Name: Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Impara a trasfettare cellule RAW264.7 con geni reporter luciferasi senza attivare le difese immunitarie. Questo metodo consente di studiare l'espressione genica nei macrofagi mantenendo le cellule in stato di riposo.

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Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione del Canadian Institutes for Health Research (CIHR). STC è titolare di un premio di dottorato per la ricerca dal CIHR e dalla Michael Smith Foundation. EYS è titolare di una borsa di studio CIHR. Il programma di formazione sui trapianti del CIHR ha anche fornito borse di studio per laureati a STC, EYS e SS.

1. plasmide DNA Purification <ol><li> Estrarre DNA plasmidico utilizzando un kit maxiprep secondo il protocollo del produttore. Risospendere plasmide DNA in 500 ml di tampone TE. </li><li> Eseguire un fenolo: cloroformio: estrazione di alcool isoamilico e isopropanolo precipitazioni per rimuovere i contaminanti batterici residue. La presenza di LPS interferisce con trasfezione 9. <ol><li> Aggiungere 500 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1, pH 8) al DNA plasmide e agitare energicamente per 15 sec. Fenolo provoca gravi ustioni cutanee ed è un anestetico così ustioni non sono sempre sentito fino a quando vi è un danno grave. Eseguire fenolo: estrazione isoamilico nella cappa e usare cautela: cloroformio. </li></ol></li><li> Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 13.000 xg per 10 min a RT. Trasferire 350 ml di fase acquosa superiore in una nuova provetta di raccolta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 350 microlitri di tampone TE alla provetta che contiene la fase organica inferiore. Agitare energicamente per 15 sec. Centrifugare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 350 ml di fase acquosa superiore allo stesso tubo di raccolta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 70 ml di 3 M acetato di sodio (pH 5.2) e mescolare bene. Aggiungere 700 ml di isopropanolo al 100%. Mescolare bene e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 13.000 xg per 10 minat 4 ° C. Rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 500 ml di etanolo al 75% al ​​pellet. Campioni Vortex di mescolare e centrifugare a 5000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. DNA è in pellet. </li><li> Aprire il tappo del tubo e asciugare il pellet a temperatura ambiente per 5 - 10 min. Il pellet dovrebbe diventare trasparente. Aggiungere 500 ml di tampone TE per risospendere il pellet di DNA. Riscaldare a 50 - 60 ° C per 10 minuti per sciogliere il pellet di DNA. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 260 nm (A260) e 280 nm (A280) con uno spettrometro. Calcolare la concentrazione di DNA moltiplicando il valore A260 da 50 ng / ml. Valutare la qualità del DNA da parte calculating il rapporto A260 / A280. DNA con alta qualità dovrebbe dare un rapporto A260 / A280 di 1,8-2,0. </li></ol> 2. Coltura cellulare e Seeding <ol><li> Culture cellule RAW264.7 in DMEM supplementato con siero fetale di vitello 9% (DMEM / 9% FCS) a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Durante ogni passaggio, staccare le cellule dalla piastra pipettando continuo utilizzando una pipetta Pasteur. Passage le celle ogni 2 giorni, e sementi 1,5-2.000.000 cellule su un piatto di coltura di tessuti trattati 10 centimetri come il magazzino. Scongelare un nuovo stock di cellule ogni 5-6 settimane. </li><li> Il giorno della trasfezione, sementi 200.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in un volume di 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare le cellule per 4 ore in C incubatore 37 °. </li><li> Cellule transfect sia con il reagente a base lipidica (passo 3.1) o del reattivo a base di poliammine proteine ​​/ (punto 3.2). </li></ol> 3. Trasfezione <ol><li> A base di lipidi trasfezione: <ol><li> Riscaldare il reagen trasfezionet a Rt nel buio. Warm up mezzo privo di siero e DMEM / 9% FCS a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 0,5 pg di DNA plasmidico a 50 ml di mezzo privo di siero in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 2 ml di reagente di trasfezione con la punta della pipetta di sotto della superficie del liquido. Vortex per 6 secondi. </li><li> Lasciare la miscela reagente / DNA al buio a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Durante la 30 min di incubazione, rimuovere il supporto dal bene e aggiungere 250 ml di fresco DMEM / 9% FCS per ogni bene. </li><li> Dopo 30 min, aggiungere 250 ml di DMEM / 9% FCS per la miscela reagente / DNA. Mescolare bene pipettando su e giù. </li><li> Aggiungere 300 microlitri della miscela diluita in ciascun pozzetto. Incubare per 2 - 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore prima stimolazione cellulare. </li></ol></li><li> Proteine ​​/ a base di poliammine-trasfezione: <ol><li> Warm up privo di sieromedio e DMEM / 9% FCS a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 0,75 ml di reagente di trasfezione a 18,75 ml di terreno privo di siero. Vortex brevemente per miscelare. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 0,5 ml di 1 mg / ml di DNA nel reagente transfettate diluito. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Durante i 10 minuti di incubazione, rimuovere il supporto da ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti e aggiungere 250 microlitri DMEM fresco / 9% FCS per ogni bene. </li><li> Dopo 10 min, aggiungere 250 ml di DMEM / 9% FCS nella miscela reagente / DNA. </li><li> Aggiungere 270 microlitri della miscela diluita al pozzo. Incubare in un incubatore CO 2 37 ° C e 5% per 2-4 ore. </li><li> Rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li></ol></li></ol> 4. La stimolazione cellulare e luciferasi Assay <ol><li> Sostituire media negli bene con 250 ml di fresco DMEM / 9% FCS. </li><li> Aggiungere 50 ml di LPS o LPS + IL-10 Alle concentrazioni desiderate al pozzo. Riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Stimolare per 2-6 ore. </li><li> Rimuovere la soluzione stimolazione mediante aspirazione, lavare con ghiaccio freddo PBS e aggiungere 200 ml di 1x Passive Lysis Buffer. Roccia a temperatura ambiente per 30 min. Raschiare e trasferire il lisato provette da 1,5 ml e rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Trasferimento 40 ml di lisato eliminato (surnatante) a una, chiara fondo piastra a 96 pozzetti bianco per la determinazione di segnali luciferasi secondo il protocollo del produttore. </li><li> Leggere il segnale luciferasi con un luminometro attraverso l&#39;intero spettro della luce visibile. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Calcolare la lucciola: rapporto Renilla dividendo valori individuali di luciferasi di lucciola dai valori di Renilla luciferasi da ogni pozzetto. </li><li> Calcolare il fold change dividendo la lucciola: Renilla rapporto tra il trattato bene daquella del pozzo non trattato. </li></ol>

