Name: Utilizzando a disegno Galvanotaxis Chambers per studiare la migrazione direzionale di cellule della prostata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Impara a studiare la galvanotassi delle cellule prostatiche utilizzando camere personalizzate. Questo metodo permette di analizzare la migrazione direzionale in risposta a campi elettrici fisiologici.

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Le linee di cellule della prostata sono gentilmente forniti dal Dr. Ling-Yu Wang e Dr. Hsing-Jien Kung al Cancer Center, UC Davis. Questo progetto è sostenuto da NIH concedere galvanotaxis 4R33AI080604.

1. Le celle Culturing prostata <ol><li> Cultura dei PRN-1-1 e pnt2 prostata cellule in 100 piatti mm di coltura in RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e antibiotici contro funghi a 37 ° C con il 5% di CO 2. Aggiornare il terreno di coltura ogni giorno fino a quando le cellule raggiungono 80% di confluenza per gli esperimenti galvanotaxis. </li></ol> 2. Montaggio Galvanotaxis Chambers <ol><li> Assemblaggio camere inferiori <ol><li> Pulire una camera galvanotaxis plastica con 2-propanolo. Applicare il sigillante silicio di qualità marine intorno alle aperture circolari sul lato inferiore di una camera con una siringa e attaccare un grande coprioggetti (Figura 1). Usare il lato posteriore di un applicatore di cotone per spingere verso il basso il coprioggetti e pulire la colla in eccesso con tamponi di cotone. Le aperture circolari consentono la corrente elettrica media e scorrano sulle cellule situate tra i due serbatoi medie interne. </li><li> Tagliare un piccolo coprioggetti per fare 6 mm x 25 millimetri distanziali con un pennarello a punta di diamante. </li><li> Capovolgere la camera. Applicare 2 strisce di colla silicio con una siringa e / o una spatola metallica per creare una superficie canale x 25 mm 10 mm per l'adesione delle cellule tra i 2 aperture circolari sul fondo di vetro. Colla 2 pezzi di vetro distanziatore tra le due aperture circolari. Utilizzare il retro degli applicatori di cotone per spingere verso il basso i distanziali e pulire la colla in eccesso con tamponi e / o stuzzicadenti cotone. </li><li> Asciugare la camera per 24 ore fino a quando la colla di silicio è guarito. Mettere a bagno nella camera durante la notte acqua distillata per rimuovere il residuo di acido acetico da colla. Asciugare la camera per un uso immediato, o conservare la camera per un uso successivo in un contenitore pulito. <img alt="Schema di configurazione della camera di galvanotassi che dettaglia il montaggio con distanziatori in vetro, vetro del coperchio inferiore." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Montaggio della camera di fondo galvanotaxis. A) Una grande coprioggetti è attaccato al fondo di una camera pulita. B) Two pezzi di distanziali vetro sono incollati tra le 2 aperture circolari per creare un canale 10 mm mm x 25 per le cellule di allegare. </li></ol></li><li> Semina cellule sulle camere galvanotaxis <ol><li> Preparare il numero richiedere di camere galvanotaxis necessari per l'esperimento. Ogni linea o il trattamento di cellule richiede una sola camera galvanotaxis. Pulire le camere galvanotaxis con 2-propanolo. Lavare le camere sterili con PBS 3 volte e controllare il flusso di liquido tra le due aperture circolari nelle camere. </li><li> Racchiudere le camere sterili in piatti di coltura di cellule e permettere loro di equilibrare a 37 ° C per 15 min. Staccare le cellule della prostata dal loro piatto di coltura utilizzando 5 ml 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 minuti. Neutralizzare il tripsina-EDTA con 5 ml di 10% FBS in PBS. </li><li> Trasferire le cellule a 15 ml provette e centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 xg, 37 ° C. