Name: Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Impara a valutare la maturazione dei cardiomiociti nel cuore embrionale di topo usando immunofluorescenza e microscopia confocale. Questo metodo permette di analizzare lo sviluppo delle miofibrille e delle strutture cardiache ad alta risoluzione.

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Gli autori desiderano ringraziare i dottori Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin e James Smyth per le utili discussioni. La microscopia è stata eseguita presso il Cardiovascular Research Institute Imaging Core dell'Università della California, San Francisco. Questo lavoro è stato supportato da NIH K08 HL105657 (LDW) e NIH HL65590 (SRC).

NOTA: Tutte le procedure sperimentali sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato UCSF istituzionale. 1. Crioconservazione e fissazione delle embrionali Cuori mouse. 1.1) Snap-congelamento cuori embrionali <ol><li> Riempire un 3,5 centimetri petri piatto e 7 mm cryomolds con Optimal taglio temperatura (OCT) medio (vedi Materiali tabella). In una cappa chimica, raffreddare 2-metilbutano in azoto liquido. </li><li> Dispensare 30 ml di tampone fosfato salino (PBS) in 10 centimetri di Petri piatti, 10 ml di PBS in 3,5 centimetri di Petri piatti, e mettere tutti i piatti di Petri sul ghiaccio. Preparare un piatto 10 centimetri e diversi 3,5 centimetri piatti per il mouse incinta. </li><li> Isolare embrioni come precedentemente descritto 15, eseguendo la dissezione in PBS freddo. </li><li> In breve, eutanasia la femmina incinta con CO 2 narcosi e dislocazione cervicale. <ol><li> Fare un&#39;incisione nell&#39;addome, sezionare l&#39;utero tagliando i vasi along la curvatura interna dell&#39;utero, e trasferire l&#39;utero di una capsula di Petri 10 centimetri contenente PBS ghiacciato. </li><li> Tagliare l&#39;utero tra ogni embrione e il trasferimento ad un individuo 3,5 centimetri piastra di Petri contenente ghiacciata PBS. Isolare ogni embrione come descritto 15. </li><li> Aprire la cavità pericardica utilizzando una pinza sottile, rimuovere il cuore lontano da polmoni e vasi tagliando alla aorta, vena cava inferiore, e vene polmonari, e trasferire in cm Petri 3,5 contenente ottobre </li><li> Lasciate che il cuore equilibrare in OCT per alcuni secondi, quindi trasferire il cuore nello stampo di 7 mm avente ottobre Orientare la parete anteriore del cuore al fondo dello stampo. </li></ol></li><li> Inserire delicatamente lo stampo in azoto liquido raffreddato 2-metilbutano. Fare attenzione a non permettere a 2 metilbutano liquido per toccare il cuore di Office o. Congelare fino al ottobre è solido bianco, poi il trasferimento lo stampo di un secchio di ghiaccio contenente ghiaccio secco. Passare al successivo dell&#39;embrione. </li><li> Wrap cryomolds in un foglio e conservare a -80 ° C fino al momento criosezionamento. </li></ol> 1.2) Alternativa: Paraformaldeide (PFA) che fissa, cryoprotecting, e ottobre incorporamento cuori embrionali <ol><li> Riempire i pozzetti di una piastra di coltura tissutale 12-bene con 4% PFA in 1x PBS. </li><li> Sezionare i cuori embrionali, come descritto in 1.1.3. Posizionare ogni cuore in un pozzo contenente 4% PFA e fissare a 4 ° CO / N. </li><li> Crioprotezione: con una pipetta di plastica trasferimento, spostare ogni cuore ad una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 1,5 ml di 15% di saccarosio in PBS e agitare delicatamente a 4 ° C fino al cuore scende sul fondo del tubo (diverse ore a O / N ). Trasferire ogni cuore ad un 1,5 ml provetta contenente 1,5 ml di 30% di saccarosio in PBS e agitare delicatamente a 4 ° C fino a che il cuore scende sul fondo del tubo (diverse ore per O / N). </li><li> Usando una pipetta di trasferimento in plastica, posizionare cuore crioprotetti in OCT e lasciarlo equilibrareper alcuni minuti per eliminare l&#39;eccesso di saccarosio, quindi trasferire il cuore nello stampo di 7 mm avente ottobre Orientare la parete anteriore del cuore al fondo dello stampo. </li><li> Fermo cuore in OCT ponendo lo stampo sia raffreddato con azoto 2-metilbutano liquido o ghiaccio secco. </li><li> Avvolgere cryomolds in fogli e conservare a -80 ° C fino al momento criosezionamento. </li></ol> 2. criosezionamento <ol><li> Impostare la temperatura criostato a -17 ° C. </li><li> Posizionare cryomolds nella camera criostato e raggiunga la temperatura per 15-20 minuti. </li><li> Invertire la cryomold e utilizzare una leggera pressione per espellere il blocco cardiaco dallo stampo. Orientare la parete anteriore del cuore per la parte superiore del blocco di tessuto stampato. </li><li> Mettere una grossa goccia di ottobre sul mandrino, e montare il blocco cardiaco sul calo ottobre a congelare sul mandrino. Mantenere l&#39;orientamento tale che la parete anteriore del cuore è lontano dal mandrino. </li><li> Caricare il mandrino e montato luiarte blocco sul portaoggetti criostato. Regolare in modo che l&#39;angolo della lama è 3-5 ° rispetto al campione. </li><li> Colleziona 10 micron sezioni su vetrini da microscopio che sono stati pre-trattati con un rivestimento carica positiva (vedi Materiali tabella). Lasciare asciugare completamente prima di riporlo a -80 ° C. </li></ol> 3. immunofluorescenza <ol><li> Per le sezioni snap-congelate, correggere e permeabilize tessuti in acetone per 10 minuti in una cappa aspirante a RT. </li><li> Per le sezioni snap-congelate e PFA-fisse, incubare in PBS-0.1% Triton X-100 per 20 minuti per rimuovere Office e di permeabilize sezioni PFA-fisse. </li><li> Block per 45 min in 1x tampone bloccante, diluito in PBS. </li><li> Se si utilizza un anticorpo primario generato nel topo, incubare in asino o di capra anti-topo IgG (H + L) monovalente frammento Fab diluito 1: 100 in PBS-0.1% Tween 20 per 45 minuti a temperatura ambiente (vedi Discussione). </li><li> Incubare in anticorpo primario o anticorpi diluito in 1x tampone bloccante per 2 ore a temperatura ambiente oO / N a 4 ° C (vedi tabella dei materiali / Attrezzature per diluizioni specifici). </li><li> Lavare le sezioni in PBS 1x tre volte per 10 minuti a RT. </li><li> Incubare in Alexa Fluor-coniugato anticorpo secondario diluito 1: 500 in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. </li><li> Lavare le sezioni in 1x PBS tre volte per 10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. </li><li> Optional: incubare in Hoechst colorante diluito 1: 2.000 in PBS a RT (protetto dalla luce) a etichettare nuclei, poi risciacquare con PBS. </li><li> Post-fix etichettato sezioni in 1% PFA per 1 min a RT. </li><li> Mount scorre in mezzo anti-fade (con DAPI se nuclei non sono già etichettati) posizionando due gocce di supporto su ogni estremità della slitta e quindi coprire con un vetrino coprioggetto. Seal coprioggetto con smalto. Conservare protetto dalla luce a 4 ° C fino al momento di immagine. </li></ol> 4. confocale Imaging and Image Analysis <ol><li> Attivare le lunghezze d&#39;onda appropriate laser, macchina fotografica, e confocale