La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare le concentrazioni di molte proteine tra campioni mediante spettrometria di massa utilizzando la proteomica pronta all'uso. Questo viene ottenuto innanzitutto digerendo le proteine di ciascun campione per generare miscele di peptidi. Successivamente, i due campioni vengono mescolati e i peptidi nel campione misto vengono frazionati e desalati.

Successivamente, il campione misto viene analizzato mediante spettrometria di massa. Infine, i peptidi vengono identificati confrontando gli spettri MS con un database target-decoy di tutti i peptidi potenziali presenti nei campioni e viene quantificata l'abbondanza relativa dei peptidi tra i campioni. In definitiva, la proteomica rapida consente la quantificazione dell'abbondanza relativa di numerose proteine tra campioni complessi.

I principali vantaggi della demetilazione riduttiva rispetto ad altri metodi di marcatura isotopica stabile, come iLite, consistono nel fatto che ready è un metodo rapido, economico e accurato che non richiede trois specifici o un mezzo sintetico, il che significa che può essere applicato a quasi ogni tipo di campione. Per iniziare, preparare un milligrammo di proteina cellulare e 500 microlitri utilizzando la sonificazione o una pressa francese per lisare le cellule e precipitare le proteine. Aggiungere un volume di acido tricloroacetico a quattro volumi di proteina e raffreddare in ghiaccio per 10 minuti.

Centrifugare a 12.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il soprannatante. Quindi utilizzare un millilitro di acetone freddo per risospendere il pellet prima di una seconda centrifugazione.

Dopo aver aspirato il surnatante, essiccare il pellet in un blocco termico a 56 gradi Celsius per denaturare le proteine e ridurre i legami solfuro del colorante. Utilizzare 500 microlitri di tampone denaturante e riducente per ricostituire. Ri-sospendere le proteine a circa due milligrammi per millilitro.

Incubare le proteine per 30 minuti a 56 gradi Celsius, seguiti da 10 minuti a temperatura ambiente. Per alchilare i gruppi solfuro liberi, aggiungere 25 microlitri di iodioacetammide 0,3 molare appena preparata in acqua a 500 microlitri di proteina e incubare al buio per 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo 10 microlitri di DTT 3 millimolare.

Conservare le proteine alchilate a meno 80 gradi Celsius. Per digerire le proteine alchilate dopo la precipitazione con acido tricloroacetico, utilizzare urea uno molare in 50 millimolari di eis a pH 8,2 per risospendere la proteina. Preparare una soluzione madre di Lysol, endoproteinasio o ly C in acqua a una concentrazione di due microgrammi per microlitro e aggiungere l'enzima alla proteina digerita a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per microlitro. I campioni vengono lasciati a temperatura ambiente per sei ore o tutta la notte. Sospendere 20 microgrammi di tripsina di grado sequenza in 40 microlitri di acido acetico 50 millimolare e aggiungere cinque microlitri alla reazione di digestione con lyce.

Incubare per sei ore a 37 gradi Celsius con le proteine alchilate. Aggiungere acido trifluoroacetico o TFA fino a una concentrazione finale dello 0,5%. Collegare una colonna C 18 a un manifold di estrazione. Successivamente, utilizzare sei millilitri di acetonitrile o ACN per bagnare la colonna.

Successivamente, con la portata più elevata possibile, utilizzare sei millilitri di acetonitrile (CN) al 80% con TFA 0,1% per lavare la colonna, prima di utilizzare sei millilitri di TFA 0,1% per equilibrare la colonna, interrompere la pressione sotto vuoto e caricare 500 microgrammi di peptidi sulla colonna a una portata di circa un millilitro al minuto. Una volta che i peptidi si sono legati alla colonna, riavviare il vuoto e, con la portata più elevata possibile, utilizzare prima TFA 0,1% e poi tre millilitri di tampone acido citrico per lavare la colonna al fine di eseguire la metilazione dimetilica riduttiva o l'etichettatura pronta. Sotto una cappa chimica, preparare 12 millilitri ciascuno di tampone leggero e pesante pronti per metilare i peptidi liberi.

Aggiungere 10 millilitri di tampone pronto leggero o pesante sulla colonna a un flusso di un millilitro al minuto. Dopo aver applicato un secondo aliquota di 10 millilitri, per garantire l'etichettatura utilizzare sei millilitri di TFA 0,1%, seguiti da un millilitro di acido acetico 0,5%.

Per lavare la colonna ed eluire le proteine, arrestare il vuoto e applicare un millilitro di acido acetico CN 0,5% al 40% a un flusso di 0,5 millilitri al minuto. Quindi aggiungere un millilitro di acido acetico CN 0,5% all'80% ed eluire con una siringa da cinque millilitri se desiderato. Mescolare i campioni di peptidi marcati pesanti e leggeri in un rapporto uno a uno e quantificare mediante spettrometria di massa per assicurare che entrambe le marcature, pesante e leggera, siano state efficaci. Frazionare la miscela di peptidi applicandola prima a una colonna HPLC C18.

