Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trasfettare i costrutti dei rapporti di Luciferasi in cellule grezze 2, 6, 4, 0,7 senza attivare le cellule. Ciò si ottiene raccogliendo prima 2, 6, 4, 0,7 cellule grezze da una piastra madre mediante pipettaggio delicato e seminando le cellule in una piastra trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti. Il secondo passo è quello di trasfettare il rapporto di luciferasi Firefly del plasmide e il controllo ha eseguito il plasmide di luciferasi nelle cellule.

Questi plasmidi devono essere privi di endotossine. Successivamente, le cellule vengono stimolate con i trattamenti desiderati seguite da lisi cellulare e trasferite in una piastra bianca a 96 pozzetti con fondo trasparente. Il passaggio finale consiste nel testare l'attività della luciferasi della lucciola e quindi eseguire l'attività della luciferasi per calcolare il rapporto tra lucciola e lucciola.

In definitiva, la variazione di piega rispetto al controllo non stimolato viene utilizzata per mostrare l'effetto degli stimoli sul reporter di Lucifero, che è correlato al livello di espressione del gene di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la transezione notturna convenzionale, è che le cellule del transetto vengono mantenute al loro stato di riposo con danni minimi alle cellule. Il DNA del plaid da utilizzare per la trasfezione è stato precedentemente estratto utilizzando un maxi prep kit disponibile in commercio e risospeso in 500 microlitri di tampone.

Poiché la presenza del componente della parete cellulare batterica lipopolisaccaride o LPS interferisce con la trasfezione, i contaminanti batterici residui devono essere rimossi dal DNA in una cappa aspirante. Aggiungere 500 microlitri di alcol isoamilico fenil cloroformio al DNA plasmidico e agitare energicamente per 15 secondi. Prestare attenzione perché il fenolo provoca gravi ustioni cutanee.

Incubare la miscela per cinque minuti di centrifuga a temperatura ambiente a 13.000 volte G per 10 minuti di temperatura ambiente, trasferire 350 microlitri della fase acquosa superiore in una nuova provetta di raccolta da 1,5 millilitri. Aggiungere 350 microlitri di tampone TE alla provetta che contiene la fase organica inferiore. Agitare energicamente per 15 secondi.

Centrifugare a 13.000 volte G per cinque minuti. A temperatura ambiente trasferire 350 microlitri della fase acquosa superiore nella stessa provetta di raccolta da 1,5 millilitri. Aggiungere 70 microlitri di una soluzione di acetato di sodio e mescolare bene.

Aggiungere 700 microlitri di isopropanolo al 100%. Mescolare bene e incubare per 10 minuti di centrifuga a temperatura ambiente a 13.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il supinato e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% al pellet Vortex i campioni per mescolare e centrifugare a 5, 000 volte g per cinque minuti di quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante.

Il DNA plasmidico è nel pellet. Aprire il tappo del tubo e asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per cinque-10 minuti. Il pellet dovrebbe diventare traslucido.

Aggiungere 500 microlitri di tampone TE al pellet di DNA e scaldare a 50-60 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere il pellet di DNA. Infine, misurare l'assorbanza della sospensione di DNA a 260 nanometri e 280 nanometri con uno spettrometro. Per calcolare la concentrazione del DNA e per valutarne la qualità, le cellule macrofagiche grezze 2 6 4 0,7 occultate nel DMEM sono state integrate con il 9% di siero fetale di vitello in un incubatore a 37 gradi Celsius, il 5% di anidride carbonica e sono passate ogni due giorni.

Durante ogni passaggio, sostituire i vecchi terreni con un volume più piccolo di terreni freschi e staccare le cellule dalla piastra mediante pipettaggio continuo delicato del seme. Da 1,5 a 2 milioni di cellule su una piastra trattata con coltura tissutale di 10 centimetri come brodo il giorno della trasfezione del seme. 200.000 cellule per pozzetto.

In una piastra a 24 pozzetti in un volume di 500 microlitri di DMEM 9%FCS, incubare le cellule per quattro ore nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente al buio caldo di riscaldamento, terreno privo di siero e DMEM 9%FCS a 37 gradi Celsius. Aggiungere 0,5 microgrammi di DNA plasmidico a 50 microlitri di terreno privo di siero in una provetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere due microlitri di reagente di trasfezione con la punta di una pipetta sotto la superficie del vortice di liquido per sei secondi. Lasciare la miscela di DNA reagente al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Durante l'incubazione di 30 minuti, rimuovere il terreno dai pozzetti della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 250 microlitri di DMEM 9%FCS fresco a ciascuno.