<ol><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).</li>
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<li>Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+technical+reports.+Effects+of+lipopolysaccharide+on+transfection+efficiency+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells.</a> Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).</li>
<li>Berghaus, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).</li>
<li>Fiszer-Kierzkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+DNA+carriers+may+induce+cellular+stress+response+and+change+gene+expression+pattern+in+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto non si concentra esclusivamente sulla efficienza di trasfezione, ma ha lo scopo di trovare un equilibrio tra efficienza e la conservazione degli stati fisiologici delle cellule. In particolare, la nostra procedura riesce a ridurre al minimo la tossicità di reagente di trasfezione e massimizzare il segnale luciferasi. Un passo critico nel protocollo è la salute delle cellule. Culture Overgrown non sono adatti per la trasfezione come loro cambiamenti fisiologia e co...

La trasfezione di acidi nucleici nelle cellule ha un&#39;applicazione diversificata nella ricerca scientifica. Gli esempi includono (1) geni reporter per studiare il ruolo dei diversi elementi di gene espressione genica, (2) plasmidi di espressione proteica per overexpress la proteina di interesse, e (3) small interfering RNA downregulate espressione genica. Manipolando il livello di espressione di particolari geni e misurando l&#39;effetto differenziale di tali manipolazioni, i ricercatori possono dedurre le funzioni geniche nei sistemi biologici scelti. Non tutti i metodi di trasfezione forniscono la stessa efficienza di trasfezione, e anche lo stesso metodo di trasfezione non trasfettare tutti i tipi cellulari parimenti 1. Quindi, diversi metodi di trasfezione sono stati sviluppati come metodo di fosfato di calcio, DEAE destrano, cationico lipidi trasfezione, cationico trasfezione polimero non lipidi, elettroporazione, e nucleofection 2,3. Transfection in macrofagi è especialmente difficile a causa del fatto che i macrofagi sono fagociti professionali che sono molto sensibili a materiali estranei, tra cui i batteri derivati ​​(metilato) DNA 4. Introduzione di DNA estraneo attiva la via Toll-like receptor 9 (TLR9) che porta alla produzione di citochine e ossido nitrico 5,6. Questi macrofagi attivati ​​possono quindi essere meno sensibili al trattamento che i ricercatori intendono esaminare. Il nostro laboratorio transfects regolarmente la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 con geni reporter luciferasi, e abbiamo sviluppato un protocollo che è abbastanza robusto per avere segnale luciferasi significativamente superiore a quello di fondo, ma anche abbastanza delicato per i macrofagi di rimanere al loro stato di riposo. I comportamenti delle cellule trasfettate sono state valutate da un gene reporter luciferasi di lucciola-ospitare la regione del promotore di IκBζ (pGL3- IκBζ). Espressione IκBζ è upregulated dalla parete cellulare batterica componente labbroopolyssacharide (LPS) 7,8, e downregulated dalla citochina anti-infiammatoria, interleuchina-10 (IL-10) 8. Per tenere conto delle variazioni trasfezione tra pozzi, abbiamo co-trasfettare un plasmide di controllo che contiene il gene della luciferasi Renilla (ad esempio, phRL-TK) a fini di normalizzazione. Il protocollo descritto è ottimizzato dopo test vari parametri tra cui tempi di trasfezione, tipo di reagenti di trasfezione, quantità di reagenti e trasfezione di DNA plasmidico, così come rapporto di reagente di trasfezione di DNA plasmidico. I due reagenti di trasfezione compresi in questo protocollo sono (1) un reagente di trasfezione base lipidica e (2) una proteina / basato poliammina-trasfezione reagente.

