Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di abbattere l'espressione genica bersaglio nella MDD mediante trasfezione dell'RNA SI. Ciò si ottiene programmando prima l'effettuatore AM Maxin Nucleo. La seconda fase della procedura consiste nel mescolare insieme DCS e siRNA e pipettare la soluzione cellulare risultante nei moduli Nucleo QVE.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel posizionare la piastra nel vassoio navetta amaxa per iniziare il processo di trasfezione. La fase finale della procedura consiste nell'infettare le cellule con il virus per attivare la risposta all'interferone. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano il knockdown genico attraverso la R-T-P-C-R quantitativa e il Western blotting.

Questa tecnica è preziosa per caratterizzare le vie di segnalazione nelle cellule dendretiche e può contribuire allo sviluppo di terapie immunitarie basate su cellule dendretiche. Per programmare il fattore di nucleo shuttle a pozzetti Maxon 96 per la trasfezione DC, aprire un nuovo file di parametri. Seleziona il numero di pozzetti che utilizzerai per la trasfezione standard trascinando il cursore sul diagramma della piastra a 96 pozzetti.

Utilizzare un minimo di tre pozzetti per raggruppare ogni campione sperimentale. Ora inserisci il codice del programma nella prima parte, seleziona F, F e i nella seconda parte, seleziona 1 68 dai menu a discesa. Quindi, dalla casella della soluzione, selezionare monocita umano successivo sotto l'opzione di controllo, selezionare standard, quindi fare clic su Applica.

Per includere un controllo di non trasfezione, è necessario selezionare pozzetti aggiuntivi dal diagramma. Quindi, dall'opzione di controllo, scegli nessun controllo del programma e fai nuovamente clic su Applica. Dopo aver mescolato la soluzione di nucleo affection, lasciarla riscaldare a temperatura ambiente.

Posizionare il numero di moduli nucleo vete necessari nella piastra nucleo VETE con l'orientamento corretto, come mostrato qui, inserendo il primo nella rosa uno e due e poi così via per tutti i tubi successivi. Trasferire una quantità sufficiente di MDD da un pallone di coltura cellulare in una provetta da 50 millilitri per avere 500.000 cellule per pozzetto per la trasfezione, centrifugare le cellule per 10 minuti a 400 G a quattro gradi Celsius e quindi rimuovere con cura il surnatante. Quindi, aggiungere la soluzione di affezione nucleare alla provetta e quindi risospendere il MDD pipettandolo delicatamente su e giù alcune volte.

Ora etichettare le provette DPH in base al trattamento specifico da eseguire, quindi dividere le cellule risospese nelle provette etichettate. Aggiungere l'RNA SI a una concentrazione finale di 0,25 microgrammi per 500.000 cellule nelle provette epiendorf appropriate, quindi miscelare le sospensioni cellulari mediante pipettaggio. Utilizzare RNA SI non bersaglio per il campione di controllo senza trasfezione.

Quindi, pipettare 20 microlitri della sospensione cellulare SI RA DC nei moduli nucleo vete secondo il layout sperimentale precedentemente programmato, assicurandosi che il liquido venga erogato sul fondo del pozzetto, coprire la piastra nucleo vete con un coperchio e picchiettare la piastra su una superficie dura alcune volte per facilitare la rimozione delle bolle d'aria per trasfettare la dcs. Inserire la piastra Yvette preparata nel vassoio shuttle a 96 pozzetti dell'effettore nucleo. Quindi fare clic sul pulsante di caricamento e avvio.

Segui l'avanzamento del processo di trasfezione sul display. Una croce nera su sfondo verde indica una trasfezione riuscita in quel pozzo, mentre una barra nera su sfondo rosso significa che non è riuscita mentre le celle vengono trasfettate. Al termine del processo di trasfezione, rimuovere la piastra e aggiungere 80 microlitri di terreno di crescita CC preriscaldato a ciascun pozzetto.

Utilizzando una pipetta multicanale, incubare la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Durante il periodo di incubazione, aggiungere 100 microlitri del terreno di crescita CC preriscaldato alle provette della matrice con lo stesso orientamento della piastra per cuvetta nucleo. Dopo il periodo di incubazione, trasferire tutti i 100 microlitri di sospensioni cellulari dal nucleo CVE nelle provette a matrice predisposte.

Quindi rimuovere e scartare quei tubi in cui non si è verificata la trasfezione. Infine, incubare le provette della matrice per 24 ore o per un altro intervallo di tempo desiderato. Etichettare le provette einor per ciascuna delle provette della matrice di incubazione.

Quindi trasferire le provette della matrice dall'incubatore a una cappa di coltura cellulare e raggruppare le provette della matrice per ciascun campione sperimentale nell'eend dfs pre-marcato. Quindi, pellettare delicatamente le cellule facendo girare le provette DPH in una centrifuga da tavolo per 10 minuti. A 400 G, rimuovere la snat e risospendere le cellule nel terreno di crescita libero del siero contenente il virus della malattia di Newcastle o NDV a un MOI di uno liberamente.

Coprire le epiendorfine in modo sterile e poi incubare le provette per 45 minuti. Dopo questo periodo di incubazione, aggiungere 900 microlitri di terreno di coltura DC e incubare nuovamente le provette per altre 8-10 ore. Per raccogliere i dcs trasfettati e infetti.

Pellettare le cellule facendo girare le provette einor in una centrifuga da tavolo come prima e rimuovere il monocita snat dcs sono stati trasfettati con IRNA mirato a RIG I o irna glow non specifico e infettati con NDV come indicato da un segno più o sono rimasti non infetti come indicato da un segno meno come rilevato da un knockdown quantitativo R-T-P-C-R-A di R RGA del 75% A livello di trascrizione è stata osservata una riduzione simile nell'espressione di Interferone beta. È stato anche osservato un effettore a valle di RGA nella cascata di segnalazione dell'interferone. Inoltre, l'espressione dell'interferone beta nelle cellule trasfettate di controllo non infette non era rilevabile.

Mentre quello di MXA e del gene di risposta a valle dell'interferone beta era minimo. Qui. In questo esperimento sono mostrati i dati di una seconda trasfezione di MDD con irna mirato a rigi, eseguita come nella figura precedente. Tuttavia, tutte le cellule sono infettate da NDV ed è stato incorporato un ulteriore controllo utilizzando la DCS monocitaria non resecata.

I risultati del silenziamento genico sono stati simili a quelli osservati nella figura precedente. Un western blot sondato per la RGA ha rivelato che l'espressione proteica di questo gene era stata completamente bloccata. Le corsie uno e due mostrano i dati per i lisati provenienti da cellule non resecate.

Le corsie tre e quattro mostrano lisati da cellule trasfettate con irna fluorescente e le corsie cinque e sei mostrano lisati da cellule trasfettate con RIG I che ha come bersaglio S Irna Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora, compreso l'abbattimento di molti geni contemporaneamente.