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura. </li><li> Prendere 20 μl di soluzione di cellule per caricare ad una camera di conteggio e calcolare il numero di cellule. Regolare la concentrazione cellulare di 8 x 10 4 cellule / ml con terreno di coltura. </li><li> Prendete le camere galvanotaxis dalla C incubatore 37 °. Seed 350 ml di sospensione cellulare su ciascuna camera. </li><li> Incubare le cellule nelle camere di notte nel piatto cultura con Kimwipe bagnato o in una camera umida in incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li></ol><img alt="Diagramma di migrazione delle cellule prostatiche con configurazione dell'incubatore per analisi sperimentali a 37°C, 5% CO2." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2:. Semina le cellule alla camera La camera inferiore viene asciugato e pulito cellule A) della prostata vengono tripsinizzate, contate e trasferiti alla camera e incubate overnight B) Un coprioggetti superiore è collegata a sigillare la camera prima di girare... <ol start="3"><li> Lassembling le camere superiori <ol><li> Montare la camera superiore prima delle riprese. Il microscopio può ospitare l'imaging un'unica camera galvanotaxis contemporaneamente. Warm up 10 ml di terreno di coltura a 37 ° C per ogni camera galvanotaxis. Trasferire una camera galvanotaxis dalle incubatrici ad una piastra 37 ° C il riscaldamento. </li><li> Lavare le cellule con terreno di coltura per rimuovere le cellule separati. Lasciare 400 microlitri di media nella camera. Utilizzare una siringa per applicare grasso alto vuoto sulla parte superiore di entrambi i distanziali vetro. </li><li> Aggiungere una piccola coprioggetti per sigillare la camera. Premere delicatamente verso il basso il coprioggetti con il lato posteriore di un applicatore di cotone. Pulire l'eccesso di terreno con tamponi di cotone. </li><li> Asciugare la superficie di vetro e applicare il grasso alto vuoto per sigillare il divario tra il coprioggetti e la camera. Utilizzare una spatola metallica per diffondere il grasso. Aggiungere 4 ml del terreno di coltura per i serbatoi interni e controllare il flusso di liquido tra i serbatoi. </li></ol></li><li> Fai agarponti <ol><li> Tagliare un paio di tubi lungo PVC da 2 pollici (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Muro), capovolgere e inserirli in un bicchiere da 100 ml. </li><li> Misura 200 mg Bacto-agar e aggiungere in un pallone da 50 ml con 10 ml di terreno di coltura per fare 2% gel di agar. Forno a microonde per 30 secondi. Caricare il gel di agar per il tubo di plastica con una pipetta di trasferimento. Lasciare i ponti agar a temperatura ambiente per 10 minuti per solidificare l'agar. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura per i serbatoi esterni della camera galvanotaxis. Inserire i ponti agar al mezzo interno ed esterno serbatoi per condurre la corrente. </li></ol></li></ol><img alt="Diagramma dell'esperimento di galvanotassi che mostra la configurazione della camera con ponti di agar e alimentazione CC per la migrazione cellulare." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 3"> Figura 3:. Filmare le celle della camera Un diagramma per dimostrare l'assemblaggio finale della camera galvanotaxis. La camera è completamente sigillata con grasso alto vuoto. Medium è aggiunto to riempire i serbatoi, e due ponti agar vengono inseriti nella camera. Poi la camera galvanotaxis viene trasferito alla fase microscopio e gli elettrodi sono attaccati per applicare il campo elettrico. Vista laterale della camera galvanotaxis assemblato è mostrato per dimostrare che la corrente elettrica scorre sulle cellule attraverso i ponti agar e lo spazio tra il vetro di copertura. 