto e utilizzato per esaurire il gene che codifica per Snail per indagare il suo ruolo nell'EndMT indotto da TGF-β2.

TGF-β endoteliale mediato a transizione mesenchimale (EndMT) e la valutazione funzionale degli effettori EndMT utilizzando crispr/cas9 gene editing

Lo splicing alternativo (AS) e la poliadenilazione alternativa (APA) espandono la diversità delle isoforme di trascrizione e dei loro prodotti. Qui, descriviamo i protocolli bioinformatici per analizzare i saggi di sequenziamento di massa dell'RNA-seq e 3' per rilevare e visualizzare AS e APA che variano in base alle condizioni sperimentali.

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La luce / buio prova di transizione è uno dei test più usato per misurare l'ansia comportamento simile nei topi. Qui, vi presentiamo un film che mostra le procedure dettagliate su come condurre il test.

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Scopri come rilevare lo splicing alternativo durante la transizione epitelio-mesenchimale utilizzando un modello EMT inducibile con cellule epiteliali mammarie umane. Questo metodo combina qRT-PCR e immunoblotting per analizzare le modifiche degli isoformi.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

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