La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di confrontare le concentrazioni di molte proteine tra i campioni mediante spettrometria di massa utilizzando la proteomica pronta. Ciò si ottiene digerendo prima la proteina da ciascun campione per generare miscele di peptidi. Successivamente, i due campioni vengono miscelati e i peptidi nel campione miscelato vengono frazionati e dissalati.

Successivamente, il campione miscelato viene analizzato mediante spettrometria di massa. Infine, i peptidi vengono identificati confrontando gli spettri MS two con un database di esche target di tutti i potenziali peptidi nei campioni e viene quantificata l'abbondanza relativa di peptidi tra i campioni. In definitiva, la proteomica pronta consente la quantificazione dell'abbondanza relativa di molte proteine tra campioni complessi.

I principali vantaggi della demetilazione riduttiva rispetto ad altri metodi per la marcatura di isotopi stabili come iLite, è che ready è un metodo veloce, economico e accurato che non richiede trois specifici o un mezzo sintetico, il che significa che può essere applicato a quasi tutti i tipi di campioni. Per iniziare, prepara un milligrammo di proteina cellulare e 500 microlitri utilizzando la sonicazione o una pressa francese per far precipitare le cellule e far precipitare le proteine. Aggiungere un volume di acido triclorotico a quattro volumi di proteine e raffreddare con ghiaccio per 10 minuti.

Centrifugare a 12.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Quindi utilizzare un millilitro di acetone ghiacciato per Resus. Sospendere il pellet prima di centrifugare una seconda volta.

Dopo aver aspirato lo snat, asciugare il pellet in un blocco termico a 56 gradi Celsius per denaturare le proteine e ridurre i legami solfuro colorante. Utilizzare 500 microlitri di tampone denaturante e riducente per reus. Risospendere le proteine a circa due milligrammi per millilitro.

Incubare le proteine per 30 minuti a 56 gradi Celsius, seguiti da 10 minuti a temperatura ambiente. Accanto ai gruppi solfuro liberi da alchilati, aggiungere 25 microlitri di IDO acetamide 0,3 molare appena preparato in acqua a 500 microlitri di proteine e incubare al buio per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, spegnere la reazione aggiungendo 10 microlitri di DTT da tre millimolari.

Conservare le proteine alchilate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per digerire le proteine alchilate dopo la precipitazione del TCA, utilizzare un'urea molare in heis da 50 millimolari a pH 8,2 per risospendere la proteina. Preparare una soluzione madre di Lysol, endo proteinasi o ly C in acqua a una concentrazione di due microgrammi per microlitro e aggiungere l'enzima alla proteina digerita a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per microlitro I campioni vengono lasciati a temperatura ambiente per sei ore o durante la notte. Sospendere 20 microgrammi di tripsina di grado sequenziale in 40 microlitri di acido acetico 50 millimolare e aggiungere cinque microlitri alla reazione di digestione del lyce.

Incubare per sei ore a 37 gradi Celsius alle proteine alchilate. Aggiungere acido acetico tri fluor o TFA a una concentrazione finale dello 0,5%Collegare una colonna C 18 a un collettore di estrazione. Quindi utilizzare sei millilitri di aceto nitrile o un CN per bagnare la colonna.

Successivamente, con la massima portata possibile, utilizzare sei millilitri di 80% a CN 0,1% TFA per lavare la colonna prima di utilizzare sei millilitri di 0,1% TFA per equilibrare la colonna, arrestare la pressione del vuoto e caricare 500 microgrammi di peptidi sulla colonna a una portata di circa un millilitro al minuto. Una volta che i peptidi sono legati alla colonna, riavviare il vuoto e con la massima portata possibile, utilizzare lo 0,1% di TFA seguito da tre millilitri di tampone di acido citrico per lavare la colonna per eseguire l'etichettatura onco, riduttiva, attenuata o pronta. Sotto una cappa chimica, preparare 12 millilitri ciascuno di tamponi pronti leggeri e pesanti Tom Methylate peptide free.