<table><tbody><tr><td>Kit PureLink HiPure Plasmid Maxiprep</td><td>Life Technologies</td><td>K210007</td><td>Qualsiasi kit maxiprep funzionerà</td></tr><tr><td>Fenolo: cloroformio: alcol isoamilico</td><td>Life Technologies</td><td>15593-049</td><td>Grado di biologia molecolare. Il fenolo è tossico, quindi lavorare nella cappa aspirante, se possibile. Utilizzare lo strato organico trasparente inferiore se nel contenitore si formano due strati di liquido.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30243.01</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td>Inattivato a 56 gradi C bagnomaria per 45 minuti prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Riscaldare almeno a temperatura ambiente prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione XtremeGene HP DBA</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</td></tr><tr><td>GeneJuice</td><td>EMD Millipore</td><td>70967</td><td>Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</td></tr><tr><td>5x tampone per lisi passiva</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>30 ml è incluso nel sistema di analisi Dual Luciferase</td></tr><tr><td>Reporter Dual Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr></tbody></table>

trasfettando cellule raw264.7 con luciferasi reporter gene

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

La trasfezione dei materiali genetici desiderati in cellule è una procedura inevitabile negli studi di ricerca biomedica. Sebbene siano stati descritti numerosi metodi, alcuni tipi di cellule sono resistenti a molti di questi metodi e producono una bassa efficienza di trasfezione1, ostacolando potenzialmente la ricerca in quei tipi di cellule. In questo protocollo, presentiamo una procedura di trasfezione ottimizzata per introdurre geni reporter della luciferasi come DNA plasmidico nella linea cellulare di macrofagi RAW264.7. Vengono descritti due diversi tipi di reagenti di trasfezione (a base di lipidi e a base di poliammine) e vengono fornite note importanti in tutto il protocollo per garantire che le cellule RAW264.7 siano minimamente alterate dalla procedura di trasfezione e che tutti i dati sperimentali ottenuti siano i risultati diretti del trattamento sperimentale. Sebbene l'efficienza di trasfezione non sia superiore rispetto ad altri metodi di trasfezione, la procedura descritta è sufficientemente robusta per rilevare il segnale della luciferasi in RAW264.7 senza modificare la risposta fisiologica delle cellule agli stimoli.

Figura 1 confronta l&#39;efficienza di trasfezione dei due reagenti di trasfezione in RAW264.7. Il reagente a base lipidica tipicamente dato circa il 25% tasso trasfezione mentre la trasfezione basata poliammina-proteina / portato in circa il 5% di efficienza (Figura 1A). La differenza in termini di efficienza di trasfezione è stata anche osservata in segnali luciferasi in cellule RAW264.7 trasfettate con il promotore giornalista pGL3-IκBζ (Figura 1B). L&#39;aggiunta di...

La trasfezione nella linea cellulare dei macrofagi, RAW264.7, è difficile a causa della risposta naturale della cellula contro i materiali estranei. Abbiamo descritto qui una procedura delicata ma robusta per la trasfezione dei geni reporter della luciferasi in cellule RAW264.7.

Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasfettare costrutti reporter della luciferasi in cellule RAW 264.7 senza attivare le cellule. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo le cellule RAW 264.7 da una piastra stock mediante pipettaggio delicato e seminando le cellule in una piastra da coltura tissutale trattata da 24 pozzetti. Il secondo passaggio consiste nella codicesione del plasmide reporter della luciferasi di Firefly e del plasmide di controllo della luciferasi Renilla nelle cellule.Questi plasmidi devono essere privi di endotossine. Successivamente, le cellule vengono stimolate con i trattamenti desiderati, seguiti dalla lisi cellulare e dal trasferimento in una piastra bianca a 96 pozzetti con fondo trasparente. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare l'attività della luciferasi di firefly e quindi nell'analizzare l'attività della luciferasi per calcolare il rapporto tra firefly e renilla.Infine, il fold change rispetto al controllo non stimolato viene utilizzato per mostrare l'effetto degli stimoli sul reporter Lucifer, che è correlato al livello di espressione del gene di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasfezione notturna convenzionale, è che le cellule trasfettate vengono mantenute nel loro stato di riposo con danni minimi alle cellule. Il DNA plasmidico da utilizzare per la trasfezione era stato precedentemente estratto mediante un kit maxi prep disponibile in commercio e risospeso in 500 microlitri di buffer te.Poiché la presenza del componente della parete batterica lipopolisaccaride o LPS interferisce con la trasfezione, è necessario rimuovere i residui di contaminanti batterici dal DNA in una cappa a flusso laminare. Aggiungere 500 microlitri di alcol fenil cloroformio isoamilico al DNA plasmidico e agitare vigorosamente per 15 secondi. Prestare attenzione poiché il fenolo provoca gravi ustioni cutanee.Incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente, centrifugare a 13.000 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente, trasferire 350 microlitri della fase acquosa superiore in un nuovo tubo da raccolta da 1,5 millilitri. Aggiungere 350 microlitri di tampone TE al tubo contenente la fase organica inferiore. Agitare vigorosamente per 15 secondi.Centrifugare a 13.000 ×g per cinque minuti. A temperatura ambiente, trasferire 350 microlitri della fase acquosa superiore nel medesimo tubo di raccolta da 1,5 millilitro. Aggiungere 70 microlitri di una soluzione di acetato di sodio e mescolare accuratamente.Aggiungere 700 microlitri di isopropanolo al 100%. Mescolare accuratamente e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 13.000 ×g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere il soprannatante e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% al pellet. Vortexare i campioni per mescolare e centrifugare a 5.000 ×g per cinque minuti a 4 °C, quindi rimuovere il soprannatante.Il DNA plasmidico si trova nel pellet. Aprire il cappuccio del tubo ed essiccare all'aria il pellet a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti. Il pellet dovrebbe diventare traslucido.Aggiungere 500 microlitri di tampone TE al pellet di DNA e riscaldare a 50-60 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere il pellet di DNA. Infine, misurare l'assorbanza della sospensione di DNA a 260 nanometri e 280 nanometri mediante spettrometro. Per calcolare la concentrazione del DNA e valutarne la qualità, le cellule macrofagiche occultate 2 6 4 0.7 coltivate in DMEM integrato con 9% di siero fetale bovino in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, e passaggiate ogni due giorni.A ogni passaggio, sostituire il vecchio terreno con un volume minore di terreno fresco e staccare le cellule dalla piastra mediante pipettaggio continuo e delicato. Seminare da 1,5 a 2 milioni di cellule in una piastra da 10 centimetri trattata per coltura tessutale come stock nel giorno della trasfezione. Seminare 200.000 cellule per pozzetto.In una piastra a 24 pozzetti, in un volume di 500 microlitri di DMEM con 9% FCS, incubare le cellule per quattro ore nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, portare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente al buio, riscaldare il mezzo privo di siero e il DMEM con 9% FCS a 37 gradi Celsius. Aggiungere 0,5 microgrammi di DNA plasmidico a 50 microlitri di mezzo privo di siero in un tubo da 1,5 millilitro.Aggiungere due microlitri di reagente di trasfezione con una punta di pipetta al di sotto della superficie del vortice liquido per sei secondi. Lasciare la miscela di reagente e DNA al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Durante l'incubazione di 30 minuti, rimuovere il mezzo dai pozzetti della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 250 microlitri di DMEM fresco con 9% FCS a ciascun pozzetto.Rimettere la piastra nell'incubatrice dopo 30 minuti. Aggiungere 250 microlitri di DMEM con 9% FCS alla miscela di DNA del reagente e mescolare accuratamente aspirando e dispensando più volte; aggiungere 300 microlitri della miscela