Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la maturazione miofiale e cardiomiocitaria nel cuore embrionale di topo in via di sviluppo. Ciò si ottiene orientando e congelando prima il cuore embrionale nel mezzo di taglio. Successivamente, il cuore viene criosezionato nell'orientamento corretto.

Quindi le sezioni cardiache vengono sottoposte a marcatura immunofluorescente delle proteine di interesse. Infine, viene eseguita la microscopia confocale di sezioni cardiache immunocolorate. In definitiva, vengono utilizzate analisi di immagini bidimensionali e tridimensionali per mostrare lo sviluppo di MyFi e di altre strutture cardiomiocitarie.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo cardiaco, come ad esempio il modo in cui le mutazioni e i geni cardiaci influenzano l'assemblaggio di MyFi e l'emergere di strutture specifiche come i dischi interati e i clienti. Per congelare i cuori embrionali, utilizzare la temperatura di taglio ottimale o il mezzo OCT per riempire una capsula di Petri di 3,5 centimetri in una cappa chimica. Bello. Due metilbutano in azoto liquido.

Dopo aver isolato i cuori embrionali di topo secondo il protocollo di testo, posizionare i cuori nell'OCT e lasciarli equilibrare per alcuni secondi prima di trasferirli in uno stampo da sette millimetri contenente OCT. Orientare la parete interna del cuore verso il fondo dello stampo. Posizionare delicatamente lo stampo nel due metilbutano raffreddato con azoto liquido.

Fare attenzione a non lasciare che i due liquidi metilbutano tocchino l'OCT o il cuore si congeli fino a quando l'OCT non diventa bianco solido. Quindi trasferisci lo stampo in un secchiello per il ghiaccio contenente ghiaccio secco. Dopo che tutti i cuori sono stati congelati, avvolgere gli stampi criogenici in un foglio e conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino al momento della criosezione.

Per riparare i cuori embrionali, utilizzare il 4% di PFA in PBS per riempire i pozzetti di una piastra di coltura a 12 fogli. Dopo aver sezionato i cuori embrionali secondo il protocollo di testo, posizionare ciascun cuore in un pozzetto di PFA e fissarlo a quattro gradi Celsius durante la notte Per crioproteggere i cuori utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, spostare ciascun cuore in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 1,5 millilitri di saccarosio al 15% in PBS e agitare delicatamente a quattro gradi Celsius fino a quando il cuore non affonda sul fondo della provetta. Trasferire ogni cuore al 30% di saccarosio in PBS e agitare delicatamente a quattro gradi Celsius fino a quando il cuore non affonda sul fondo del tubo.

Congelare gli embrioni nell'OCT come dimostrato in precedenza in questo video. Dopo aver posizionato gli stampi criogenici nella camera del criostato e aver equiparato a 17 gradi Celsius negativi, capovolgere lo stampo criogenico e esercitare una leggera pressione per espellere il blocco cardiaco dallo stampo. Orientare la parete anteriore del cuore verso la parte superiore del blocco di tessuto modellato.

Posizionare una grossa goccia di OCT sul mandrino e montare il blocco cardiaco sulla goccia OCT. Mantenere l'orientamento in modo tale che la parete anteriore del cuore sia la più lontana dal mandrino. Lasciare che il cuore si congeli sul mandrino.

Caricare il mandrino e il blocco cardiaco montato sul portaoggetti del criostato. Regolare in modo che l'angolo della lama sia compreso tra tre e cinque gradi rispetto al campione. Raccogliere 10 sezioni micrometriche su vetrini da microscopio che sono stati pretrattati con un rivestimento caricato positivamente.

Lasciare asciugare completamente i campioni prima di conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per eseguire l'immunofluorescenza. Dopo aver fissato e/o rimosso l'OCT dalle sezioni, utilizzare un tampone bloccante diluito in PBS per bloccare per 45 minuti agitando delicatamente. Se si utilizza un anticorpo primario generato nel topo, aggiungere un frammento di FAB monovalente IgG H più L di asino o capra diluito da uno a 100 in PBS 0,1% tra 20 e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti agitando delicatamente.

Aggiungere l'anticorpo primario o gli anticorpi diluiti in un tampone x bloccante e incubare per due ore a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, utilizzare un XPBS per lavare le sezioni tre volte per 10 minuti. A temperatura ambiente l'anticorpo secondario coniugato con addor diluito da uno a 500 in tampone bloccante sui campioni e incubato al riparo dalla luce per due ore.

A temperatura ambiente, utilizzare un XPBS per lavare le sezioni a temperatura ambiente tre volte per 10 minuti al riparo dalla luce. Montare le diapositive a mezzo antisbiadimento posizionando due gocce di terreno su ciascuna estremità della diapositiva e utilizzare un vetrino coprioggetti per coprire. Usa lo smalto per sigillare i vetrini coprioggetti.

