Utilizzando a disegno Galvanotaxis Chambers per studiare la migrazione direzionale di cellule della prostata

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire Galvan Axxis, un saggio per valutare la migrazione direzionale delle cellule in un campo elettrico applicato. Ciò si ottiene assemblando prima e poi seminando una camera Galvan axxis con le celle di interesse. Nella seconda fase, la camera viene sigillata e viene applicato un campo elettrico per l'imaging time-lapse.

Nella fase finale, viene tracciata la velocità di migrazione delle singole celle e l'angolo relativo al campo elettrico. Alla fine cofirma. Può essere utilizzato per mostrare come le celle rispondono al campo elettrico e se migrano direzionalmente verso il catodo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è il facile recupero delle cellule dopo la somministrazione di Texas per l'analisi secondaria e la facilità con cui la migrazione può essere filmata ad alto ingrandimento e con cellule marcate in fluorescenza. La visualizzazione di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di assemblaggio di una camera sono difficili da imparare senza dimostrazione per assemblare le camere inferiori. Inizia pulendo una camera di plastica galvan axxis con due propanolo.

Quindi utilizzare una siringa per applicare il sigillante siliconico di grado marino attorno alle aperture circolari sul lato inferiore della camera. Disporre un grande bicchiere di copertura sopra il sigillante e premerlo in posizione con l'estremità di un applicatore di cotone, rimuovendo la colla in eccesso con il batuffolo di cotone. Quindi utilizzare un pennarello a punta di diamante per tagliare un piccolo vetro di copertura per creare spazi di sei per 25 millimetri e capovolgere la camera.

Quindi, utilizzare una siringa per applicare due strisce di silicone, creando una superficie del canale di 10 x 25 millimetri per l'attacco delle celle tra le due aperture circolari sul vetro inferiore. Quindi incolla due spazi di vetro tra le aperture circolari, spingendo verso il basso gli spazi con un nuovo applicatore di cotone e rimuovendo la colla in eccesso come appena dimostrato. Provare la camera per 24 ore fino a quando la colla siliconica non si sarà indurita.

Il giorno successivo, immergere la camera in acqua distillata durante la notte per rimuovere i residui di acido acetico dalla colla prima di seminare le cellule sulla camera. Asciugare e pulire le camere con due propanolo come appena dimostrato. Lavarli con PB S3 sterile volte e poi controllare il flusso del liquido tra le due aperture circolari nelle camere.

Dopo aver verificato che le camere siano in buone condizioni di funzionamento, racchiuderle in piastre di coltura sterili e posizionare le camere a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Mentre le camere sono in equilibrio, staccare le cellule della prostata dal loro piatto di coltura con cinque millilitri di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, neutralizzare la reazione con cinque millilitri di FBS al 10%.

In PBS, trasferire le cellule staccate in provette da 15 millilitri e poi centrifugare per cinque minuti. A 200 volte, G, aspirare il fluido e poi risospendere il pellet in un millilitro di terreno. Quindi, dopo aver contato le cellule, regolare la concentrazione delle cellule a otto per 10 a quattro cellule per millilitro con terreno di coltura e seme.

350 microlitri di sospensione cellulare su ogni camera. Incubare le cellule nella camera per una notte in un piatto di coltura con una salvietta Kim bagnata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, iniziare l'assemblaggio delle camere superiori riscaldando prima 10 millilitri di coltura, a una temperatura media di 37 gradi Celsius per ogni camera AXS galva.

Mentre il terreno si sta riscaldando, trasferire una camera Galvan axxis dall'incubatore su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius e sciacquare la camera con terreno di coltura. Per rimuovere le cellule non attaccate, lasciare 400 microlitri di terreno nella camera e quindi utilizzare una siringa per applicare il grasso ad alto vuoto sopra entrambi gli spazi di vetro. Sigillare la camera con un vetro di copertura e un applicatore di cotone, quindi asciugare la superficie del vetro.

Quindi, applicare il grasso ad alto vuoto con una siringa per sigillare lo spazio tra il vetro di copertura e la camera. E poi aggiungere il terreno di coltura ai serbatoi interni. Rimuovere le bolle e controllare il flusso di liquido tra i serbatoi.

Per realizzare i ponti di agar tagliare un paio di tubi in PVC da due pollici, capovolgerli e poi posizionare i pezzi in un becher da 100 millilitri. Quindi, aggiungere 200 milligrammi di agar bact toe in un pallone da 50 millilitri con 10 millilitri di terreno di coltura per ottenere un gel di agar al 2%. Dopo aver cotto nel microonde per 30 secondi, utilizzare una pipetta di trasferimento per caricare il gel di agar nel tubo di plastica e lasciare i ponti di agar a temperatura ambiente per 10 minuti per solidificare l'agar.

Quindi aggiungere due millilitri di terreno di coltura ai serbatoi esterni della camera gal e inserire i ponti di agar nei serbatoi interno ed esterno del mezzo per condurre la corrente per eseguire l'imaging time-lapse della migrazione. Inizia trasferendo la camera Galvan in una camera ambientale a 37 gradi Celsius sul tavolino del microscopio, fissando la camera con del nastro adesivo e concentrandoti sulle celle sotto un obiettivo 10x. Quindi, inserire gli elettrodi Galvan Axxis nei serbatoi esterni con il catodo sul lato destro, fissando il filo e gli elettrodi con del nastro adesivo.

Quindi accendere la scatola di alimentazione per applicare un campo elettrico alla camera e utilizzare un misuratore di tensione per misurare la tensione di uscita attraverso la camera per raggiungere i 2,5 volt per la camera lunga 25 millimetri. Ora seleziona 10 punti in tutta la camera per generare 10 filmati time lapse e imposta le condizioni di acquisizione a intervalli di 10 minuti per due ore. Quindi avvia le riprese e regola la corrente di uscita secondo necessità per mantenere l'intensità del campo durante l'esperimento.

Al termine dell'esperimento, rimuovere la camera dal tavolino e fissare le cellule in alcool al 95%. Quindi apri la camera. Il vetrino coprioggetto può essere salvato per un secondo momento.

Colorazione e imaging. Pulisci la camera per gli anni futuri. Per quantificare il Galvan Axxis, ruotare i filmati time-lapse per orientare il catodo verso la parte superiore delle immagini.

Esporta i filmati nel software di tracciamento delle celle e traccia manualmente la posizione XY di 10-20 celle in ogni punto temporale di ogni film, le distanze di migrazione e gli angoli relativi alla direzione nord sud, lo stesso orientamento del campo elettrico verrà calcolato nel software di tracciamento delle celle. Infine, salva le misurazioni e importa i dati in un'applicazione di database per calcolare i risultati combinati. In questo esperimento rappresentativo di Galvan Axxis, è stato determinato che le linee di cellule della prostata migrano a velocità simili nel corso di due ore.

Tuttavia, la direzionalità al campo elettrico era 0,7 più meno 0,3 per il PRNS una linea e 0,2 più meno 0,8 per la PNT due linee, indicando una differenza significativa nell'asse Galvan di queste due linee cellulari, suggerendo che i loro meccanismi di segnalazione cellulare indirizzano le risposte di migrazione differenziale al campo elettrico Dopo lo sviluppo del metodo Govan Texas. Questa tecnica aiuta i ricercatori a esplorare i meccanismi della migrazione cellulare direzionale nel campo elettrico.