diluita in ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti e incubare per due-quattro ore in un'incubatrice a 37 °C con 5% di anidride carbonica. Dopo due-quattro ore, rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 microlitri di DMEM con 9% FCS; incubare per 24-48 ore in un'incubatrice a 37 °C con 5% di anidride carbonica.Per iniziare questa procedura, riscaldare il mezzo privo di siero e il DMEM con 9% di FCS a 37 gradi Celsius. Aggiungere 0,75 microlitri del reagente di trasfezione a 18,75 microlitri di mezzo privo di siero, vortexare brevemente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 0,5 microlitri di una soluzione di DNA da un microgrammo per millilitro al reagente di trasfezione diluito e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.Durante l'incubazione di 10 minuti, rimuovere il mezzo da ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti e aggiungere 250 microlitri di DMEM fresco con 9% di FCS in ogni pozzetto dopo 10 minuti. Aggiungere 250 microlitri di DMEM con 9% di FCS alla miscela di DNA del reagente. Aggiungere 270 microlitri della miscela diluita in ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti e incubare per due-quattro ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo due o quattro ore, rimuovere la soluzione di transfezione e aggiungere 500 microlitri di DMEM con 9% di FCS a ciascun pozzetto. Incubare per 24-48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e percentuale di anidride carbonica. Da 24 a 48 ore dopo la transfezione, le cellule possono essere stimolate e sottoposte a saggio per l'attività della luciferasi.Sostituire il mezzo in ogni pozzetto con 250 rilasci di DMEM fresco con 9% di FCS. Aggiungere 50 micro rilasci di LPS o LPS insieme alla citochina antinfiammatoria IL-10 alle concentrazioni desiderate nei pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e stimolare per due-sei ore. Successivamente, rimuovere la soluzione di stimolazione mediante aspirazione.Lavare le cellule con PBS freddo e aggiungere 200 microlitri di buffer di lisi passiva 1x a ciascuna. Agitare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo 30 minuti, raschiare e trasferire il lisato in provette da 1,5 millilitro ed eliminare i detriti cellulari centrifugando a 20.000 × g.G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 40 microlitri del lisato chiaro in una piastra da 96 pozzetti trasparente con fondo bianco. Misurare il segnale luciferina con un luminometro lungo l'intero spettro della luce visibile.Secondo il protocollo del produttore, l'analisi mediante citometria a flusso di cellule trasfettate con un plasmide esprimente GFP ha rivelato che il reagente basato su lipidi ha determinato un tasso di trasfezione di circa il 25%, mentre la trasfezione basata su poliammide proteica ha prodotto un tasso di circa il 5%. La differenza nell'efficienza di trasfezione è stata osservata anche nei segnali di luciferasi in cellule trasfettate con la regione del promotore di I capa b Zeta. L'aggiunta di LPS ha aumentato il segnale di luciferasi di firefly. Tipicamente, le cellule vengono trasfettate in co-presenza di un plasmide di controllo contenente il gene della luciferasi ran e i segnali di luciferasi di firefly vengono normalizzati rispetto al segnale della luciferasi ran.Il confronto tra i segnali normalizzati di campioni non trattati e trattati ha mostrato che il LPS aumenta l'attività del reporter del promotore e che l'IL-10 inibisce l'effetto del LPS. Il confronto della durata del tempo di riposo tra trasfezione e stimolazione ha rivelato che i segnali della luciferasi diminuiscono nel tempo, il che ha influenzato esclusivamente l'interpretazione dei dati. Quando il reagente di trasfezione a base di poliammine è stato utilizzato per valutare l'impatto di ciascun metodo di trasfezione sulla morte cellulare, le cellule sono state colorate con annexina V e ioduro di propidio ed analizzate esclusivamente mediante citometria a flusso.La trasfezione basata su lipidi ha leggermente aumentato la proporzione di cellule positive all'annexina V. L'immunoblotting ha mostrato che la trasfezione basata su lipidi ha leggermente aumentato la proporzione della proteina poli(ADP-ribosio) polimerasi scissa, mentre la trasfezione basata su polimeri proteici non l'ha fatto.Nonostante l'elevato numero di cellule apoptotiche, la morfologia delle cellule osservata al microscopio ottico non è cambiata. Più importante, la risposta biologica delle cellule trasfettate con lipidi è rimasta identica a quella delle cellule non resecate, poiché entrambe hanno prodotto quantità simili di TNF alfa in risposta a LPS ed è stata inibita dall'aggiunta di IL 10. Nessun TNF alfa è stato prodotto quando le cellule non sono state stimolate, suggerendo che le cellule rimangono naive dopo la trasfezione.Dopo aver visionato questo video, l'utente avrà una buona comprensione di come tradurre cellule raw 2 6 4 0.7 con plasmidi reporter di Lucifer in modo minimamente invasivo, che non altera la risposta nativa delle cellule.

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