Un In Vitro Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la trasformazione unica delle microglia in cellule GLO in presenza della tossina ciclina. Ciò si ottiene rivestendo prima i vetrini coprioggetti con proteine della matrice extracellulare. Nella seconda fase, le cellule gliali vengono piastrate sui vetrini coprioggetti, quindi le perle di ciclina e lattice vengono somministrate alle colture.

Nella fase finale, le cellule vengono colorate mediante immunochimica. In definitiva, gli effetti della ciclina sulla nucleazione e sulla capacità fagocitaria delle cellule microgliali possono essere valutati mediante microscopia immunofluorescente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di linee cellulari microgliali, è che l'uso di colture gliali primarie imita le interazioni ipotizzate tra astrociti I e microglia nel cervello di individui con leucodistrofia a cellule vuote GLO o GLD, dimostrando che la procedura sarà KO Claycomb, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per preparare i vetrini coprioggetti rivestiti con matrice extracellulare o ECM, immergere prima i vetrini coprioggetti circolari con acido cloridrico sterile in una piastra di Petri sterile. Dopo 30 minuti, lavare tre volte i vetrini copricoperchio con acqua sterile e poi immergerli in etanolo al 95% per almeno 20 minuti. Dopo aver lasciato asciugare i vetrini all'aria, aggiungere da 150 a 250 microlitri di materiali di rivestimento proteico ECM diluiti su un foglio di paraforma distribuendo le goccioline in modo che i vetrini coprioggetti non si sovrappongano dopo il posizionamento.

Quindi, utilizzare una pinza per posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti su ciascuna gocciolina e quindi posizionare la paraforma all'interno di una cappa per coltura cellulare con l'anta chiusa dopo quattro o sei ore, posizionare i vetrini coprioggetti con il lato rivestito ECM rivolto verso l'alto nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Quindi lavare ogni pozzetto con PB S3 sterile per volte e conservare i vetrini coprioggetti a quattro gradi Celsius. Per preparare le cellule gliali per la placcatura sui vetrini coprioggetti, aspirare il terreno dalle colture cellulari gliali e quindi lavare delicatamente i monostrati tre volte con 10 millilitri di PBS sterile.

Staccare le cellule con 8-10 millilitri di tripsina EDTA dopo 5-10 minuti. A 37 gradi Celsius, aggiungere 20 millilitri di terreno completo al pallone per fermare la reazione. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare le cellule per 10 minuti.

A 300 g e temperatura ambiente, utilizzare un P 1000 per risospendere delicatamente il palato in due millilitri di terreno fresco e completo. Dopo il conteggio, diluire le cellule a circa una volta da 10 a una quinta cellula per millilitro. Ora piastra 500 microlitri di cellule su ciascuno dei vetrini coprioggetti rivestiti con ECM.

Aggiungere altro terreno fresco completo a ciascun pozzetto e quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre-cinque giorni. Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza desiderata, aggiungere la ciclina appena preparata a ciascun pozzetto e agitare delicatamente la piastra di coltura per mescolare. Dopo una settimana di trattamento con ciclina, raccogliere il terreno e fissare le cellule in 500 microlitri di freddo, 4% di para formaldeide per pozzetto a temperatura ambiente.

Quindi lavare ogni pozzetto tre volte con PBS e conservare le piastre a quattro gradi Celsius. Per visualizzare le cellule GLO mediante immunocitochimica, sostituire prima il PBS con un tampone bloccante e incubare le cellule a temperatura ambiente. Dopo un'ora, incubare le cellule negli antisieri primari contro il marcatore della microglia IO one per almeno un'ora a temperatura ambiente, quindi lavare ciascuna pozzetto tre volte in PBS per cinque minuti.

Dopo aver incubato le cellule con l'anticorpo secondario coniugato a fluorescenza appropriato, controcolorare le cellule con DAPI per identificare i nuclei. Quindi, dopo aver lavato le cellule come appena dimostrato, utilizzare il mezzo di montaggio per montare ciascun vetrino coprioggetto sui singoli vetrini del microscopio e visualizzare i vetrini su un microscopio fluorescente per l'analisi visiva e quantitativa. Per valutare l'attività fagocitaria della microglia trattata con ciclina dopo il trattamento con ciclina, ma prima della fissazione, aggiungere perle di lattice marcate con FITC a ciascuna coltura di cellule G OID in conformità con le istruzioni del produttore.

Dopo 48 ore, fissare le cellule in PFA come appena dimostrato, quindi elaborare le cellule per l'immunochimica come mostrato. Infine, valutare il numero di microglia IBO one positive che co-localizzano con le perle marcate in fluorescenza mediante microscopia immunochimica a fluorescenza. La colorazione delle microglia utilizzando IO one in combinazione con un controcolorante nucleare consente l'identificazione di grandi cellule multinucleate arrotondate.

Si noti che in molti casi, l'ingrandimento grossolano delle dimensioni del nucleo riflette lo stato multinucleato di queste cellule, come osservato in questa immagine, il trattamento con ciclina evoca anche un'attivazione generalizzata della microglia che è misurabile da un aumento dell'attività acida PHA della microglia mononucleata, così come delle cellule GLO multinucleate. Come osservato in questa immagine rappresentativa, i profili acidamente attivi PHA della microglia IBO one positiva possono essere facilmente identificati durante la co-coltura con cellule progenitrici degli oligodendrociti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia della GLD poiché la formazione di queste cellule multinucleate in risposta al trattamento con ciclina è una caratteristica distintiva della neuropatologia della GLD e il contributo di queste cellule a questa patologia non è stato esplorato in questo modo in precedenza.