3. Time-lapse imaging <ol><li> Accendere la camera ambientale a 37 ° C con 5% di CO 2 in aria circolante 2 ore prima di imaging. </li><li> Accendere il microscopio e avviare il software di immagine acquisizione. Calibrare palco microscopio e selezionare l'obiettivo 10X. </li><li> Trasferire le camere galvanotaxis al palco microscopio, fissare la camera con nastro adesivo e concentrarsi sulle cellule. Gli elettrodi galvanotaxis ai serbatoi esterni con catodo sul lato destro. Fissare il filo e gli elettrodi con nastro adesivo. </li><li> Accendere il bo poterex per applicare un campo elettrico alla camera. Misurare la tensione di uscita con il voltmetro attraverso la camera per raggiungere 2,5 volt per la camera lunga 25 mm (100 mV / mm). Mantenere l'intensità di campo durante l'esperimento regolando la corrente di uscita. </li><li> Selezionare 10 punti in tutta la camera per filmare nel software per generare dieci film time-lapse. Impostare le condizioni di acquisizione a intervalli di 10 min per 2 ore. </li><li> Inizio riprese e regolare la corrente di uscita, se necessario. </li><li> Alla fine dell'esperimento, rimuovere la camera dalla fase e fissare le cellule con 95% di alcol. Rompere aperto la camera con una lama di rasoio per pulire e ri-utilizzarlo. </li></ol> 4. Quantificazione di Galvanotaxis <ol><li> Ruotare i filmati time-lapse e ri-orientare il catodo alla parte superiore delle immagini. Esportare i film per il software di monitoraggio delle cellule. </li><li> Monitorare manualmente il (x, y) posizione 10-20 cellule in ciascun time-point da ogni film (Figura 4 A, B).Le distanze di migrazione e gli angoli rispetto alla direzione nord-sud, lo stesso orientamento del campo elettrico, vengono calcolati nel software di monitoraggio cella (Figura 4C). NOTA: La velocità media di migrazione viene convertito dalla distanza di migrazione totale e tempo totale riprese. La direzionalità viene convertito da angoli al valore del coseno. Se le cellule migrano con direzionalità a caso, la media del coseno netto sarà vicino allo zero. Se le cellule migrano direttamente verso il catodo, il valore del coseno sarà +1. Se le cellule migrano direttamente verso l'anodo, il valore del coseno sarà -1. </li></ol><img alt="Confronto tra migrazione cellulare, migrazione casuale vs galvanotassi, diagramma con equazione del coseno per la direzione." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Inseguimento cellulare per misurare direzionalità A) Sovrapposizione delle linee di tracciamento con immagini di cellule.. I (x, y) posizioni delle cellule sono Manually rintracciato nei film time-lapse. . Se le cellule migrano caso, il coseno media è vicina a zero B) Tuttavia, se le cellule migrano verso il catodo e l'anodo, il valore del coseno media è vicino a + (catodo) o -. (Anodo) 1.0 C ) La direzionalità è presentato dal valore del coseno, che viene convertito da angoli di migrazione (θ). Il coseno (θ) è uguale al rapporto tra la distanza a (la distanza di migrazione) della distanza b (la distanza proiettata alla direzione del campo elettrico). <ol start="3"><li> Salvare le misurazioni. Importare i dati di un'applicazione database per calcolare i risultati combinati. </li><li> Esportare i dati combinati di velocità media di migrazione e il valore medio del coseno di un foglio di calcolo per tracciare i grafici a barre (Figura 5). </li></ol>

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<li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li>
<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;analisi della risposta galvanotaxis di una cellula è stato un indicatore funzionale importante per molti migratori o crescita cellulare elabora 27, 28. Qui usiamo una camera di misura con superficie di vetro per filmare due linee di cellule della prostata. Queste linee cellulari hanno dimostrato diversi gradi di galvanotaxis, e ipotizzano che la localizzazione intracellulare o l&#39;attivazione delle proteine ​​galvanotaxis mediare potrebbero creare interferenze durante il processo di generazione di lin...

