Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

Ciao e benvenuto nel Gruppo di Biologia Strutturale e Funzionale delle Membrane. Mi chiamo Martin Caffery. Il fulcro della nostra ricerca è la membrana biologica, il cui schema è mostrato nella prima diapositiva, la membrana che circonda la cellula e gli organelli subcellulari quando presenti è una struttura molecolarmente sottile, di sole due molecole lipidiche e costellata di proteine.

Siamo interessati alla struttura e alle funzioni applicate sia ai lipidi che alle proteine. Tuttavia, ai fini di questa serie JO, limiterò la mia attenzione alle proteine di membrana. Cerchiamo di capire come funzionano queste proteine di membrana a livello molecolare per due motivi.

In primo luogo, c'è la soddisfazione intellettuale nel sapere come funziona qualcosa. In secondo luogo, sapendo come funziona, proprio come la tua bicicletta o auto, c'è la prospettiva di ripararlo in caso di malfunzionamento. La progettazione di farmaci è un risultato ovvio di questo tipo di lavoro.

L'approccio che adottiamo per capire come funziona una proteina di membrana a livello molecolare è quello di determinare la sua struttura cristallografica. Ciò comporta lo stabilire la posizione nello spazio tridimensionale di tutti gli atomi, o almeno di tutti gli atomi non di idrogeno che compongono la proteina. Il metodo che utilizziamo a questo scopo si chiama cristallografia a raggi X macromolecolare MX in breve.

Qui vediamo un esempio di una proteina di membrana la cui struttura è stata determinata utilizzando MX in un cristallo di qualità frazionaria della proteina è necessario per fare mx. Come si può immaginare, ci sono molti passaggi coinvolti nella determinazione strutturata utilizzando la cristallografia macromolecolare, come illustrato. Qui. In genere, questi includono l'identificazione di un bersaglio proteico di membrana e quindi la produzione, la purificazione e la cristallizzazione.

Le misure di diffrazione vengono eseguite sul cristallo utilizzando una sorgente di raggi X domestica o di sincrotrone. I dati di diffrazione vengono elaborati, producendo una mappa della densità elettronica, che viene poi dotata di un modello molecolare. Il modello, una volta raffinato, può essere utilizzato per esplorare il meccanismo d'azione della proteina e per la progettazione di farmaci basati sulla struttura.

L'obiettivo di questo articolo è quello di mostrarvi come produciamo cristalli di proteine di membrana di qualità frazionaria utilizzando le fasi meso lipidiche con il cosiddetto metodo in meso. Una recente revisione del metodo e del suo campo di applicazione è disponibile come riferimento. Il protocollo passo-passo che seguiremo qui è descritto in riferimento a un diagramma di flusso che riassume le fasi coinvolte e il tempo necessario per l'impostazione di uno studio di cristallizzazione delle proteine della meso membrana finale è mostrato qui.

Questo video illustra i passaggi racchiusi da linee rosse tratteggiate. Gli elementi che dovrai fare nella cristallizzazione meso in modalità manuale sono mostrati qui. Includono una soluzione concentrata del lipide proteico di membrana purificato per creare la malattia dell'ospite, di solito mono ole per rendere il lipide più evidente.

In questo video, è stato drogato con soluzioni di precipitante colorante rosso, dispositivi di accarezzamento di tubi di acqua purificata e puntali monouso e assortimento di siringhe Hamilton a tenuta di gas, alcune con aghi rimovibili, un accoppiatore a foro stretto utilizzato per mescolare la soluzione proteica con il lipide per produrre la malattia. Un dispenser ripetitivo di diapositive e vetrini per microscopio in vetro Hamilton. Nastro distanziatore a doppia stecca perforato idealmente isolato per pinzette per la creazione di pozzi, fazzoletti di ghiaccio scheggiati, una calcolatrice e, soprattutto, il tuo taccuino da laboratorio.

