Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la maturazione delle fibre miocardiche e dei cardiomiociti nel cuore embrionale di topo in via di sviluppo. Questo viene ottenuto innanzitutto orientando e congelando il cuore embrionale in un mezzo di taglio. Successivamente, il cuore viene sottoposto a sezione criostatica nell'orientamento corretto.

Successivamente, le sezioni cardiache vengono sottoposte a marcatura immunofluorescente delle proteine di interesse. Infine, viene eseguita la microscopia confocale delle sezioni cardiache immunoistochimiche. In ultima analisi, analisi dell'immagine bidimensionali e tridimensionali sono utilizzate per mostrare lo sviluppo dei MiFi e di altre strutture dei cardiomiociti.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo cardiaco, ad esempio in che modo le mutazioni e i geni cardiaci influenzano l'assemblaggio delle miofibrille e la formazione di strutture specifiche come i dischi intercalati e i costameri. Per congelare rapidamente i cuori embrionali, utilizzare un mezzo OCT (optimal cutting temperature) per riempire una piastra di Petri da 3,5 centimetri in una cappa chimica. Raffreddare il 2-metilbutano in azoto liquido.

Dopo aver isolato i cuori embrionali di topo seguendo il protocollo descritto nel testo, posizionare i cuori nell'OCT e lasciarli equilibrare per alcuni secondi prima di trasferirli in uno stampo di sette millimetri contenente OCT. Orientare la parete interna del cuore verso il fondo dello stampo. Posizionare delicatamente lo stampo nel butano dimetilico raffreddato con azoto liquido.

Avendo cura di non far toccare ai due liquidi di metilbutano l'OCT o il cuore fino a quando l'OCT non diventa bianco solido. Successivamente trasferire lo stampo in un contenitore di ghiaccio secco. Dopo aver congelato tutti i cuori, avvolgere gli stampi criogenici nella pellicola di alluminio e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento della criosezionatura.

Per fissare i cuori embrionali, utilizzare PFA al 4% in PBS per riempire le pozzette di una piastra da coltura a 12 pozzette. Dopo aver dissezionato i cuori embrionali seguendo il protocollo descritto nel testo, posizionare ciascun cuore in una pozzetta contenente PFA e fissare a quattro gradi Celsius durante la notte. Per proteggere i cuori criogenicamente, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, spostare ciascun cuore in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 1,5 millilitri di saccarosio al 15% in PBS e agitare delicatamente a quattro gradi Celsius finché il cuore non affonda sul fondo della provetta. Trasferire quindi ciascun cuore in saccarosio al 30% in PBS e agitare delicatamente a quattro gradi Celsius finché il cuore non affonda sul fondo della provetta.

Congelare gli embrioni in OCT come dimostrato precedentemente in questo video. Dopo aver posizionato gli stampi criogenici nella camera del criostato e aver raggiunto la temperatura di meno 17 gradi Celsius, capovolgere lo stampo criogenico ed esercitare una leggera pressione per espellere il blocco cardiaco dallo stampo. Orientare la parete anteriore del cuore verso la parte superiore del blocco di tessuto modellato.

Posizionare una grossa goccia di OCT sul mandrino e montare il blocco cardiaco sulla goccia di OCT. Mantenere l'orientamento in modo che la parete anteriore del cuore sia la più lontana dal mandrino. Lasciare congelare il cuore sul mandrino.

Caricare il mandrino e il blocco cardiaco montato sul supporto dell'oggetto del criostato. Regolare in modo che l'angolo della lama sia compreso tra tre e cinque gradi rispetto al campione. Raccogliere sezioni di 10 micrometri su vetrini precedentemente trattati con un rivestimento carico positivamente.

Lasciare asciugare completamente i campioni prima di conservarli a meno 80 gradi Celsius per eseguire l'immunofluorescenza. Dopo la fissazione e/o la rimozione dell'OCT dalle sezioni, utilizzare un tampone bloccante 1x diluito in PBS per bloccare per 45 minuti con agitazione delicata. Se si utilizza un anticorpo primario prodotto in topo, aggiungere un frammento monovalente FAB di IgG anti-topo da asino o capra H più L, diluito 1 a 100 in PBS 0,1% tween 20, e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti con agitazione delicata.

Aggiungere l'anticorpo primario o gli anticorpi diluiti in un volume di buffer bloccante e incubare per due ore a temperatura ambiente oppure a quattro gradi Celsius durante la notte. Al termine dell'incubazione, utilizzare un volume di PBS 1x per lavare le sezioni tre volte per 10 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere l'anticorpo secondario coniugato, diluito 1:500 in buffer bloccante, ai campioni e incubare al buio per due ore.

A temperatura ambiente, utilizzare un XPBS per lavare le sezioni a temperatura ambiente tre volte per 10 minuti, protette dalla luce. Montare i vetrini in un mezzo antiossidante posizionando due gocce di mezzo su ciascuna estremità del vetrino e coprire con un coprioggetto. Utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i coprioggetti.