Rimetti bene la piastra nell'incubatrice dopo 30 minuti. Aggiungere 250 microlitri di DMEM 9%FCS alla miscela di DNA del reagente e mescolare bene facendo le puring. Su e giù, aggiungere 300 microlitri della miscela diluita a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti, incubare per due-quattro ore in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Dopo due-quattro ore, rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 microlitri di DMEM 9%FCS, incubare per 24-48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica.

Iniziare questa procedura riscaldando i terreni privi di siero e il DMEM 9%FCS a 37 gradi Celsius. Aggiungere brevemente 0,75 microlitri del reagente di trasfezione a 18,75 microlitri del vortice del terreno libero da siero per miscelare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere 0,5 microlitri di una soluzione di DNA da un microgrammo per millilitro al reagente di trasfezione diluito incubato a temperatura ambiente per 10 minuti.

Durante l'incubazione di 10 minuti, rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 250 microlitri di DMEM 9%FCS fresco a ciascun pozzetto dopo 10 minuti. Aggiungere 250 microlitri di DMEM 9%FCS nella miscela di DNA reagente. Aggiungere 270 microlitri della miscela diluita a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti, incubare per due o quattro ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo due o quattro ore, rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 microlitri di DMEM 9%FCS a ciascuna. Incubare bene per 24-48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e percentuale di anidride carbonica. Da 24 a 48 ore dopo la trasfezione, le cellule possono essere stimolate e analizzate per l'attività della luciferasi.

Sostituire il terreno in ogni pozzetto con 250 rilasci di DMEM fresco 9%FCS Aggiungere 50 micro rilasci di LPS o LPS più la citochina antinfiammatoria IL 10 alle concentrazioni desiderate ai pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica, stimolare da due a sei ore. Quindi, rimuovere la soluzione di stimolazione mediante aspirazione.

Lavare le cellule con PBS ghiacciato e aggiungere 200 microlitri di un tampone di lisi passiva a ciascuna. Agitare bene il piatto a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo 30 minuti, raschiare e trasferire il lisato in provette da 1,5 millilitri e rimuovere i detriti cellulari centrifugando a 20.000 volte.

G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 40 microlitri di lisato chiaro in un bianco trasparente. La piastra inferiore a 96 pozzetti misura il segnale Lucifer con un luminometro attraverso l'intero spettro della luce visibile.

Secondo il protocollo del produttore, l'analisi a bassa citometria di cellule trasfettate con un plasmide che esprime GFP ha rivelato che il reagente a base di lipidi ha dato un tasso di trasfezione di circa il 25% mentre la trasfezione a base di poliammide proteica ha portato a un tasso di circa il 5%La differenza nell'efficienza di trasfezione è stata osservata anche nei segnali della luciferasi nelle cellule trasfettate con la regione del promotore di I capa b Zeta. L'aggiunta di LPS ha aumentato il segnale della luciferasi della lucciola. Tipicamente, le cellule sono cotrasfettate con un plasmide di controllo contenente il gene della luciferasi ran e i segnali della luciferasi della lucciola sono normalizzati al segnale della luciferasi ran.

Il confronto dei segnali normalizzati tra campioni non trattati e trattati ha mostrato che l'LPS sovraregola, l'attività del reporter promotore e l'IL 10 inibiscono l'effetto dell'LPS. Il confronto della durata del tempo di riposo tra la trasfezione e la stimolazione ha rivelato che i segnali della luciferasi diminuiscono nel tempo, il che ha influenzato solo l'interpretazione dei dati. Quando il reagente di trasfezione a base di poliammina proteica è stato utilizzato per valutare l'impatto di ciascun metodo di trasfezione sulla morte cellulare, le cellule sono state colorate con annessina cinque e ioduro di propidio e analizzate solo mediante citometria a flusso.

La trasfezione a base lipidica ha leggermente aumentato la proporzione di cinque cellule positive all'annessina. L'immuno-blatting ha mostrato che la trasfezione a base lipidica ha leggermente aumentato la proporzione della proteina polipolimerasi ribosio DP scissa. Mentre la trasfezione a base di poli proteica no.

Nonostante l'elevato numero di cellule apoptotiche, la morfologia delle cellule al microscopio ottico non è cambiata. Ancora più importante, la risposta biologica delle cellule trasfettate a base lipidica è rimasta identica a quella delle cellule non resecate, entrambe hanno prodotto quantità simili di TNF alfa in risposta all'LPS e sono state inibite dall'aggiunta di IL 10. Non è stato prodotto TNF alfa quando le cellule non sono state stimolate, suggerendo che le cellule rimangono naive dopo la trasfezione.

Dopo aver lavato questo video, l'utente ha una buona comprensione di come tradurre le cellule grezze 2, 6, 4, 0,7 con i plasmi riportati da Lucifer in modo minimamente invasivo che non altera la risposta nativa delle cellule.