microscopio incLuding fase mover e z motore. Avviare il programma software di imaging. Utilizzare i 405, 488, e 561 lunghezze d&#39;onda laser per l&#39;imaging Hoechst-, Alexa 488-, e Alexa sezioni 568-colorate, rispettivamente. NOTA: Vedi Tabella Materiali per le nostre specifiche hardware e software. </li><li> Montare il vetrino di controllo (coprivetrino premuto per un microscopio invertito) sul palco diapositiva. </li><li> Usando l&#39;obiettivo 4X (vedi Materiali Tavolo), trovare il campione e area di interesse. Cattura l&#39;immagine da utilizzare come mappa quando l&#39;imaging ad alto ingrandimento. </li><li> Rimuovere il vetrino, le regolazioni minime per la fase di presentazione. Passare l&#39;obiettivo ad immersione 60x olio (vedi Materiali Tavolo), posizionare una piccola goccia di olio sull&#39;obiettivo, e sostituire la slitta (coprivetrino giù) sul palco diapositiva. </li><li> Trova di nuovo campione. Impostare la potenza del laser, tempo di esposizione, e binning ai livelli desiderati per ciascun canale. NOTA: Usiamo generalmente potenza del laser di 0.8, tempo di esposizione della fotocamera di 100 msec, e binning di 2 (see Materiali Tavolo per le specifiche hardware e software); impostazioni ottimali devono essere determinati empiricamente per ogni esperimento. <ol><li> Una volta che le impostazioni ottimali sono determinate, utilizzare le stesse impostazioni per tutte le sezioni di tessuto all&#39;interno dell&#39;esperimento. Utilizzare l&#39;istogramma intensità notare la gamma ottimale intensità per ciascun canale (queste informazioni verranno utilizzate per l&#39;analisi). </li></ol></li><li> Generare pila az utilizzando la funzione di acquisizione: selezionare i canali laser appropriate, quindi scegliere i limiti superiore e inferiore della pila z. Seleziona taglia az passo stack che è la metà del valore dello spessore fetta ottica fornita dal software. Fare clic su &quot;Esegui&quot; per raccogliere le immagini. </li><li> Utilizzare Fiji 16 o un programma analogo per l&#39;analisi delle immagini. All&#39;interno di Fiji, aprire il file di stack z con l&#39;opzione modalità colore personalizzata e i canali suddivisi in finestre separate. Aprire la &quot;Regolazione Luminosità / Contrasto&quot; strumento dal menù a tendina immagine; all&#39;interno di ciascun canale, set il range ottimale di intensità istogramma determinato in 4.5.1. Applicare questi intervalli di canale per tutti gli stack z analizzato. </li><li> Unire i singoli canali in un&#39;unica immagine composita utilizzando Immagine-&gt; menu a discesa Colore. </li><li> Creare uno stack z appiattito dalla immagine composita con il Image-&gt; Stacks-&gt; menu project z. L&#39;immagine sarà significativamente più luminosa l&#39;immagine 3D di; regolare la gamma di intensità istogramma per il campione di controllo per evitare sovrasaturazione, e applicare le stesse impostazioni per la sperimentazione appiattito z stack. </li><li> Per generare una immagine 3D, prima di utilizzare il Image-&gt; Stacks-&gt; Menu progetto 3D 17. Scegliere l&#39;asse x o y-asse di rotazione. Impostare la spaziatura fetta come lo stesso numero di micron come dimensione dello stack z passo. Scegli la rotazione totale desiderata e impostare l&#39;incremento di angolo di rotazione a 1. Aprire quindi l&#39;immagine J 3D Viewer dal Plugin menu a tendina. Scegli l&#39;immagine composita generata in 4.8, display come Volume, e impostare il Recampionamento fattore da 1 o 2. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La tecnica di fissaggio del tessuto ottimale e diluizione devono essere determinati empiricamente per ciascun anticorpo. Nelle nostre mani, snap-congelamento è superiore alla fissazione PFA per diversi antigeni cardiomiociti, tra cui s-α-actinina, β-catenina, β1-integrina, tropomiosina, Talin (non mostrato) e N-caderina; in contrasto, fissazione PFA fornisce risultati superiori per focale chinasi aderenza (non mostrato). I legami crociati proteine ​​formate da PFA possono mascherare epitopi e limite vincolante di anticorpi; recupero di un antigene può essere richiesto in questi casi, e metodi per il recupero antigene può essere trovata altrove 20. Concentrazione PFA o la lunghezza del fissaggio possono essere diminuiti per ridurre epitopo mascheramento, con condizioni ottimali empiricamente determinati per ogni anticorpo e in ogni fase dello sviluppo. Appropriati controlli negativi dovrebbero essere utilizzati nella caratterizzazione di un nuovo anticorpo o mutante cardiaca, compreso il siero pre-immune come controllo anticorpo primario e un co &quot;no anticorpo primario&quot;ntrol. L&#39;uso di topi knockout è un controllo negativo ideale ma mortalità precoce impedisce l&#39;uso per molti dei prodotti genici studiati qui. L&#39;uso di volumi adeguati per sommergere completamente i vetrini sperimentali e di controllo nello stesso blocco immunofluorescenza, anticorpi, e le soluzioni di lavaggio è stato importante come era dolce dondolio delle diapositive durante l&#39;incubazione per garantire l&#39;esposizione uniforme delle sezioni alle soluzioni. Questo approccio minimizzato la variabilità tecnica in colorazione tra le sezioni e diapositive all&#39;interno di un esperimento. Quando il costo limita il volume della soluzione di anticorpi, utilizzare una penna Pap per limitare il flusso di soluzioni al di là delle sezioni di tessuto e di mantenere i vetrini in una camera umidificata durante lunghi incubazione. Se un monoclonale principale del mouse anticorpi - e quindi un anticorpo secondario anti-topo - è in uso, una seconda fase di blocco per coprire immunoglobuline endogene del mouse sarà necessario (punto 3.4) per ridurre non specifico segnale di fondo. Appropriate tecniche di microscopia e di elaborazione delle immagini sono fondamentali per ottenere informazioni accurate biologicamente 21. L&#39;istogramma intensità indica la distribuzione dei pixel per ogni livello di intensità (0-65.535 livelli per immagini a 16-bit) per ogni colore. Sfondo, la luminosità e il contrasto può essere regolato impostando una gamma di visualizzazione di intensità che costeggia il picco istogramma; per rendere validi confronti tra le condizioni, devono essere utilizzate le stesse impostazioni tra controllo e alle condizioni sperimentali. Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per analizzare la maturazione dei cardiomiociti e sviluppo nel nativo cuore embrionale del mouse. Mentre immunofluorescenza di proteine ​​specifiche per cardiomiociti è spesso usato per marcare cardiomiociti durante lo sviluppo, pochi studi impiegano tecniche che consentono l&#39;analisi ad alta risoluzione della struttura myofibril e l&#39;emergere di dischi intercalari e costameres 12-14,22,23. Questa tecnica può essere utilizzata per in vla valutazione ivo di mutazioni che causano difetti cardiaci di sviluppo, come mezzo per identificare cambiamenti di cardiomiociti di maturazione che possono far luce sui meccanismi di anomalie strutturali.