La seguente procedura viene utilizzata per preparare una piastra di cristallizzazione a sandwich di vetro. Per il caricamento, posizionare un vetrino da microscopio in silos sul banco. Rimuovere il coperchio di carta protettiva da una superficie di una striscia di nastro distanziatore a doppia aletta perforata.

Posizionare il nastro con il lato adesivo rivolto verso il basso a contatto con la superficie della pressione del vetrino. Sigillare il nastro al vetrino. Utilizzando un braciere o un rullo, è possibile posizionare un foglio di alluminio tra il nastro e il rullo per proteggere la base dei pozzetti.

Rimuovere il secondo coperchio di carta dal nastro per esporre la superficie adesiva superiore. Questa procedura genera una lastra di vetro pronta per il carico e il successivo soffitto non appena il carico è completo. I singoli slittamenti di copertura siloizzati in prossimità della piastra garantiscono un soffitto dei pozzetti rapido ed efficiente.

Metti il lipide in un blocco a temperatura controllata a 45 gradi Celsius per tre minuti per renderlo fuso. Si noti che il lipide utilizzato è tipicamente mono land. In questo video, al lipide viene aggiunto un colorante rosso per la visibilità mentre il lipide si scioglie.

Preparare due siringhe Hamilton a tenuta di gas da 100 microlitri per l'uso Nella fase di miscelazione delle proteine lipidiche, rimuovere l'olio di pelliccia di teflon dalla siringa che conterrà la soluzione proteica. Posiziona la siringa che manterrà il lipide accanto ad essa. In questo caso, il fal viene lasciato in posizione.

Posizionare l'accoppiatore a foro stretto tra le due siringhe, quindi collegare l'accoppiatore al dito della siringa lipidica. Stringere l'accoppiatore alla siringa, ma non serrare eccessivamente. Rimuovere lo stantuffo dal cilindro della siringa lipidica.

Assicurati che il lipide sia fuso. Impostare la pipetta a 30 microlitri e prelevare lentamente 30 microlitri di tappo lipidico fuso. La fiala lipidica.

Il lipide deve essere conservato sotto azoto o argon a meno 80 gradi Celsius. Erogare lentamente quanto più lipidi fusi possibile nell'estremità aperta della siringa. Facendo attenzione a non introdurre intercapedini d'aria.

Posizionare lo stantuffo nella canna a contatto con il leopardo fuso e far avanzare lentamente lo stantuffo verso l'alto nella canna con la siringa tenuta verticalmente. Come mostrato, la bolla d'aria intrappolata sale inavvertitamente durante il processo e viene rilasciata. Ora abbiamo un tappo di lipidi fusi nel barile il cui volume deve essere determinato con precisione.

Questo può essere fatto leggendo i segni sul cilindro della siringa. In questo caso, il volume è di 23 microlitri, che viene registrato nel quaderno di laboratorio. Far scorrere il pelo sull'ago che si estende dall'accoppiatore.

Utilizzare lo stantuffo per forzare il lipide fuso verso l'alto nel cilindro e lentamente e delicatamente nell'ago al centro dell'accoppiatore. Se l'ago è leggermente troppo pieno, si vedrà il lipide battere all'estremità aperta. Sollevando leggermente lo stantuffo, il lipide in eccesso può essere ritirato nell'accoppiatore fino a quando non è appena a filo con la punta dell'ago dell'accoppiatore.

In questo caso, l'unità di accoppiamento della siringa è completamente carica e pronta per essere combinata con la siringa per proteine. La soluzione deve essere centrifugata a 14.000 G per 10 minuti, da cinque a 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere gli aggregati di grandi dimensioni. Prima di avviare le prove di cristallizzazione, prelevare la soluzione proteica dal secchiello del ghiaccio ed equilibrarla a temperatura ambiente.

Calcola il volume delle proteine, quindi soluzione da utilizzare per formare la fase cubica a o vicino alla piena idratazione per oleano a 20 gradi Celsius. La piena idratazione con acqua avviene vicino al 40% in peso di acqua come nel diagramma di fase. Ricordiamo che abbiamo caricato la siringa lipidica con 23 di mono ad una densità di 0,94 milligrammi per microlitro.