Campi elettrici endogeni vengono rilevati in vari tessuti, come la pelle 1, 32, 33 e il cervello 2. Il campo elettrico fisiologica serve funzioni biologiche specifiche, tra dirigere sviluppo embrionale 3, 4, guidando la conseguenza di processi neuronali 5, 6 e promuovere cicatrizzazione corneale epiteliale e 1, 7. In vitro, l&#39;applicazione di un campo elettrico in corrente continua a cellule coltivate imita il campo elettrico fisiologico e induce migrazione cellulare direzionale, o galvanotaxis. Galvanotaxis è stato studiato in fibroblasti, cheratinociti 8 9 pesci, epiteliale umano e cheratinociti corneali 10-12, linfociti 13, neuroblasti 2 e cellule progenitrici neuronali 14. Se esposto al campo applicato, la maggioranza delle cellule studiate migrare direzionalmente verso il catodica (-) poli. Tuttavia, diverse cellule tumorali, tra cui altamente metastaticole cellule del cancro al seno umano e della prostata umano linea di cellule di cancro PC-3M, passare al anodica (+) Polo 15, 16. Diversi meccanismi sono proposti a mediare galvanotaxis o per spiegare la capacità delle cellule di percepire il campo elettrico, tra cui l&#39;attivazione recettori di EGF 12, il canale del sodio epiteliale 17, PI3K e PTEN 18, e il rilascio di ioni calcio 15, 19. Il meccanismo non è ancora completamente compresa ed è possibile che più vie di segnalazione sono coinvolti in galvanotaxis. Il metodo galvanotaxis 2-dimensionale dimostriamo qui è utile per caratterizzare la migrazione direzionale aderenti, cellule mobili, sia per monitorare la migrazione singola cella 10, 12, 17 o migrazione di un foglio di cellule confluenti 18, 20. Questa tecnica è modificato dal Peng e Jaffe 21, e Nishimura et al. 10 con, camere di PVC trasparente su misura, con coversl rimovibileips consentendo il recupero delle cellule facile dopo galvanotaxis per l&#39;analisi secondaria, come l&#39;imaging immuno-fluorescenza. La superficie di vetro delle camere galvanotaxis è ottica compatibile, che consente le riprese ad alto ingrandimento e con cellule fluorescenza marcata. Inoltre permette il disegno sperimentale con modifica della superficie di vetro, ad esempio modificando il rivestimento o di superficie. Distanziatori realizzati No. 1 coprioggetti sono utilizzati nelle camere per minimizzare il flusso di corrente sulle celle; quindi il riscaldamento joule, che è proporzionale al quadrato del flusso di corrente, non surriscaldare le cellule durante l&#39;esperimento. I ponti di collegamento agar impediscono il contatto diretto degli elettrodi con le cellule e prevenire cambiamenti del pH medio o concentrazione di ioni durante galvanotaxis. Due linee cellulari di prostata umana non-cancerogeni sono stati esaminati per la loro risposta galvanotaxis in questo studio. I PRN-1-1 22 e 23 sono entrambi pnt2 SV40 immortalizzate, linee cellulari fattore dipendente dalla crescita esprimono marcatori epiteliali citocheratina 5, 8, 18 e 19 con bassa o nessuna espressione di antigene-specifica della prostata (PSA). Entrambe le linee cellulari mantengono la morfologia poligonale di cellule epiteliali normali, ma cromosoma anomalia è stata osservata in cariotipo 22, 24. Sebbene PRN-1-1 e pnt2 condividono comportamenti simili nella maggior parte degli esperimenti, fanno mostrano differenze nella formazione della struttura e in acinose galvanotaxis. Su una matrice 3-D, Matrigel, i PRN-1-1 cellule formano strutture acinose cave con lumen che assomiglia alla prostata normale della ghiandola tessuto 25. Tuttavia, le cellule pnt2 formano sferoidi solidi senza lumen o polarizzata dell&#39;epitelio 26. Le cellule PRN-1-1 dimostrano anche una risposta galvanotactic superiore alla pnt2 in questo studio. La correlazione tra la formazione della struttura acinar e galvanotaxis in PRN-1-1 suggerisce che i segnali galvanotactic possono svolgere un ruolo nell&#39;organizzazione della prmovimenti tessuto ghiandolare ostate in risposta a campi elettrici endogeni, e fornisce ulteriori caratteristiche di discriminare tra queste linee cellulari 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 cellule</td><td></td><td></td> prostatiche <td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>PNT2 cellule prostatiche</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">Medium e soluzioni</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>si riscalda fino a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150 10</td><td>% in PBS, riscaldare fino a 37 &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>aggiungere da 5 ml a 500 ml di terreno</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 e 1,5 mM KH2PO4 in 1.000 ml di H2 O, pH a 7,4 e sterilizzato in autoclave, riscaldamento fino a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>si riscalda fino a 37 gradi C prima dell'uso, trattare le cellule per 3-5 minuti a 37 gradi C</td></tr><tr><td colspan="4">Dispositivo di galvanotassi </td></tr><tr><td>Camere di galvanotassi</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>Camere in PVC trasparente non tossiche progettate su misura (1/4" x 2" x 3.5). Si prega di contattare gli autori per le specifiche di progettazione.