Durante lo sviluppo, le contrazioni del cuore iniziano subito dopo cardiomiociti migrano alla linea mediana e formano il tubo cuore 1,2 lineare. Il sarcomero è l&#39;unità contrattile base ai cardiomiociti; tale struttura citoscheletrica altamente organizzata contiene filamenti di actina ancorate al Z-disco sarcomerica α-actinina (s-α-actinina) e fibre miosina ancorate alla linea M (Figura 1). Come il cardiomiociti matura, sarcomeri assemblare in serie per formare miofibrille che si estendono attraverso la cella. Miofibrille sono ancorate alle estremità della cardiomiociti dal disco intercalato, la struttura giunzionale cellula-cellula che contiene una giunzione di transizione con un sottoinsieme di elementi Z-disco come s-α-actinina 3, adherens proteine ​​di giunzione come N-caderina e β catenina, proteine ​​gap di giunzione, e desmosomi (Figura 1) 4. Lungo la membrana longitudinale, gli Z-dischi di miofibrille periferici anchecollegare alla membrana cellulare via costameres; queste adesioni focali specializzati forniscono un ancoraggio tra miofibrilla, membrana plasmatica, e matrice extracellulare per fornire ulteriore supporto strutturale al cardiomiociti (Figura 1) 4. All&#39;inizio dello sviluppo del cuore, cardiomiociti sono disposti in proiezioni simili a dita noti come trabecole che sporgono nello spazio ventricolare e contengono miofibrille relativamente maturi 5. Come procede lo sviluppo del cuore, i cardiomiociti nella regione sub-epicardica proliferano a formare il miocardio compatto che comprende le pareti ventricolari, ma sarcomero e montaggio myofibril sono in ritardo rispetto al miocardio trabecolare 5,6. Modelli di sarcomero e montaggio myofibril provengono in gran parte da studi di immunofluorescenza su cardiomiociti in coltura 7-10, che sono semplici, ma non dispongono di un ambiente tridimensionale, il flusso di sangue, e contatti con altre cellule cardiaches presenti in vivo. studi strutturali ad alta risoluzione con immunofluorescenza nel cuore embrionale del mouse sono tecnicamente impegnativo, e pochi studi hanno esplorato l&#39;emergere di dischi intercalari e costameres durante topo sviluppo cardiaco. La proteina adherens giunzione β catenina sembra localizzare a dischi intercalari di giorno embrionale (E) 17,5 11, N-caderina localizza a strutture lineari che possono rappresentare dischi intercalari di E18.5 12 contro postnatale giorno 0 13, e costameres siano state accertate su E18.5 14, ma queste proteine ​​di membrana visualizzare la distribuzione diffusa e più continuo in precedenti momenti di sviluppo 11-13. Qui, descriviamo un metodo semplice e riproducibile per immunostaining e microscopia a fluorescenza di topo sezionata cuori embrionali che permette l&#39;analisi dettagliata di myofibril e dello sviluppo dei cardiomiociti, tra cui l&#39;emergere di intercalated Dischi già nel E12.5 e costameres nascenti a E16.5. Questo protocollo può essere utile per sondare gli effetti delle mutazioni sulla formazione sarcomere nonché myofibril e cardiomiociti maturazione.

