Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine ​​con metiltransferasi e cofattore Analoghi

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è quello di marcare in modo specifico il DNA e le proteine utilizzando metiltransferasi, che trasferiscono naturalmente il gruppo metilico attivato e il cofattore Sile l-metionina chiamato aome a D-N-A-R-N-A. Proteine o piccole biomolecole. La marcatura in un solo passaggio si ottiene sostituendo il cofattore naturale omesso con cofattori sintetici di aina che modificano il corso della reazione portando all'accoppiamento enzimatico dell'intero cofattore e quindi alla marcatura covalente della sequenza del substrato La marcatura specifica del DNA indotta dalla metiltransferasi è dimostrata con la DNA metiltransferasi specifica dell'adina, M-B-S-E-C, che accoppia il cofattore Aine biotinilato sei BAZ alla sequenza di riconoscimento A-G-C-G-A-T che porta alla sequenza, in particolare biotinilata, il trasferimento diretto della DNA metiltransferasi di gruppi attivati è l'uso della proteina etichetta ed è dimostrato utilizzando MTA set sette nove, che trasferisce un gruppo pro pargo da C otto oino a lisina quattro dell'istone H tre.

Il residuo di lisina alchilata viene marcato chimicamente da un Fluor azi modificato utilizzando la chimica click catalizzata dal rame, portando così a una proteina specificamente marcata. Un vantaggio dell'utilizzo delle metanfetasi per l'etichettatura è che hanno il potenziale per colpire direttamente i substrati nativi. Dimostrerò questo mediante l'euforia bioTE sequenziale specifica del plasmide, la DNA metanfetamina transferasi, la modificazione delle proteine catalizzate con il cofattore analogo zin e consente l'introduzione di un'ampia varietà di gruppi reporter in due fasi.

Lo dimostrerò marcando a fluorescenza la proteina isone H tre e mostrando i risultati della marcatura H tre con la biotina. Inoltre, gli analoghi del cofattore a doppia attivazione possono essere facilmente sintetizzati caricando S ail, el omocisteina, il prodotto del cofattore dopo il trasferimento del gruppo metilico con vari alcoli attivati. Gli analoghi sintetici del cofattore sono purificati mediante HPLC in fase inversa e, in alcuni casi, è anche possibile separare l'epi Marte allo zolfo.

Il DNA sorridente è una marcatura del DNA indotta dalla metiltransferasi specifica della sequenza. Qui il concetto è dimostrato marcando il DNA plasmidico PB 3 22 con sei cofattori BAZ Aine e la DNA metiltransferasi specifica dell'adina. M-B-S-E-C si inizia con il movimento dei sei BAZ a 20 gradi Celsius.

Una volta pensato, riparare la miscela di reazione sul ghiaccio. Include un microgrammo di plasmide, 60 micromolari di sei BAZ e 10 equivalenti di M-B-S-E-C uno. Sequenza di riconoscimento HER sul DNA nel tampone di modifica.

Assicurati di aggiungere i sei BAZ e M-B-S-E-C per ultimi. Assicurati che non ci sia AME legato alla metanfetamina transferasi che stai usando perché il cofattore naturale bloccherà l'etichettatura. Reagisci per i controlli.

Sostituire gli MTA con acqua per visualizzare eventuali modifiche non specifiche del cofattore e aggiungere acqua al posto del cofattore per verificare la presenza di cofattore naturale nel concentrato enzimatico. Ora mescola delicatamente le reazioni con una pipetta e incubale a 55 gradi Celsius per un'ora. Verso la fine dell'incubazione, riparare una miscela di endonucleasi su ghiaccio aggiungendo 10 microlitri di tachimetro ricombinante, un tampone a 80 microlitri di acqua e quindi aggiungendo 3,3 microlitri di endonucleasi di restrizione tak one ricombinante.

Dopo l'incubazione, tirare le reazioni con una rapida rotazione e quindi verificare la modifica del DNA in ciascuna. Aggiungere due microlitri di 10 x tak, un tampone e 28 microlitri della miscela di endonucleasi. Miscelare le reazioni con un pipettaggio delicato.

Ora incubare le reazioni a 65 gradi Celsius per mezz'ora. Quando le reazioni sono complete, estrarre la soluzione con una rapida rotazione e raccogliere 25 microlitri di reazioni in nuove provette. A queste aliquote, aggiungere 2,4 microlitri di streptococco TTR tamponato a un millimolare per monomero di strept adin.

Ora incubare questa reazione per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque microlitri di sei tamponi di carico alle reazioni completate e consumare 10 microlitri su un gel agros all'1% a 80 volt per circa un'ora. Quindi visualizza le bande mt A è l'abbreviazione di trasferimento diretto con metiltransferasi di gruppi attivati.

In questa dimostrazione, la metiltransferasi set sette, nove e il cofattore C otto ha attivato doppio. Oin sono usati per etichettare la lisina quattro del suo istone H tre. Dopo aver scongelato i componenti su miscele di reazione da 20 microlitri per la riparazione del ghiaccio, la soluzione del saggio contiene un tampone di modifica 10 micromolari di istone H tre e ha aggiunto gli ultimi 10 micromolari di metiltransferasi più 600 micromolari di cofattore.

Effettuare un controllo enzimatico sostituendo l'acqua deionizzata con il C otto ON. Effettuare anche un controllo cofattoriale per visualizzare le modifiche non specifiche includendo 60 millimolari di ADO incontrati per competere con i cofattori sintetici. Ora mescola le reazioni con la peste lenta dei tubi e controlla il loro pH con strisce reattive. Gli analoghi del cofattore a doppia attivazione vengono conservati in condizioni C.