</td></tr><tr><td>Elettrodi di galvanotassi</td><td>UCD electric shop</td><td></td><td>elettrodi a spirale di platino con cavi flessibili Scatola</td></tr><tr><td>di alimentazione per galvanotassi</td><td>Substrato Engineering, CA</td><td></td> uscita <td>di corrente continua progettata su misura con voltmetro</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio, grande, 45 x 50 mm, n. 1,5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio, piccolo, 25 x 25 mm, n. 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore a punta di diamante</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Sigillante siliconico di grado marino, trasparente</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>Grasso per alto vuoto</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 6 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Nichiryo, applicatori</td> in <td>cotone Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td>da 1,5 ml</tr><tr><td></td><td>Purtian Medical Products</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>Johnson & Tubi in PVC Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>fare 2% soluzione di agar</td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Attrezzature e software</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>funzionata con un rotore A-4-62</td></tr><tr><td>Cellometro Auto T4</td><td>Nexcelom</td> Camere di conteggio per cellometro <td>Auto T4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>carico 20 &#956; l soluzioni cellulari per contare</td></tr> la <tr><td>temperatura di coltura Piastra riscaldante</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>per mantenere le camere di galvanotassi a 37 gradi; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio Eclipse TE-2000 con tavolino motorizzato e camera climatica</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 lente obiettivo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX CCD camera</td><td>Qimaging</td><td></td><td>CCD camara, monocolore, 12 bit</td></tr><tr><td>Aria compressa con 5% di CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td>ordine speciale</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software di acquisizione immagini</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software di tracciamento cellulare e personalizzato per misurare gli angoli di migrazione</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 per Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando a disegno galvanotaxis chambers per studiare la migrazione direzionale di cellule della prostata

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

Il campo elettrico fisiologico serve funzioni biologiche specifiche, come dirigere la migrazione delle cellule in fase di sviluppo embrionale, escrescenza neuronale e epiteliale guarigione della ferita. L&#39;applicazione di un campo elettrico in corrente continua a cellule coltivate in vitro induce migrazione cellulare direzionale, o galvanotaxis. Il metodo galvanotaxis 2-dimensionale dimostriamo qui viene modificato con poli misura (cloruro di vinile) (PVC) camere, superficie di vetro, elettrodi di platino e l&#39;uso di uno stadio motorizzato su cui vengono esposte le cellule. Le camere di PVC e elettrodi di platino presentano bassa citotossicità e sono accessibili e riutilizzabili. La superficie di vetro e la fase di microscopio motorizzato migliorare la qualità delle immagini e consentono possibili modifiche alla superficie di vetro e trattamenti alle cellule. Abbiamo girato la galvanotaxis di due linee di cellule tumorali non-SV40-immortalata prostata, PRN-1-1 e pnt2. Queste due linee cellulari mostrano velocità di migrazione simili ed entrambe migrano versoil catodo, ma lo fanno mostrano un diverso grado di direzionalità in galvanotaxis. I risultati ottenuti con questo protocollo suggerire che i PRN-1-1 e le linee cellulari pnt2 possono avere diverse caratteristiche intrinseche che regolano le loro risposte migratori direzionali.

Due linee di cellule della prostata (PRN-1-1 e pnt2) sono stati studiati con questo metodo. Cellule in entrambe le linee migrano a velocità simili di 1,0 +/- 0,3 micron / min nel corso di 2 ore (Figura 5A). Tuttavia, la direzionalità al campo elettrico è di 0,7 +/- 0,3 per l'PRN-1-1 riga e 0,2 +/- 0,8 per la linea pnt2 (Figura 5B). I risultati mostrano una differenza significativa nella galvanotaxis di queste due linee cellulari (p &lt;0.01, 100 cellule sono state seguiti), suggerendo c...