Conservalo a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce fino al momento dell'immagine. Utilizzando un obiettivo quattro x e la fluorescenza laser, è possibile individuare il campione e l'area di interesse. Cattura l'immagine da utilizzare come mappa.

Quando si esegue l'imaging ad alto ingrandimento. Rimuovere la diapositiva apportando regolazioni minime al tavolino della diapositiva. Quindi passare a un obiettivo a immersione in olio 60x.

Mettere una piccola goccia di olio sull'obiettivo e riposizionare il vetrino sul tavolino del vetrino. Quindi, trova di nuovo il campione, imposta il tempo di esposizione alla potenza del laser e il binning ai livelli desiderati per ciascun canale. Una volta determinate le impostazioni ottimali in base alle linee guida del protocollo di testo, utilizzare le impostazioni del campione per tutte le sezioni di tessuto all'interno dell'esperimento.

Utilizzare l'istogramma dell'intensità per annotare l'intervallo di intensità ottimale per ciascun canale, che verrà utilizzato per l'analisi. Genera uno Zack utilizzando la funzione di acquisizione selezionando i canali laser appropriati. Quindi scegli i limiti superiore e inferiore della pila Z.

Scegliere una dimensione del passo Zack che sia la metà del valore dello spessore della fetta ottica fornita dal software. Fare clic su Esegui per raccogliere le immagini utilizzando Fiji o un programma simile per l'analisi delle immagini. Apri il file Zack con un'opzione di modalità colore personalizzata e i canali divisi in finestre separate.

Dal menu a discesa dell'immagine, apri lo strumento di regolazione del contrasto della luminosità e all'interno di ciascun canale imposta l'intervallo di intensità ottimale dell'istogramma. Come determinato in precedenza, applicare questi intervalli di canali a tutti gli Zack analizzati. Quindi, dal colore dell'immagine, menu a discesa, unire i singoli canali in un'unica immagine composita.

Utilizzando il menu progetto Pile di immagini Z, create una pila Z appiattita dall'immagine composita. Poiché questa immagine sarà significativamente più luminosa dell'immagine 3D, regolare l'intervallo di intensità dell'istogramma per il campione di controllo per evitare la sovrasaturazione e applicare le stesse impostazioni allo Zack appiattito sperimentale Per generare un'immagine 3D, scegliere prima il menu del progetto 3D delle pile di immagini. Scegliere l'asse x o l'asse y di rotazione.

Imposta la spaziatura delle fette allo stesso numero di micron della dimensione del passo della pila Z. Scegliere la rotazione totale desiderata e impostare l'incremento dell'angolo di rotazione su uno. Quindi apri il visualizzatore 3D dell'immagine J dal menu a discesa dei plug-in.

Scegliere la visualizzazione dell'immagine composita generata come volume e impostare il fattore di ricampionamento su uno o due. Queste cifre mostrano risultati tipici per la colorazione con cos di diverse proteine in un digiuno congelato, in un cuore fissato con acetone, nell'anticorpo contro i dischi Z marcati in modo riproducibile con actina S alfa e in dischi interati con elevata specificità e fondo minimo. L'anticorpo contro la proteina della giunzione di aderenza beta-catenina ha legato la membrana sia dei cardiomiociti che delle cellule non cardiomiocitarie e la colocalizzazione con l'actinina SFA si è verificata in presunti dischi interati a E 16,5 beta uno L'immunofluorescenza dell'integrina nel cuore embrionale è particolarmente impegnativa, ma la colorazione dell'integrina beta uno in questi studi ha rivelato un segnale con la stessa periodicità dei dischi Z marcati con actina SFA, forse riflettendo i costanti nascenti che si formano a E 16,5.

A E 12.5, il pattern di colorazione dell'actinina SFA e della tropomicina ha mostrato una periodicità regolare nei cardiomiociti trabecolari coerenti con miofibrille mature nella zona compatta esterna L'actinina SFA era più puntata che lineare e il segnale della tropomiosina era diffuso piuttosto che lineare con colorazione aderente NCA e cardiomiociti trabecolari a cuori E 12.5 colocalizzati con aree di intensa colorazione dell'actinina SFA che probabilmente rappresentavano dischi interati. Qui è mostrato un cuore embrionale E 12.5 fissato in PFA marcato per l'actinina SFA e l'acton filamentoso da un topo transgenico Ruby RFP life act. Il rapporto tra actina segnalata SFA e rumore è diminuito rispetto alle sezioni di cuore congelate a scatto.

ricostruzione tridimensionale dell'immagine ha rivelato che i MyFi all'interno di un cardiomiocita erano approssimativamente paralleli l'uno all'altro, ma i singoli cardiomiociti erano orientati ad angoli variabili l'uno rispetto all'altro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come orientare correttamente e criosezionare i cuori embrionali, nonché eseguire la colorazione immunologica, la microscopia confocale e l'analisi delle immagini per valutare MyFi e la maturazione dei cardiomiociti durante lo sviluppo del cuore del topo. Ammettere.