<table><tbody><tr><td>Cryomold, Stampo base monouso, 7x 7 mm</td><td>Richard-Allen Scientific</td><td>58949</td><td>Questa misura non è disponibile presso Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cryomold, Stampo base monouso, 15 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-159</td><td>Disponibile anche presso Richard-Allen Scientific, numero di catalogo 58950</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Temperatura di taglio ottimale (OCT) media 4583</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>2-metile butano</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>Utilizzare una soluzione fresca al 4% in 1x PBS, pH 7,2-7,4.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Utilizzare soluzioni al 15% e al 30% in 1X PBS.</td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>"Plus" indica un rivestimento caricato positivamente ed è fondamentale per mantenere l'aderenza dei tessuti al vetrino.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Western Blocking Agent</td><td>Roche</td> 11921673001 Tampone bloccante per <td></td><td>l'immunofluorescenza, quando gli anticorpi secondari provengono da specie diverse. Diluire a 1x in PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Asino Anti-topo IgG (H+L) frammento Fab monovalente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>Capra Anti-topo IgG (H+L) disponibile anche. Per bloccare le immunoglobuline endogene.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-s-&#945;-actinina</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Monoclonale di topo, clone EA53. Diluire 1:400 per sezioni surgelate/fissate con acetone, diluire 1:300 per sezioni fissate con PFA. Prima dell'incubazione su tessuto topo, bloccare le immunoglobuline endogene di topo con il frammento Fab monovalente anti-IgG di topo (H+L).</td></tr><tr><td>Anti-&#946; anticorpo della catenina</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9587s</td><td>Coniglio policlonale. Richiede il congelamento a scatto/fissazione con acetone. Diluire 1:400.</td></tr><tr><td>Anti-&#946; 1 anticorpo</td><td>integrina R& D</td><td>AF2405</td><td>Policlonale di capra. Diluire 1:200. La colorazione dei tessuti congelati a scatto/fissati con acetone è superiore a quella dei tessuti fissati con PFA.</td></tr><tr><td>Anticorpi anti-tropomiosina</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi, Università dell'Iowa</td><td>CH1</td><td>Monoclonale di topo. Richiede il congelamento a scatto/fissazione con acetone. Diluire 1:200. Prima dell'incubazione su tessuto topo, bloccare le immunoglobuline endogene di topo con il frammento Fab monovalente anti-IgG di topo (H+L).</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-N-caderina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7939</td><td>Policlonale di coniglio. Diluire 1:200. La colorazione dei tessuti congelati a scatto/fissati con acetone è superiore a quella dei tessuti fissati con PFA.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-talin</td><td>Sigma</td><td>T3287</td><td>Monoclonale di topo, clone 8d4. Richiede il congelamento a scatto/fissazione con acetone. Diluire 1:200. Prima dell'incubazione su tessuto topo, bloccare le immunoglobuline endogene di topo con il frammento Fab monovalente anti-IgG di topo (H+L).</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fosfotirosina 397 chinasi di adesione focale</td><td>Invitrogen</td><td>700255</td><td>anticorpo monoclonale di coniglio. Richiede il fissaggio in PFA. Diluire 1:500.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino Anti-Topo IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Asino Anti-Coniglio Anticorpo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra Anti-Topo IgG (H+L)</td><td>Anticorpo Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Capra Anti-Coniglio IgG (H+L)Anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 colorante</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Colorazione nucleare</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>MLC 400B Combinatore laser monolitico Scatola laser</td><td>Keysight (precedentemente Agilent)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clara Telecamera CCD interlinea</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti invertita microscopio</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Unità scanner confocale a disco rotante</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat 4X obiettivo ad aria</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Apertura numerica (NA) 0,2, Distanza di lavoro (WD) 15,7 mm</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat VC 60x obiettivo a iniezione d'olio (MRD01602)</td><td>Nikon&nbsp; &nbsp;</td><td>NA 1.4, WD 0.13 mm</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Software di imaging</td><td>Nikon</td><td>http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di cardiomyocyte sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Durante lo sviluppo del cuore, la generazione di unità strutturali e funzionali specifici del miocardio tra cui sarcomeri, miofibrille contrattili, dischi intercalari, e costameres richiede il montaggio coordinato di più componenti in tempo e nello spazio. Turbativa in assemblaggio di questi componenti comporta difetti cardiaci sviluppo. Tecniche di colorazione immunofluorescenza sono usati comunemente in cardiomiociti in coltura per sondare la maturazione myofibril, ma questo approccio ex vivo è limitata dalla misura in cui saranno completamente miociti differenziare in coltura, mancanza di normali ingressi meccanici in vivo, e l&#39;assenza di segnali endocardici. Applicazione di tecniche di immunofluorescenza allo studio di sviluppare cardiaca mouse è desiderabile, ma tecnicamente più impegnativo, e metodi spesso non sensibilità e risoluzione sufficiente per visualizzare sarcomeres nei primi stadi di sviluppo del cuore. Qui, si descrive un metodo affidabile e riproducibile di co-mu immunostainproteine ​​ltiple o di co-visualizzare una proteina fluorescente con immunofluorescenza nel cuore embrionale del mouse e utilizzare questo metodo per analizzare miofibrille in via di sviluppo, dischi intercalari, e costameres. Questo metodo può essere ulteriormente applicato per valutare cardiomiociti cambiamenti strutturali causate da mutazioni che portano a difetti cardiaci sviluppo.