Presentiamo un metodo per applicare un campo elettrico fisiologico alle cellule prostatiche immortalizzate in migrazione in una camera di galvanotassi fatta su misura. Utilizzando questo metodo, dimostriamo che 2 linee di cellule prostatiche non tumorigeniche dimostrano diversi gradi di direzionalità della migrazione sul campo.

Utilizzando a disegno Galvanotaxis Chambers per studiare la migrazione direzionale di cellule della prostata

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire Galvan Axxis, un saggio per valutare la migrazione direzionale delle cellule in un campo elettrico applicato. Ciò si ottiene assemblando prima e poi seminando una camera Galvan axxis con le celle di interesse. Nella seconda fase, la camera viene sigillata e viene applicato un campo elettrico per l'imaging time-lapse.Nella fase finale, viene tracciata la velocità di migrazione delle singole celle e l'angolo relativo al campo elettrico. Alla fine cofirma. Può essere utilizzato per mostrare come le celle rispondono al campo elettrico e se migrano direzionalmente verso il catodo.Il vantaggio principale di questa tecnica è il facile recupero delle cellule dopo la somministrazione di Texas per l'analisi secondaria e la facilità con cui la migrazione può essere filmata ad alto ingrandimento e con cellule marcate in fluorescenza. La visualizzazione di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di assemblaggio di una camera sono difficili da imparare senza dimostrazione per assemblare le camere inferiori. Inizia pulendo una camera di plastica galvan axxis con due propanolo.Quindi utilizzare una siringa per applicare il sigillante siliconico di grado marino attorno alle aperture circolari sul lato inferiore della camera. Disporre un grande bicchiere di copertura sopra il sigillante e premerlo in posizione con l'estremità di un applicatore di cotone, rimuovendo la colla in eccesso con il batuffolo di cotone. Quindi utilizzare un pennarello a punta di diamante per tagliare un piccolo vetro di copertura per creare spazi di sei per 25 millimetri e capovolgere la camera.Quindi, utilizzare una siringa per applicare due strisce di silicone, creando una superficie del canale di 10 x 25 millimetri per l'attacco delle celle tra le due aperture circolari sul vetro inferiore. Quindi incolla due spazi di vetro tra le aperture circolari, spingendo verso il basso gli spazi con un nuovo applicatore di cotone e rimuovendo la colla in eccesso come appena dimostrato. Provare la camera per 24 ore fino a quando la colla siliconica non si sarà indurita.Il giorno successivo, immergere la camera in acqua distillata durante la notte per rimuovere i residui di acido acetico dalla colla prima di seminare le cellule sulla camera. Asciugare e pulire le camere con due propanolo come appena dimostrato. Lavarli con PB S3 sterile volte e poi controllare il flusso del liquido tra le due aperture circolari nelle camere.Dopo aver verificato che le camere siano in buone condizioni di funzionamento, racchiuderle in piastre di coltura sterili e posizionare le camere a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Mentre le camere sono in equilibrio, staccare le cellule della prostata dal loro piatto di coltura con cinque millilitri di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, neutralizzare la reazione con cinque millilitri di FBS al 10%.In PBS, trasferire le cellule staccate in provette da 15 millilitri e poi centrifugare per cinque minuti. A 200 volte, G, aspirare il fluido e poi risospendere il pellet in un millilitro di terreno. Quindi, dopo aver contato le cellule, regolare la concentrazione delle cellule a otto per 10 a quattro cellule per millilitro con terreno di coltura e seme.350 microlitri di sospensione cellulare su ogni camera. Incubare le cellule nella camera per una notte in un piatto di coltura con una salvietta Kim bagnata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, iniziare l'assemblaggio delle camere superiori riscaldando prima 10 millilitri di coltura, a