Ciò corrisponde a 21,6 milligrammi di lipidi, quindi 21,6 volte quattro diviso per sei o 14,4 milligrammi o 14,4 microlitri di soluzione proteica è necessario con una siringa Hamilton da 25 o 50 microlitri per raccogliere il volume richiesto di soluzione proteica, trasferire la soluzione sulla punta in teflon dello stantuffo nel cilindro della soluzione proteica. Facendo attenzione a evitare bolle d'aria, estrarre con cautela l'ago e misurare il volume della soluzione proteica nella siringa. Deve corrispondere al valore fornito nel passaggio precedente.

In preparazione per l'abbinamento con la siringa caricata con lipidi. Posiziona con cautela la soluzione proteica verso l'alto nel cilindro per finire a filo con la sua estremità aperta. Questo può essere osservato guardando in basso attraverso l'estremità di terminazione del cilindro.

La soluzione proteica lipina, le siringhe caricate sono ora pronte per essere combinate in preparazione per Mex per fare ciò, avvitare la siringa proteica nell'estremità aperta dell'accoppiatore attaccato alla siringa lipidica. Dopo aver combinato due siringhe tramite l'accoppiatore. Un volume continuo di liquido dovrebbe esistere dal lipide in una siringa attraverso l'accoppiatore alla soluzione proteica nell'altra siringa.

In preparazione per la miscelazione, l'unità assemblata viene tenuta in una con una siringa nella mano destra e l'altra nella sinistra. La coppia viene applicata a entrambe le canne fino all'accoppiatore, utilizzando le dita e il pollice di entrambe le mani per garantire che la tenuta contro i solchi nell'accoppiatore rimanga intatta durante il serraggio. Il dispositivo di miscelazione assemblato in questa fase danneggerà l'ALS e causerà perdite durante il serraggio porterà anche a perdite.

È una questione di esperienza con gli inevitabili tentativi ed errori e la perdita occasionale di campione. Vale quindi la pena esercitarsi con lipidi e acqua o soluzione tampone per avere un'idea del sistema prima di lanciarsi nell'uso di una preziosa soluzione proteica per influenzare la miscelazione, far avanzare lo stantuffo sul lato proteico dell'unità di miscelazione assemblata fino al suo limite con il pollice o l'indice che spinge la soluzione proteica fuori dalla siringa proteica attraverso l'accoppiatore e nella siringa lipidica. Se l'unità è stata sigillata in modo efficace, questa azione provocherà un movimento uguale e contrario dello stantuffo sul lato lipidico.

Lo stantuffo sul lato lipidico viene ora utilizzato per riportare il contenuto della siringa lipidica attraverso il coler e nella siringa proteica. Questo processo viene ripetuto molte volte. Occasionalmente sono necessari un centinaio di passaggi o più per produrre una fase di misa omogenea.

All'inizio della miscelazione, il movimento del materiale avanti e indietro attraverso l'accoppiatore può essere irregolare e a volte è necessaria una forza extra per effettuare la miscelazione. C'era da aspettarselo. La miscelazione iniziale è solitamente accompagnata dallo sviluppo di una torbidità non uniforme nel campione e di nuovo è prevista.

Man mano che l'omogeneizzazione progredisce. La consistenza percepita dalla forza necessaria per muovere gli stantuffi avanti e indietro diventa più uniforme e caratteristica della fase cubica del visce, così come l'aspetto visivo della fase cubica emergente. Se le condizioni sono appropriate e si forma la fase cubica, la dispersione dovrebbe apparire otticamente trasparente nel cilindro della siringa.

Pertanto, i segni sul cilindro della siringa dovrebbero essere chiaramente leggibili attraverso la fase meso nel cilindro. Nel caso di proteine colorate, la fase meso avrà il colore della proteina, ma sarà otticamente trasparente. Un leggerissimo raffreddamento del campione durante la miscelazione, posizionando il miscelatore a siringa per un breve periodo sul ghiaccio, può accelerare l'omogeneizzazione e il raggiungimento della trasparenza.

