Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trasfettare in modo affidabile i macrofagi THP uno umani con un'elevata vitalità cellulare e nessuna attivazione cellulare. Ciò si ottiene pre-differenziando prima i monociti THP 1 per 48 ore. Il secondo passo della procedura consiste nel staccare i macrofagi prematuri di TP one.

Il terzo passo consiste nel trasfettare le cellule con IRNA o DNA plasmidico, utilizzando la tecnologia dei fattori nucleo di lonza. I passaggi finali consistono nel riseminare e differenziare ulteriormente le cellule. In definitiva, il successo del knockdown o della sovraespressione genica può essere dimostrato attraverso la PCR quantitativa in tempo reale, il Western blot back e così via.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci di trasfezione come la lipofezione, è che possiamo ottenere un'elevata efficienza di trasfezione insieme a un'elevata vitalità cellulare e che non alteriamo la funzione e il comportamento dei microfagi. Sfortunatamente, questa tecnica non è adatta per applicazioni ad alta sput, in quanto non è possibile eseguire un transfetto più intenso alla volta per questo protocollo. Hanno coltivato cellule THP 1 in RPMI 1640 con il 10% di FCS e con l'1% di glutammina L strep pen 24 ore prima della trasfezione, hanno diviso le cellule e fornito loro terreni freschi.

Il giorno dopo. Pre-differenziare le cellule seminando da 10 a 15 milioni di cellule in un pallone di tessuto di 75 centimetri quadrati con le seguenti aggiunte al terreno RPMI integrato, 1% di aminoacidi non essenziali, 1% di piruvato di sodio, 10 nanogrammi per millilitro, PMA e 50 micromolari di beta mercaptoetanolo dopo 48 ore, aspirare il terreno e sostituirlo con sei millilitri di Accutane. Uno si è riscaldato a 37 gradi Celsius per staccare le cellule.

Incubarli per 30 minuti durante l'incubazione. Preparare un mezzo di trasfezione e un terreno di coltura sufficienti per la cura dell'affetto post nucleo delle cellule. Dopo 30 minuti, controlla che le celle siano staccate e guardati intorno.

Se alcune cellule sono ancora attaccate, pompare delicatamente il matraccio con una micropipetta o utilizzare una semplice agitazione per staccarle. Non utilizzare un raschietto. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 millilitri e centrifugarla per cinque minuti a 300 Gs e a temperatura ambiente, rimuovere il surnatante per aspirazione e risospendere il pellet di cellule.

In un millilitro di RPMI, preriscaldare a 37 gradi Celsius, contare le cellule e fare micro aliquote di provette di rifiuto contenenti da due a due milioni e mezzo di cellule per la trasfezione immediata. Una rapida esecuzione di questo protocollo è essenziale. Per evitare la perdita di mortalità cellulare, assicurarsi di avere tutti i materiali preparati in anticipo Prima centrifuga, tutte le aliquote di trasfezione per 10 minuti a 250 GS e a temperatura ambiente mentre stanno girando, caricare tutti i veterinari effettori del nucleo con mezzo microgrammo di DNA plasmidico o un microgrammo di RNA SI Utilizzare una diluizione altamente concentrata in modo che occupino un volume minimo del veterinario.

Ora aspirare il surnatante da una sola delle aliquote cellulari resus. Sospendere le cellule a 100 microlitri in soluzione di fattore di nucleo. Non lasciare che le cellule rimangano esposte alla soluzione per più di 15 minuti.

Trasferire le cellule al Q vet e mescolarle picchiettando delicatamente. Quindi trasfettare le cellule utilizzando il programma Y 0 0 1 su un fattore di nucleo B modello due. Utilizzando una pipetta monouso, spostare le cellule elettroporate in una fiala di reazione e aggiungere immediatamente mezzo millilitro di terreno di trasfezione preavvertito alle cellule.

Ora continua a ripetere il processo con ogni aliquota di celle una per una fino a quando non sono tutte trasfettate. Dopo aver completato l'affezione del nucleo, trasferire ogni trasfezione di cellule in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti con 2,5 millilitri di terreno di trasfezione caldo. Mescolare accuratamente ogni pozzetto con una micropipetta.

Dopo aver lasciato incubare tutte le piastre caricate per quattro ore, controllare lo stato delle cellule al microscopio. Dopo quattro ore, la maggior parte delle cellule deve essere fatta aderire alla piastra, se necessario. Al massimo.

Un'altra ora di incubazione fornirà sufficiente sahe lavorando un pozzetto alla volta. Aspirare il terreno di trasfezione dalle cellule aderenti e sostituirlo con un volume uguale di terreno di coltura caldo. Fare attenzione a evitare di staccare le celle durante questo passaggio.

Ora, incuba le cellule per tutto il tempo necessario. Se necessario, sostituire il terreno ogni 48 ore, pianificare l'applicazione dei trattamenti in modo che terminino quando il DNA o l'RNA trasfettato è al suo massimo effetto. Quando si trattano le cellule con effettori, utilizzare un terreno privo di siero senza PMA e senza beta mercaptoetanolo.

Fare attenzione a non lasciare che le cellule incubino per più di 24 ore senza siero. Il protocollo è stato utilizzato per trasfettare, è stato valutato il THP uno macrofagi con morfologia cellulare IRNA. Secondo la misurazione citofluorimetrica.

Il tasso di apoptosi e necrosi nelle cellule era basso sia nelle colture trasfettate che in quelle di controllo. Tuttavia, conteggi accurati hanno rivelato che sia l'apoptosi che la necrosi erano leggermente più alte per i campioni trasfettati. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che i macrofagi THP 1 trasfettati erano più difficili da staccare dalle piastre rispetto alle cellule trasfettate UNT.

Nel complesso, i tassi di trasfezione sono stati superiori al 90% analizzati mediante citometria a flusso. L'uso della trasfezione fluorescente S-I-R-N-A è stato confermato anche dalla microscopia a fluorescenza. La funzionalità della trasfezione è stata dimostrata dal knockdown genetico dell'espressione di IL 10 RB.

Utilizzo di RNA interferente corto Una volta padroneggiato, il trasfetto può essere eseguito in un'ora o un'ora e mezza se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il mezzo di coltura ha una notevole influenza sulle prestazioni. Questo è delineato nel protocollo di testo.