una temperatura media di 37 gradi Celsius per ogni camera AXS galva.Mentre il terreno si sta riscaldando, trasferire una camera Galvan axxis dall'incubatore su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius e sciacquare la camera con terreno di coltura. Per rimuovere le cellule non attaccate, lasciare 400 microlitri di terreno nella camera e quindi utilizzare una siringa per applicare il grasso ad alto vuoto sopra entrambi gli spazi di vetro. Sigillare la camera con un vetro di copertura e un applicatore di cotone, quindi asciugare la superficie del vetro.Quindi, applicare il grasso ad alto vuoto con una siringa per sigillare lo spazio tra il vetro di copertura e la camera. E poi aggiungere il terreno di coltura ai serbatoi interni. Rimuovere le bolle e controllare il flusso di liquido tra i serbatoi.Per realizzare i ponti di agar tagliare un paio di tubi in PVC da due pollici, capovolgerli e poi posizionare i pezzi in un becher da 100 millilitri. Quindi, aggiungere 200 milligrammi di agar bact toe in un pallone da 50 millilitri con 10 millilitri di terreno di coltura per ottenere un gel di agar al 2%. Dopo aver cotto nel microonde per 30 secondi, utilizzare una pipetta di trasferimento per caricare il gel di agar nel tubo di plastica e lasciare i ponti di agar a temperatura ambiente per 10 minuti per solidificare l'agar.Quindi aggiungere due millilitri di terreno di coltura ai serbatoi esterni della camera gal e inserire i ponti di agar nei serbatoi interno ed esterno del mezzo per condurre la corrente per eseguire l'imaging time-lapse della migrazione. Inizia trasferendo la camera Galvan in una camera ambientale a 37 gradi Celsius sul tavolino del microscopio, fissando la camera con del nastro adesivo e concentrandoti sulle celle sotto un obiettivo 10x. Quindi, inserire gli elettrodi Galvan Axxis nei serbatoi esterni con il catodo sul lato destro, fissando il filo e gli elettrodi con del nastro adesivo.Quindi accendere la scatola di alimentazione per applicare un campo elettrico alla camera e utilizzare un misuratore di tensione per misurare la tensione di uscita attraverso la camera per raggiungere i 2,5 volt per la camera lunga 25 millimetri. Ora seleziona 10 punti in tutta la camera per generare 10 filmati time lapse e imposta le condizioni di acquisizione a intervalli di 10 minuti per due ore. Quindi avvia le riprese e regola la corrente di uscita secondo necessità per mantenere l'intensità del campo durante l'esperimento.Al termine dell'esperimento, rimuovere la camera dal tavolino e fissare le cellule in alcool al 95%. Quindi apri la camera. Il vetrino coprioggetto può essere salvato per un secondo momento.Colorazione e imaging. Pulisci la camera per gli anni futuri. Per quantificare il Galvan Axxis, ruotare i filmati time-lapse per orientare il catodo verso la parte superiore delle immagini.Esporta i filmati nel software di tracciamento delle celle e traccia manualmente la posizione XY di 10-20 celle in ogni punto temporale di ogni film, le distanze di migrazione e gli angoli relativi alla direzione nord sud, lo stesso orientamento del campo elettrico verrà calcolato nel software di tracciamento delle celle. Infine, salva le misurazioni e importa i dati in un'applicazione di database per calcolare i risultati combinati. In questo esperimento rappresentativo di Galvan Axxis, è stato determinato che le linee di cellule della prostata migrano a velocità simili nel corso di due ore.Tuttavia, la direzionalità al campo elettrico era 0,7 più meno 0,3 per il PRNS una linea e 0,2 più meno 0,8 per la PNT due linee, indicando una differenza significativa nell'asse Galvan di queste due linee cellulari, suggerendo che i loro meccanismi di segnalazione cellulare indirizzano le risposte di migrazione differenziale al campo elettrico Dopo lo sviluppo del metodo Govan Texas. Questa tecnica aiuta i ricercatori a esplorare i meccanismi della migrazione cellulare direzionale nel campo elettrico.

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