Pertanto, il pH della soluzione di reazione può cambiare aggiungendo un fattore co, se necessario, a piccole quantità di idrossido di sodio da 50 millimolari per regolare il pH. Ora incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per due ore durante la riparazione dell'incubazione. Un gel di poliacrilammide SDS al 12% appena prima della fine dell'incubazione, fare 20 microlitri di miscela cinque x click contenente tre millimolari di solfato di rame, tre millimolari T-H-P-T-A ligando 250 millimolari, esca ACO di sodio e sei millimolari di Tamara azide.

Al termine dell'incubazione, aggiungere cinque microlitri di click mix a ciascuna reazione e mescolare lentamente le reazioni per accarezzamento. Proteggere le reazioni dalla luce con un foglio di alluminio e incubarle a 20 gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere il cloroformio in eccesso facendo precipitare le proteine.

Aggiungere 75 microlitri di metanolo, 18,7 microlitri di cloroformio e 50 microlitri di acqua a ciascuna reazione e farli vorticare brevemente Dopo ogni aggiunta. Dopo aver preparato ogni tubo, centrifugarli a 16.000 g per cinque minuti. Rimuovere la fase superiore della separazione senza disturbare lo strato di interfaccia, che contiene le proteine.

Ora aggiungi 56,3 microlitri di metanolo, la fase inferiore e il vortice. Quindi, spingilo verso il basso per pellettare la proteina e scartare il supinato. Quindi aggiungere 56,3 microlitri di metanolo.

Ancora una volta, vortice. Ripetere la centrifuga e recuperare i pellet. Lasciate asciugare i pellet nei loro tubi, senza tappo e coperti con carta priva di lanugine.

Successivamente sciogliere le proteine in 20 microlitri di tampone di caricamento SDS con colorante di caricamento. Sciacquare le pareti del tubo con il tampone per raccogliere il pellet. Quindi incubare le provette a 95 gradi Celsius per 10 minuti.

Una volta che le provette hanno raggiunto la temperatura ambiente, spenderle brevemente per estrarre il loro contenuto e visualizzare le proteine tramite la pagina SDS. Funziona a 120 volt per circa 90 minuti. La reazione di sorriso è stata effettuata con la DNA metiltransferasi M-B-S-E-C, che modifica il secondo residuo di adenina all'interno della sequenza A-T-C-G-A-T a doppio filamento e ha un sito di riconoscimento sul plasmide PBR 3 2 2, che è contrassegnato in rosso per testare l'etichettatura del plasmide.

PB 3 2 2 è stato sfidato con la restrizione ricombinante ENDONUCLEASI T uno, che ha sette siti su PB 3 22 contrassegnati in verde, uno dei quali è incluso all'interno del sito M-B-S-E-C uno. Quando avviene l'etichettatura, questo sito deve essere protetto contro la scissione nel gel. Ciò è stato confermato.

È apparso un nuovo frammento con 683 coppie di basi, dimostrando che c'era una marcatura nel sito M-B-S-E-C. Questo si vede solo nella corsia di analisi, che è la corsia tre. La specificità della reazione di marcatura è stata dimostrata dallo spostamento dell'elettromobilità.

Dopo l'aggiunta di strept adin, l'elettromobilità del frammento di coppia di basi 683 marcato con biotina è stata ritardata. Mentre la mobilità dei frammenti senza il sito M-B-S-E-C è rimasta invariata, o una marcatura in due fasi dei substrati della metiltransferasi con otto analoghi oh met a doppia attivazione. Sono stati utilizzati l'istone H tre lisina quattro metil transferasi set sette nove e il piccolo cofattore C otto ON.

L'elettroforesi su gel è stata utilizzata per il rilevamento della fluorescenza solo nella corsia di saggio. La corsia uno mostrava una banda fluorescente corrispondente all'istone H tre, indicando che la catena laterale del cofattore era stata specificamente trasferita e la proteina modificata era marcata con la Tamara Flora. La colorazione ESI funge da controllo del carico.

Tutte le corsie hanno mostrato la stessa quantità di proteine. I substrati della metiltransferasi possono anche essere marcati con reazioni di biotina con una biotina derivata da azi. Al posto di un Fluor sono stati dosati mediante Western blotting con perossidasi di rafano.

L'etichettatura coniugata Aden riuscita e specifica è stata vista dopo aver visto questo video. Dovresti avere una buona comprensione di come etichettare il DNA e la sequenza proteica, in particolare con il testo di affinità, la forza fluorescente o altre etichette. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che altri met e i suoi analoghi sono sensibili alla temperatura.

Maneggiali sempre con ghiaccio e conservali a meno 20 gradi Celsius. Ho sintetizzato la doppia attivazione. Altri analoghi MET con il gruppo reporter erano già integrati nella catena laterale e li hanno utilizzati per marcare specificamente il DNA in un unico passaggio.

Sono particolarmente entusiasta della prospettiva di combinare diversi enzimi e gruppi di report per la mappatura del DNA utilizzando tecniche a singola molecola. Smiling e NEC sono molto flessibili e quasi tutti i gruppi chimici possono essere trasferiti non solo al DNA e alle proteine, ma anche all'RNA e alle piccole macchine utilizzando appropriati trasferimenti di metanfetamine.