Le figure da 2 a 6 mostrano risultati tipici per co-colorazione delle proteine ​​differenti in un cuore snap-congelato e acetone-fisso. L&#39;anticorpo contro s-α-actinina riproducibile etichettati Z-dischi e dischi intercalati con alta specificità e sfondo minima (figure 2A, 3A, 4A, 5A, 6A e 6C); figura 6 dimostra che l&#39;anti-topo IgG (H + L) monovalente frammento Fab blocca efficacemente IgG topo endogena vincolante da anticorpi secondari anti-topo. L&#39;anticorpo contro la proteina adherens giunzione β catenina legata alla membrana sia cardiomiociti e cellule non-cardiomiociti, e co-localizzazione con s-α-actinina è verificato in dischi intercalari presunti a E16.5 (Figura 2C e D), come previsto dalla β modello catenina colorazione nel cuore adulto 18. β1 integrina immunofluorescenza nel cuore embrionale è particolarmente impegnativo e spesso non riesce a individuare adesioni focali di 14, ma il segnale β1 colorazione integrina in questi studi ha rivelato con la stessa periodicità Z-dischi-s-α-actinina marcato, forse riflettendo costameres nascenti formando a E16.5 (Figura 3D). A E12.5, s-α-actinina e tropomiosina (sarcomere proteine ​​sottile filamento) immunofluorescenza ha rivelato un pattern di colorazione con periodicità regolare in cardiomiociti trabecolare coerenti con miofibrille maturi in queste cellule (Figure 4A e 5A per s-α-actinina; Figura 4B per tropomyosin). N-caderina colorazione in cardiomiociti trabecolare a cuori E12.5 tendeva colocalizza con le aree di intensa s-α-actinina colorazione (Figura 5B - D e Figure 6A - C) che forse rappresenta dischi intercalari. Incontrasto al miociti trabecolare, s-α-actinina nella zona compatta era più puntata che lineare, e tropomiosina colorazione era diffusa piuttosto che lineare (Figura 4A e 4B). Così, il montaggio sarcomere può verificarsi più tardi nel compatto rispetto al miocardio trabecolare. Inoltre, i modelli differenziali di s-α-actinina e tropomiosina nella zona compatta suggeriscono che s-α-actinina organizza in puncta e immaturi Z-dischi primi, mentre tropomiosina incorporazione nella sottile filamento può essere un evento più tardi in assemblea myofibril. Figura 7, Film 1, e Movie 2 dimostrano risultati tipici di un cuore embrionale PFA-fisso E12.5. In questi esempi, un embrione transgenico LifeAct-RFPruby è stato utilizzato per l&#39;imaging; il transgene LifeAct-RFPruby 19 etichette actina filamentosa ma richiede la fissazione PFA. Z-dischi etichettati con s-α-actinina erano facili da visualizzare in molte aree, ma il rapporto segnale-rumore era decre<html> ASED rispetto a scatto congelati sezioni di cuore (Figura 7A); questo segnale era tipico per s-α-actinina immunofluorescenza nel tessuto PFA-fisso, in cui epitopi possono essere mascherati da proteine ​​cross-link. Figura 7B mostra co-visualizzazione di actina filamentosa e immunolabeled s-α-actinina all&#39;interno miofibrille (punte di freccia) e actina filamentosa all&#39;interno delle cellule endocardico adiacenti miociti trabecolare (frecce). Tridimensionale di ricostruzione delle immagini ha rivelato ulteriori dettagli: singoli cardiomiociti sono stati più facilmente discernere, miofibrille all&#39;interno di un cardiomiociti sono stati all&#39;incirca parallele l&#39;una all&#39;altra, ma i singoli cardiomiociti sono state orientate ad angoli diversi tra loro (Figura 7C e D, Film 1, e Movie 2 ). La stretta approssimazione tra le cellule endocardico e cardiomiociti era meglio apprezzata nelle viste tridimensionali pure. <html> &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig1.jpg" /> Figura 1. sarcomeri cardiomiociti, dischi intercalari, e costameres. La Z-disco ancore filamenti di actina, mentre la linea M ancore fibre miosina, che si sovrappongono i filamenti di actina. Il sarcomero è composto da una Z-disco - linea M - unità Z-disco. Più sarcomeri in serie creano miofibrilla. L&#39;estremità laterale della miofibrilla inserisce nel bordo trasversale della cardiomiociti ad una struttura giunzionale cellula-cellula specializzata chiamato il disco intercalato. Miofibrille periferici collegano alla membrana plasmatica cardiomiociti longitudinale via costameres, che formano adesioni focali con la matrice extracellulare tra cardiomiociti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> PLOAD / 52.644 / 52644fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. s- α -actinin e β catenina immunofluorescenza al giorno embrionale 16.5. Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina, che immagini cardiomiociti etichettato Z-dischi e dischi intercalari, e (B) coniglio anticorpi contro la proteina polycloncal adherens bivio β catenina. (C) Fusa mostrano s-α-actinina e β catenina colorazione. (D) ingrandita area di interesse dal pannello C ; mark asterischi presume dischi intercalari con co-localizzazione di s-α-actinina e β catenina. Le immagini sono state ottenute dalla parete ventricolare sinistra periferico o miocardio compatta, con lo strato epicardico in alto a sinistra di pannelli AC. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1600 (fuori of possibile 0-65535) per entrambi i nm e β catenina / 561 canali laser nm s-α-actinina / 488. Bar Scala 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig3.jpg" /> Figura 3. s- α -actinin e β 1 integrina immunofluorescenza al giorno embrionale 16.5. Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e immagini (B) di capra policlonale anticorpi contro la proteina di adesione focale β1 integrina. (C) Fusa mostrano integrina β1 in cardiomiociti e cellule non cardiomiociti. Nota sia diffusa epuntata β1 segnale integrina in cardiomiociti (D) area di interesse dal pannello C. nota puntata, β1 periodica integrina colorazione (frecce) con cadenza simile alla vicina s-α-actinina-colorazione in Z-dischi ingrandita.; queste strutture possono rappresentare costameres. Le immagini sono state ottenute dalla sinistra ventricolare miocardio compatto. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1200 (fuori possibili 0-65535) per il / 488 canali laser nm s-α-actinina e 460-600 per il canale laser nm β1 integrina / 561. Bar Scala 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig4.jpg" /> Figura 4. s- α -actinin e tropomyosin immunofluorescenza al giorno 12.5 embrionale: organizzazione myofibril in<html> trabecolare e compatta miocardio. Cuori di embrioni littermate venivano asportate, a scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e (B) del mouse anticorpo monoclonale contro il filamento sottile miofibrilla proteine ​​tropomiosina (Developmental Studies Ibridoma Bank CH1). Trabecolare (frecce) e miocardio compatto (punte di freccia) sono indicati. Nota s-α-actinina colorazione lineare con regolare periodicità nel miocardio trabecolare, rispetto ad una gamma di pattern di colorazione compreso puncta nonché colorazione lineare nello strato compatto (A). Nota anche la colorazione tropomyosin lineare con periodicità regolare nel miocardio trabecolare ma colorazione più diffusa nel miocardio compatto. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1,400 (di possibili 0-65535) per il canale s-α-actinina e 460-1,000 per il canale tropomyosin. Scale bar 10 micron.Target &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig5.jpg" /> Figura 5. s- α -actinin e N-caderina immunofluorescenza al giorno embrionale 12.5:. Miofibrille e dischi intercalari in cardiomiociti trabecolare Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e (B) di coniglio policlonale anticorpi contro la proteina di adesione focale N-caderina. 0,2 micron fette ottici sono stati raccolti come pila az, yez pile erano appiattite per generare le immagini. (C) unite pile appiattite mostrano sia N-caderina e s-α-actinina colorazione all&#39;interno cardiomiociti trabecolari come well come nuclei marcati con Hoechst dye (D) ingrandite area di interesse dal pannello C.; asterischi segnano dischi intercalari con co-localizzazione di s-α-actinina e N-caderina. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-1,200 (di possibili 0-65535) per il / 405 canali laser nm Hoechst e 470-2,000 sia per il nm s-α-actinina / 488 e N-caderina / 561 canali laser nm. Bar Scala 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig6.jpg" /> Figura 6. Anti-topo IgG (H + L) monovalente frammento Fab blocca efficacemente il mouse endogena vincolante da anticorpi secondari anti-topo IgG. Il E12.5 cuore embrionale è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained. <sTrong&gt; (AC) Le sezioni sono state bloccate con 1x tampone bloccante seguita da anti-topo IgG monovalenti Fab frammento, esposto a monoclonale clone EA53 anticorpo primario contro s-α-actinina e coniglio anticorpo primario policlonale contro N-caderina, lavato, ed esposto Alexa Fluor 488 anti-mouse e anticorpi secondari 586 anti-coniglio Alexa Fluor. (A) immagine a video utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2500 (fuori possibile 0-65535). Regioni note asterischi in cui N-caderina segnale è limitato alla fine trasversale cardiomiociti trabecolare, che probabilmente rappresenta dischi intercalari nascenti. (B) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (C) s-α -actinin solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (DG) Le sezioni sono state bloccate con 1x tampone di bloccaggio solo (no anti-topo IgG monovalenti Fab frammento passo di blocco), esposto a policlonale di coniglioanticorpo primario contro N-caderina solo (nessun mouse anticorpo primario monoclonale), lavato, ed esposti a Alexa Fluor 488 anti-mouse e anticorpi secondari 586 anti-coniglio Alexa Fluor. (D) uniti dell&#39;immagine usando istogramma intensità campo di visualizzazione 480-2500. canale con (E) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2500. (F) canale tramite istogramma intensità campo di visualizzazione 480-2,500 s-α-sola-actinina. (G) solo s-α-actinina- alta sensibilità istogramma intensità campo di visualizzazione 480-530, che rivela sfondo determinazione di anticorpi IgG endogena del mouse in assenza di anti-topo IgG monovalenti Fab frammento passo di blocco. (HK) Sezioni sono state bloccate con 1x tampone bloccante seguita da anti-topo IgG monovalente frammento Fab, esposto policlonale di coniglio anticorpo primario contro N-caderina (nessun mouse anticorpo primario monoclonale), lavato, e esposta a Alexa Fluor 488 anti-topo e Alexa Fluor anticorpi secondari 586 anti-coniglio. (H) Fusa immagine usando gamma istogramma intensità 480-2,500. (I) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (J) s-α-actinin- solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (K) s solo-α-actinina-channel con alta sensibilità gamma visualizzazione istogramma di intensità 480-530, che dimostra la mancanza di sfondo endogena rilevamento IgG mouse quando il mouse anti-IgG monovalente frammento Fab passo di blocco viene utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig7.jpg" /> Figura 7. s- α -actinin e organizzazione actina in cardi trabecolareomyocytes al giorno embrionale 12.5. La linea di topi transgenici LifeAct-RFPruby è stato utilizzato per visualizzare actina filamentosa 19, mentre il mouse monoclonale clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina è stato usato per etichettare Z-dischi e dischi intercalari. Gli embrioni sono stati PFA-fisse. 0,2 micron fette ottici sono stati raccolti come pila az (A) appiattito z pila mostra che s-α-actinina colorazione era più diffusa nel tessuto PFA-fisse che in snap-congelato e fissate in acetone sezioni (figure 2-5).. (B ) appiattito z pila mostra sia actina filamentosa e s-α-actinina. Filamentosa fluorescenza actina localizzato tra Z-dischi all&#39;interno miofibrille (punte di freccia). Actina filamentosa fluorescenza è stata osservata anche in cellule endocardico che rivestono i miociti trabecolari (frecce). (C) vista tridimensionale dei cardiomiociti trabecolari, come visto dalla cima della pila. (D) vista tridimensionale dicardiomiociti trabecolare, come visto dal fondo della pila. Intensità istogramma campo di visualizzazione 470-900 (su possibili 0-65535) sia per il canale di laser 488 nm e per il canale laser 561 nm in A e B; intervallo di visualizzazione 460-800 per entrambi i canali in C e D. bar Scala 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie1.mov">Movie</a> 1. 360 ° di rotazione 3D di s- α -actinin e organizzazione actina in cardiomiociti trabecolare a giorno embrionale 12.5. La serie di immagini della Figura 6 è stata resa in tre dimensioni utilizzando il plug-J immagine 3D Viewer nell&#39;ambito del programma di analisi delle immagini Fiji. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-800 (di possibili 0-65535) per entrambi i canali di 488 nm e 561 nm laser. &lt;/ P&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie2.mov">Movie</a> 2. Viste 3D selezionati di s- α -actinin e actina organizzazione in cardiomiociti trabecolare a giorno embrionale 12.5. La serie di immagini della Figura 6 è stata resa in tre dimensioni utilizzando il plug-J immagine 3D Viewer nell&#39;ambito del programma di analisi delle immagini Fiji. Piccole rotazioni attorno x, y, e Z. mostrato relativamente allineati miofibrille all&#39;interno cardiomiociti ma scarso allineamento tra la maggior parte dei cardiomiociti. Piccole rotazioni anche dimostrato l&#39;approssimazione di cellule endocardico privi s-α-actinina intorno cardiomiociti. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-800 (di possibili 0-65535) sia per il 488 nm e 561 nm canali laser.