Successivamente, dopo aver utilizzato il 5% di ACN per lavare la colonna per cinque minuti, applicare un gradiente dal 5% al 35% di ACN nell'arco di 60 minuti per eluire i peptidi in frazioni uguali. In una piastra a 96 pozzetti, seguito da 90% di ACN per un minuto. Dopo ulteriori quattro minuti con 90% di ACN, utilizzare il 5% di ACN per reequilibrare la colonna.

Quindi combinare le frazioni nel seguente modo utilizzando il centrifugo sotto vuoto. Rimuovere il solvente dalle frazioni combinate. Successivamente, utilizzare 130 microlitri di urea uno molare con TFA 0,5% per la risospensione.

Sospendere i peptidi dalle seguenti frazioni e conservare il set di frazioni a meno 20 gradi Celsius per eseguire l'estrazione stop and go sulle frazioni risospese. Preparare microcolonne a punta C18 da puntali per pipetta da 200 microlitri utilizzando due dischi C18 con un diametro interno di 1,07 millimetri per riempirli. Posizionare le punte in provette da microcentrifuga e aggiungere 130 microlitri di metanolo ed eseguire una centrifugazione.

Quindi aggiungere 130 microlitri di acido acetico all'80% in acetonitrile (ACN) con aggiunta dello 0,5% di acido acetico prima di centrifugare nuovamente, dopo aver utilizzato 130 microlitri di TFA 0,1% per equilibrare le punte, trasferire la miscela di peptidi sulle punte e lavare. Prima con 130 microlitri di TFA 0,1%, seguiti da 40 microlitri di TFA 0,1%. Quindi 40 microlitri di acido acetico 0,5% per eluire i peptidi.

Per prima cosa, aggiungere 20 microlitri di 40% a un acido acetico CN 0,5%. Quindi, 20 microlitri di 80% a un acido acetico CN 0,5%. Combinare gli IIT e il filtrato sotto vuoto fino a essiccazione per eseguire una cromatografia liquida microcapillare.

La spettrometria di massa in tandem o L-C-M-S-M-S inizia utilizzando acido formico al 5% e ACN al 5% per risospendere le proteine a una concentrazione di circa un microgrammo per microlitro. Applicare circa un microgrammo di peptidi su una colonna HPLC in fase inversa C18 di 100 micrometri per 20 centimetri ed eluire utilizzando un gradiente dal 6% al 22% di ACN in acido formico 0,125% a una portata di circa 300 nanolitri al minuto, applicato nell'arco di 75-100 minuti.

Utilizzare uno spettrometro di massa ad alta risoluzione e alta accuratezza di massa e identificare i peptidi nel campione confrontando i file grezzi degli spettri Ms.Ms con un database teorico mediante un algoritmo come SE quest, utilizzando i parametri mostrati qui e il database di frame di lettura aperti nelle orientazioni diretta e inversa; filtrare i peptidi a un tasso di falsa scoperta dell'1% con un metodo come quello target decoy. Per quantificare i peptidi identificati, calcolare le aree delle coppie pesanti e leggere dei cromatogrammi estratti dagli ioni MS uno e i rapporti segnale-rumore dei peptidi; includere solo le coppie di peptidi il cui rapporto medio segnale-rumore sia superiore a cinque. Quantificare l'abbondanza relativa di un peptide nei due campioni come rapporto tra le aree dei picchi MS uno delle versioni pesanti e leggere dello stesso peptide; calcolare le abbondanze proteiche relative come rapporto mediano delle aree dei picchi MS uno per tutti i peptidi della proteina, dopo aver filtrato a un tasso di falsa scoperta del 1% a livello di peptidi.

L'efficienza di marcatura pronta di una miscela di c phyto ferment proveniente da colture marcate pesanti e leggere che contengono 11.194 sequenze uniche di peptidi è stata del 98%. Il lisato proteico di visier non frazionato è stato analizzato in modo analogo. Le differenze nell'espressione proteica riflettono in modo riproducibile i rapporti con cui i campioni pesanti e leggeri sono stati miscelati, in un'ampia gamma di rapporti di miscelazione. In particolare, la variazione del fold change del 99% delle proteine è risultata inferiore a 1,6 per i campioni miscelati uno a uno, nonché per i campioni in rapporto uno a dieci e dieci a uno.

Il 99% delle proteine era entro un fattore di 3,8 rispetto al rapporto atteso, mostrando un aumento della deviazione standard a distanze maggiori da una miscela uno a uno. Quando la marcatura rapida è stata applicata al proteoma di Clostridium phytofermentans, sono state quantificate più di 2000 proteine, con il 94% delle proteine misurate entro livelli doppi per colture replicate cresciute su glucosio. Anche le variazioni per coppie duplicate di colture erano altamente correlate.

Nel complesso, questi esperimenti dimostrano che la proteomica Ready è un metodo accurato e riproducibile per quantificare le differenze di espressione proteica tra campioni complessi. Poiché questa tecnica può essere applicata praticamente a ogni tipo di campione, ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per esplorare le variazioni di espressione proteica in ogni genere di campione, inclusi microrganismi nuovi, cellule di pesce e di mammifero.