Tuttavia, è importante non esagerare con il campione, è necessario prestare attenzione per evitare una miscelazione estremamente vigorosa in quanto ciò può causare un aumento della temperatura del campione a causa del riscaldamento per attrito. A questo punto, si è formata la fase di misa cubica e la proteina è stata ricostituita nel blay lipidico. La fase misa è ora pronta per l'erogazione nei singoli pozzetti delle piastre di cristallizzazione.

Prima, però, la fase meso deve essere trasferita in una siringa Hamilton da 10 microlitri montata su un dosatore ripetitivo. Iniziare questo processo accoppiando la siringa al dosatore sottile. Caricare la siringa con la morsa cubica.

Rimuova l'ago e lo stantuffo dalla siringa. Lasciare il fal in teflon in posizione. Rimuovere il dado di fissaggio dall'erogatore con l'aiuto di una monetina.

Con il braccio del cricchetto completamente estratto. Inserire la siringa senza lo stantuffo e l'ago attraverso l'anello di tenuta dell'erogatore. Riposizionare il lato della guarnizione del nodo di fissaggio rivolto verso la siringa e avvitarlo saldamente sull'estremità aperta della siringa.

Prestare attenzione per assicurarsi che la siringa sia correttamente centrata nell'anello di tenuta e che il cilindro sia allineato parallelamente al braccio del cricchetto. Entrambi possono essere giudicati da I.Questi due requisiti sono importanti perché se lo stantuffo non funziona liberamente e attraverso la pressione si accumulerà nella siringa di origine durante il caricamento e possono verificarsi perdite. Far passare lo stantuffo attraverso l'anello di presa con il dado di presa, svitarlo di alcuni giri e guidare lo stantuffo nell'estremità aperta della siringa.

Premere completamente il braccio del cricchetto, spostare completamente lo stantuffo nella canna e verificare che viaggi liberamente e attraversi la canna. Se la vite e la barra di guida sono state allentate, serrarle nuovamente e ricontrollare che lo stantuffo si muova liberamente. I La siringa di erogazione è ora pronta per il caricamento.

Spostare lo stantuffo su un lato dell'unità di miscelazione assemblata fino al segno di graduazione zero microlitro. Trasferire la fase meso all'altra siringa e all'accoppiatore. Scollegare la siringa vuota con l'UL in posizione dall'unità di miscelazione e collegare immediatamente la siringa carica con l'accoppiatore collegato alla terminazione filettata della siringa di erogazione da 10 microlitri.

Il grado di tenuta con cui viene eseguito l'accoppiamento è fondamentale. Come già notato, caricare la siringa di erogazione premendo lo stantuffo della siringa da 100 microlitri in modo che la fase meso si trasferisca attraverso l'accoppiatore. Se l'accoppiamento è stretto e lo stantuffo nella siringa di erogazione scorre libero, lo stantuffo dovrebbe iniziare a muoversi nella direzione di movimento dello stantuffo di caricamento mentre la siringa di erogazione si riempie.

Scollegare la siringa di caricamento con l'accoppiatore collegato alla siringa di erogazione. Fissare un ago corto con punta piatta all'estremità in acciaio della siringa di erogazione e serrarlo accuratamente in posizione. Clamp lo stantuffo al braccio del cricchetto stringendo il nodo nell'anello di presa.

Bisogna fare attenzione a non stringere eccessivamente il nodo. Poiché ciò può segnare e deformare lo stantuffo rendendolo inutilizzabile. È importante che l'intervallo di corsa fornito al braccio a cricchetto nella condizione bloccata sia limitato a non più di un pollice.

Come mostrato oltre a ciò, lo stantuffo avrà la tendenza a piegarsi e l'erogazione può non riuscire. Premere più volte il tamburo del cricchetto per far avanzare lo stantuffo nel cilindro, riempiendo così il volume vuoto dell'ago e caricando l'ago. Questo passaggio deve essere ripetuto fino a 10 volte fino a quando dalla punta dell'ago emerge una corda continua della fase mesa.