Le mutazioni che portano a difetti cardiaci congeniti beneficiano dell'indagine in vivo della struttura cardiaca durante lo sviluppo, ma gli studi strutturali ad alta risoluzione nel cuore embrionale di topo sono tecnicamente impegnativi. Qui presentiamo un robusto metodo di immunofluorescenza e analisi delle immagini per valutare le strutture specifiche dei cardiomiociti nel cuore del topo in via di sviluppo.

Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la maturazione delle fibre miocardiche e dei cardiomiociti nel cuore embrionale di topo in via di sviluppo. Questo viene ottenuto innanzitutto orientando e congelando il cuore embrionale in un mezzo di taglio. Successivamente, il cuore viene sottoposto a sezione criostatica nell'orientamento corretto.Successivamente, le sezioni cardiache vengono sottoposte a marcatura immunofluorescente delle proteine di interesse. Infine, viene eseguita la microscopia confocale delle sezioni cardiache immunoistochimiche. In ultima analisi, analisi dell'immagine bidimensionali e tridimensionali sono utilizzate per mostrare lo sviluppo dei MiFi e di altre strutture dei cardiomiociti.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo cardiaco, ad esempio in che modo le mutazioni e i geni cardiaci influenzano l'assemblaggio delle miofibrille e la formazione di strutture specifiche come i dischi intercalati e i costameri. Per congelare rapidamente i cuori embrionali, utilizzare un mezzo OCT (optimal cutting temperature) per riempire una piastra di Petri da 3,5 centimetri in una cappa chimica. Raffreddare il 2-metilbutano in azoto liquido.Dopo aver isolato i cuori embrionali di topo seguendo il protocollo descritto nel testo, posizionare i cuori nell'OCT e lasciarli equilibrare per alcuni secondi prima di trasferirli in uno stampo di sette millimetri contenente OCT. Orientare la parete interna del cuore verso il fondo dello stampo. Posizionare delicatamente lo stampo nel butano dimetilico raffreddato con azoto liquido.Avendo cura di non far toccare ai due liquidi di metilbutano l'OCT o il cuore fino a quando l'OCT non diventa bianco solido. Successivamente trasferire lo stampo in un contenitore di ghiaccio secco. Dopo aver congelato tutti i cuori, avvolgere gli stampi criogenici nella pellicola di alluminio e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento della criosezionatura.Per fissare i cuori embrionali, utilizzare PFA al 4% in PBS per riempire le pozzette di una piastra da coltura a 12 pozzette. Dopo aver dissezionato i cuori embrionali seguendo il protocollo descritto nel testo, posizionare ciascun cuore in una pozzetta contenente PFA e fissare a quattro gradi Celsius durante la notte. Per proteggere i cuori criogenicamente, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, spostare ciascun cuore in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 1,5 millilitri di saccarosio al 15% in PBS e agitare delicatamente a quattro gradi Celsius finché il cuore non affonda sul fondo della provetta. Trasferire quindi ciascun cuore in saccarosio al 30% in PBS e agitare delicatamente a quattro gradi Celsius finché il cuore non affonda sul fondo della provetta.Congelare gli embrioni in OCT come dimostrato precedentemente in questo video. Dopo aver posizionato gli stampi criogenici nella camera del criostato e aver raggiunto la temperatura di meno 17 gradi Celsius, capovolgere lo stampo criogenico ed esercitare una leggera pressione per espellere il blocco cardiaco dallo stampo. Orientare la parete anteriore del cuore verso la parte superiore del blocco di tessuto modellato.Posizionare una grossa goccia di OCT sul mandrino e montare il blocco cardiaco sulla goccia di OCT. Mantenere l'orientamento in modo che la parete anteriore del cuore sia la più lontana dal mandrino. Lasciare congelare il cuore sul mandrino.Caricare il mandrino e il blocco cardiaco montato sul supporto dell'oggetto del criostato. Regolare in modo che l'angolo della lama sia compreso tra tre e cinque gradi rispetto al campione. Raccogliere sezioni di 10 micrometri su vetrini precedentemente trattati con un rivestimento carico positivamente.Lasciare asciugare completamente i campioni prima di conservarli a meno 80 gradi Celsius per eseguire l'immunofluorescenza. Dopo la fissazione e/o la rimozione dell'OCT dalle sezioni, utilizzare un tampone bloccante 1x diluito in PBS per bloccare per 45 minuti con agitazione delicata. Se si utilizza un anticorpo primario prodotto in topo, aggiungere un frammento monovalente FAB di IgG anti-topo da asino o capra H più L, diluito 1 a 100 in PBS 0,1% tween 20, e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti con agitazione delicata.Aggiungere l'anticorpo primario o gli anticorpi diluiti in un volume di buffer bloccante e incubare per due ore a temperatura ambiente oppure a quattro gradi Celsius durante la notte. Al termine dell'incubazione, utilizzare un volume di PBS 1x per lavare le sezioni tre volte per 10 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere l'anticorpo secondario coniugato, diluito 1:500 in buffer bloccante, ai campioni e incubare al buio per due ore.A temperatura ambiente, utilizzare un XPBS per lavare le sezioni a temperatura ambiente tre volte per 10 minuti, protette dalla luce. Montare i vetrini in un mezzo antiossidante posizionando due gocce di mezzo su ciascuna estremità del vetrino e coprire con un coprioggetto. Utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i coprioggetti.Conservare a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce, fino al momento dell'acquisizione dell'immagine. Utilizzando un obiettivo 4x e la fluorescenza laser, individuare il campione e l'area di interesse. Acquisire l'immagine da utilizzare come mappa.Quando si esegue l'immagine a ingrandimento elevato, rimuovere la piastrina apportando il minor numero possibile di regolazioni alla piastra portapreparati. Quindi passare a un obiettivo ad immersione in olio da 60x.Posizionare una piccola goccia di olio sull'obiettivo e reinserire il vetrino sul portavetrino. Successivamente, ritrovare il campione, impostare la potenza del laser, il tempo di esposizione e il binning ai livelli desiderati per ogni canale. Una volta determinate le impostazioni ottimali secondo le indicazioni del protocollo testuale, utilizzare tali impostazioni per tutte le sezioni di tessuto all'interno dell'esperimento.Utilizzare l'istogramma di intensità per annotare l'intervallo di intensità ottimale per ogni canale, che verrà utilizzato per l'analisi. Generare un Zack utilizzando la funzione di acquisizione selezionando i canali laser appropriati. Quindi scegliere i limiti superiore e inferiore dello stack Z.Scegliere una dimensione del passo Zack pari alla metà del valore dello spessore della sezione ottica fornito dal software. Fare clic su esegui per acquisire le immagini utilizzando Fiji o un programma equivalente per l'analisi delle immagini. Aprire il file Zack con un'opzione di modalità colore personalizzata e i canali suddivisi in finestre separate.Dal menu a discesa dell'immagine, aprire lo strumento di regolazione di luminosità e contrasto e, all'interno di ogni canale, impostare l'intervallo di intensità ottimale dell'istogramma. Come determinato in precedenza, applicare questi intervalli di canale a tutti i Zacks da analizzare. Quindi, dal menu a discesa del colore dell'immagine, unire i singoli canali in un'unica immagine composita.Utilizzando il menu Immagine Stacks Proiezione Z, crea una proiezione Z appiattita a partire dall'immagine composita. Poiché questa immagine sarà significativamente più luminosa rispetto all'immagine 3D, regola l'intervallo di intensità dell'istogramma per il campione di controllo per evitare la sovrasaturazione e applica le stesse impostazioni all'immagine sperimentale appiattita di Z. Per generare un'immagine 3D, seleziona innanzitutto il menu Immagini Stacks Proiezione 3D. Scegli l'asse x o l'asse y di rotazione.Impostare la distanza tra le sezioni sullo stesso numero di micron della dimensione del passo dello stack Z. Scegliere la rotazione totale desiderata e impostare l'incremento dell'angolo di rotazione su uno. Quindi aprire il visualizzatore 3D di ImageJ dal menu a discesa plugin.Scegliere la visualizzazione dell'immagine composita come volume e impostare il fattore di ricampionamento a uno o due. Queste figure mostrano risultati tipici per la colorazione di costrizione di diverse proteine in un cuore congelato rapidamente e in un cuore fissato con acetone; l'anticorpo contro l'alfa-actinina S ha etichettato in modo riproducibile i dischi Z e i dischi intercalari con elevata specificità e fondo minimo. L'anticorpo contro la proteina delle giunzioni di adesione beta-catenina si è legato alla membrana sia delle cellule cardiomiocitarie che non cardiomiocitarie, e la codistribuzione con l'alfa-actinina S si è verificata nei dischi intercalari presumibilmente presenti a E16,5. L'immunofluorescenza per l'integrina beta-1 nel cuore embrionale è particolarmente complessa, ma la colorazione per l'integrina beta-1 in questi studi ha rivelato un segnale con la stessa periodicità dei dischi Z etichettati dall'alfa-actinina S, il che potrebbe riflettere la formazione di strutture costameriche nascenti a E16,5.A E 12,5, il pattern di colorazione dell'alfa-actinina e della tropomiosina mostrava una periodicità regolare nei cardiomiociti trabecolari, compatibile con miofibrille mature nella zona compatta esterna; l'alfa-actinina presentava un aspetto più puntiforme che lineare e il segnale della tropomiosina era diffuso piuttosto che lineare. La colorazione aderente alla NCA e i cardiomiociti trabecolari nei cuori a E 12,5 co-localizzavano con aree di intensa colorazione dell'alfa-actinina, probabilmente rappresentanti i dischi intercalari. Qui è mostrato un cuore embrionale fissato con PFA a E 12,5 marcato per l'alfa-actinina e l'actina filamentosa da un topo transgenico life act RFP Ruby. Il rapporto segnale-rumore dell'alfa-actina era ridotto rispetto a sezioni di cuore congelate rapidamente.La ricostruzione tridimensionale delle immagini ha rivelato che i MyFi all'interno di un cardiomiocita erano approssimativamente paralleli tra loro, ma singoli cardiomiociti erano orientati a angoli diversi l'uno rispetto all'altro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come orientare correttamente e sezionare congelando cuori embrionali, nonché eseguire una colorazione immunoistochimica, microscopia confocale e analisi delle immagini per valutare la maturazione dei MyFi e dei cardiomiociti durante lo sviluppo del cuore del topo.Admit.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un modo rapido per condurre immunocolorazione cuore embrionale di zebrafish è descritto. Rispetto alla intero approccio immunostaining monte, questo metodo aumenta notevolmente la penetrazione degli anticorpi, che permette di ottenere immagini ad alta risoluzione che mostrano strutture cellulari / subcellulari nel cuore entro un tempo di elaborazione molto più ridotto.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Descriviamo una serie di metodi per iniettare coloranti, vettori di DNA, virus e cellule per monitorare sia destino cellulare e fenotipo di cellule endogene e innestate derivate da cellule embrionali o pluripotenti entro embrioni di topo al giorno embrionale (E) 9.5 e fasi successive di sviluppo.