Conservare a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce, fino al momento dell'acquisizione dell'immagine. Utilizzando un obiettivo 4x e la fluorescenza laser, individuare il campione e l'area di interesse. Acquisire l'immagine da utilizzare come mappa.

Quando si esegue l'immagine a ingrandimento elevato, rimuovere la piastrina apportando il minor numero possibile di regolazioni alla piastra portapreparati. Quindi passare a un obiettivo ad immersione in olio da 60x.

Posizionare una piccola goccia di olio sull'obiettivo e reinserire il vetrino sul portavetrino. Successivamente, ritrovare il campione, impostare la potenza del laser, il tempo di esposizione e il binning ai livelli desiderati per ogni canale. Una volta determinate le impostazioni ottimali secondo le indicazioni del protocollo testuale, utilizzare tali impostazioni per tutte le sezioni di tessuto all'interno dell'esperimento.

Utilizzare l'istogramma di intensità per annotare l'intervallo di intensità ottimale per ogni canale, che verrà utilizzato per l'analisi. Generare un Zack utilizzando la funzione di acquisizione selezionando i canali laser appropriati. Quindi scegliere i limiti superiore e inferiore dello stack Z.

Scegliere una dimensione del passo Zack pari alla metà del valore dello spessore della sezione ottica fornito dal software. Fare clic su esegui per acquisire le immagini utilizzando Fiji o un programma equivalente per l'analisi delle immagini. Aprire il file Zack con un'opzione di modalità colore personalizzata e i canali suddivisi in finestre separate.

Dal menu a discesa dell'immagine, aprire lo strumento di regolazione di luminosità e contrasto e, all'interno di ogni canale, impostare l'intervallo di intensità ottimale dell'istogramma. Come determinato in precedenza, applicare questi intervalli di canale a tutti i Zacks da analizzare. Quindi, dal menu a discesa del colore dell'immagine, unire i singoli canali in un'unica immagine composita.

Utilizzando il menu Immagine Stacks Proiezione Z, crea una proiezione Z appiattita a partire dall'immagine composita. Poiché questa immagine sarà significativamente più luminosa rispetto all'immagine 3D, regola l'intervallo di intensità dell'istogramma per il campione di controllo per evitare la sovrasaturazione e applica le stesse impostazioni all'immagine sperimentale appiattita di Z. Per generare un'immagine 3D, seleziona innanzitutto il menu Immagini Stacks Proiezione 3D. Scegli l'asse x o l'asse y di rotazione.

Impostare la distanza tra le sezioni sullo stesso numero di micron della dimensione del passo dello stack Z. Scegliere la rotazione totale desiderata e impostare l'incremento dell'angolo di rotazione su uno. Quindi aprire il visualizzatore 3D di ImageJ dal menu a discesa plugin.

Scegliere la visualizzazione dell'immagine composita come volume e impostare il fattore di ricampionamento a uno o due. Queste figure mostrano risultati tipici per la colorazione di costrizione di diverse proteine in un cuore congelato rapidamente e in un cuore fissato con acetone; l'anticorpo contro l'alfa-actinina S ha etichettato in modo riproducibile i dischi Z e i dischi intercalari con elevata specificità e fondo minimo. L'anticorpo contro la proteina delle giunzioni di adesione beta-catenina si è legato alla membrana sia delle cellule cardiomiocitarie che non cardiomiocitarie, e la codistribuzione con l'alfa-actinina S si è verificata nei dischi intercalari presumibilmente presenti a E16,5. L'immunofluorescenza per l'integrina beta-1 nel cuore embrionale è particolarmente complessa, ma la colorazione per l'integrina beta-1 in questi studi ha rivelato un segnale con la stessa periodicità dei dischi Z etichettati dall'alfa-actinina S, il che potrebbe riflettere la formazione di strutture costameriche nascenti a E16,5.

A E 12,5, il pattern di colorazione dell'alfa-actinina e della tropomiosina mostrava una periodicità regolare nei cardiomiociti trabecolari, compatibile con miofibrille mature nella zona compatta esterna; l'alfa-actinina presentava un aspetto più puntiforme che lineare e il segnale della tropomiosina era diffuso piuttosto che lineare. La colorazione aderente alla NCA e i cardiomiociti trabecolari nei cuori a E 12,5 co-localizzavano con aree di intensa colorazione dell'alfa-actinina, probabilmente rappresentanti i dischi intercalari. Qui è mostrato un cuore embrionale fissato con PFA a E 12,5 marcato per l'alfa-actinina e l'actina filamentosa da un topo transgenico life act RFP Ruby. Il rapporto segnale-rumore dell'alfa-actina era ridotto rispetto a sezioni di cuore congelate rapidamente.

La ricostruzione tridimensionale delle immagini ha rivelato che i MyFi all'interno di un cardiomiocita erano approssimativamente paralleli tra loro, ma singoli cardiomiociti erano orientati a angoli diversi l'uno rispetto all'altro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come orientare correttamente e sezionare congelando cuori embrionali, nonché eseguire una colorazione immunoistochimica, microscopia confocale e analisi delle immagini per valutare la maturazione dei MyFi e dei cardiomiociti durante lo sviluppo del cuore del topo.Admit.