L'ago è ora pronto per l'uso nell'impostazione delle prove di cristallizzazione, che dovrebbero iniziare immediatamente. Non è consigliabile mantenere la fase cubica caricata con proteine per troppo tempo prima di impostare le prove di cristallizzazione. Poiché alcune proteine sono instabili nella fase cubica senza precipitanti aggiunti, posizionare una piastra di cristallizzazione a più pozzetti e un vetrino coprioggetti su una superficie, rialzata di alcuni centimetri sopra il banco per facilitare il caricamento.

Il contrasto ottimale e la visibilità migliorata si ottengono quando la superficie è leggermente scura. Omogeneizzare le soluzioni precipitanti e tappare le fiale. Impostare il proppe di erogazione del precipitante a un microlitro con la siringa di erogazione tenuta verticalmente in una mano, utilizzare la mano libera per posizionare la punta dell'ago al centro e direttamente sopra la base del pozzetto.

Numero uno. Premere il pulsante sull'erogatore sul dosatore ripetuto per espellere un bolo di mastice sulla superficie del vetro. Il volume del bolo è di 200 nanolitri.

Quando l'erogatore ripetuto standard viene utilizzato con una siringa da 10 microlitri, la punta dell'ago non deve trovarsi a più di qualche centinaio di micrometri sopra la base del pozzetto Per garantire un'erogazione corretta, è possibile ottenere facilmente un'erogazione riproducibile. Ci vuole solo un po' di pratica. Dopo che i quattro pozzetti adiacenti sono stati caricati con la mease, posizionare un microlitro di soluzione precipitante sopra ogni bolo di mease.

Utilizzando il più rapidamente possibile un puntale monouso standard da due microlitri per brevetto, posizionare un vetrino coprioggetti perpendicolarmente sopra i pozzetti riempiti per coprirli uniformemente ed effettuare una tenuta stagna. Utilizzare una spatola per applicare pressione sul vetrino coprioggetti nel punto in cui entra in contatto con la superficie adesiva esposta del nastro distanziatore. Il processo di erogazione del macerazione e del precipitante può essere ripetuto fino a quando tutti i pozzetti sulla piastra non sono caricati e sigillati.

La piastra è ora pronta per l'ispezione e per l'incubazione. Etichettare chiaramente la targa per motivi di tracciamento. Le proteine sensibili alla luce vengono solitamente manipolate avvolgendo le piastre in un foglio di alluminio prima di metterle nella camera di incubazione.

Questi possono essere rimossi ed esaminati al microscopio in una luce soffusa o adeguatamente colorata. Posizionare le piastre in una camera a temperatura controllata, di solito a 20 gradi Celsius o giù di lì, secondo un programma regolare. Ispezionare le pareti per la crescita dei cristalli utilizzando un microscopio a luce polarizzata con un met di 10 o 20 volte.

Obiettivo, il programma utilizzato nel laboratorio dell'autore è il seguente, giorno 0 1 2 3 5 7 14 21 30 post set. Ispezionare attentamente il bolo di mease. Regolazione della profondità di messa a fuoco all'interno del campione di 140 micron di spessore.

L'esame deve essere effettuato sia in condizioni di luce normale che tra polarizzatori incrociati, cristalli proteici di membrana incolori che crescono nella fase cubica se osservati con luce normale. Assomiglia a questo. I cristalli di proteine di membrana incolori che crescono nel meso quando vengono osservati con luce polarizzata hanno questo aspetto o le proteine di membrana naturalmente colorate che crescono nel meso quando vengono osservate con luce normale assomigliano a questo o questo.

I passi successivi nel processo complessivo di determinazione strutturata sono la raccolta e il crioraffreddamento dei cristalli e la registrazione e l'elaborazione della diffrazione dei raggi X da essi. Questi argomenti sono trattati in articoli JoVE separati in questa serie.