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Descriviamo un protocollo per visualizzare volumetricamente cellule marcate con proteine fluorescenti in profondità all'interno di cuori embrionali e postnatali intatti. Utilizzando metodi di pulizia dei tessuti in combinazione con la colorazione dell'intera montatura, è possibile visualizzare in modo chiaro e accurato singole cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di un cuore embrionale o postnatale.

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Vi presentiamo un protocollo per l'analisi dei vasi coronarici, in tutto cuori murini embrionali fino a E15.5, usando metodi di colorazione immunologici standard, seguiti da gioco ottica e la microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione dei vasi sanguigni durante tutto cuore senza la necessità di analizzare tempo di sezioni seriali.

Analisi dei vasi coronarici in sgomberati cuori embrionali

Per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti, presentiamo protocolli che utilizzano due linee di topi transgenici: Myh6-H2B-mCh topi transgenici, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Qui, descriviamo un protocollo per immunofluorescenza intero supporto e basate su immagine quantitativa analisi volumetrica degli embrioni del mouse in fase precoce. Presentiamo questa tecnica come un potente approccio qualitativamente e quantitativamente valutare strutture cardiache durante lo sviluppo e proponiamo che possa essere ampiamente adattabile ad altri sistemi dell'organo.

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.

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In questo metodo, tessuti cardiaci embrionali sono chirurgicamente microdissected, dissociato, fluorescente etichettati e impiantati nei tessuti embrionali dell'ospite. Questo fornisce una piattaforma per lo studio dell'organizzazione inerente allo sviluppo livello individuale o tessuto ectopiche condizioni emodinamiche, e/o alterati paracrine/juxtacrine ambienti.

Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Vi presentiamo i protocolli per esaminare lo sviluppo del cuore del mouse usando la microscopia intero Monte epifluorescente su embrioni di topo sezionati da ventricolare specifico MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in. Questo metodo permette di visualizzare direttamente ogni fase della formazione ventricolare durante lo sviluppo del cuore del mouse senza laboriosi metodi istochimici.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

Presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura e l'imaging di embrioni di topo che consente l'imaging 3D + tempo delle cellule progenitrici cardiache. Questo video-toolkit affronta le competenze chiave necessarie per immagini live di successo altrimenti difficili da acquisire da pubblicazioni di solo testo.

Imaging dal vivo dei primi progenitori cardiaci nell'embrione di topo

Impara a valutare la maturazione dei cardiomiociti nel cuore embrionale di topo usando immunofluorescenza e microscopia confocale. Questo metodo permette di analizzare lo sviluppo delle miofibrille e delle strutture cardiache ad alta risoluzione.

Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

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