A significa aggiungere 10 millilitri di tampone pronto leggero o pesante alla colonna a una portata di un millilitro al minuto. Dopo aver applicato una seconda aliquota da 10 millilitri. Per garantire l'etichettatura, utilizzare sei millilitri di TFA allo 0,1%, seguiti da un millilitro di acido acetico allo 0,5%.

Per lavare la colonna per eluire le proteine, fermare il vuoto e applicare un millilitro di acido acetico al 40% a un CN 0,5% di acido acetico a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto. Quindi aggiungere un millilitro di acido acetico all'80% CN 0,5%, eluire con una siringa da cinque millilitri, se lo si desidera. Miscelare un rapporto uno a uno di campioni di peptidi marcati con peso pesante e leggero e quantificare mediante spettrometria di massa per garantire che sia la marcatura che la marcatura leggera fossero efficaci per frazionare la miscela di peptidi applicandola prima a una colonna HPLC C 18.

Quindi, dopo aver utilizzato il 5% di CN per lavare la colonna per cinque minuti, utilizzare un gradiente dal 5% al 35% di CN nell'arco di 60 minuti per eluire i peptidi in frazioni uguali. In una piastra a 96 pozzetti, seguita da 90% A CN per un minuto. Dopo altri quattro minuti di CN al 90%A, utilizzare il CN al 5% per riequilibrare la colonna.

Quindi unire le frazioni nel modo seguente con la centrifuga sottovuoto. Rimuovere il solvente dalle frazioni combinate. Quindi utilizzare 130 microlitri di urea molare 0,5% TFA a Resus.

Sospendi i peptidi dalle frazioni successive e conserva l'insieme delle frazioni a 20 gradi Celsius negativi per eseguire, fermare e andare l'estrazione sulle frazioni risospese. Preparare le microcolonne per puntali C 18 stage da puntali per pipette da 200 microlitri utilizzando due dischi C 18 con un diametro interno di 1,07 millimetri per imballarle. Posizionare le punte del tavolino in provette da microcentrifuga e aggiungere 130 microlitri di metanolo e centrifugare.

Quindi aggiungere 130 microlitri di acido acetico all'80% CN 0,5% prima di centrifugare nuovamente dopo aver utilizzato 130 microlitri di TFA allo 0,1% per equilibrare le punte, trasferire la miscela di peptidi sulle punte e lavare. Primo con 130 microlitri di TFA allo 0,1% seguiti da 40 microlitri di TFA allo 0,1%. Quindi 40 microlitri di acido acetico allo 0,5% per eluire i peptidi.

Per prima cosa, aggiungi 20 microlitri di acido acetico al 40% a CN 0,5%. Quindi 20 microlitri di acido acetico 80%a CN 0,5%. Combinare gli IIT e il filtrato sottovuoto per essiccare per eseguire la cromatografia liquida microcapillare.

La spettrometria di massa tandem o L-C-M-S-M-S inizia utilizzando il 5% di acido formico, il 5% di A CN per risospendere le proteine a una concentrazione di circa un microgrammo per microlitro. Applicare circa un microgrammo di peptidi su un C 18 di 100 micrometri per 20 centimetri. Colonna HPLC in fase inversa ed eluizione utilizzando un gradiente da sei a 22% di un CN in acido formico allo 0,1 25% a una velocità di flusso di circa 300 nanolitri al minuto, applicato in 75-100 minuti.

Utilizzare uno spettrometro di massa ad alta risoluzione e alta precisione di massa e identificare i peptidi nel campione confrontando i file grezzi di Ms.Ms Spectra con un database teorico con un algoritmo come SE quest, utilizzando i parametri mostrati qui con il database di frame di lettura aperti negli orientamenti effettivi e inversi filtra i peptidi a un tasso di falsa scoperta dell'1% con un metodo come l'esca bersaglio. Per quantificare i peptidi identificati, calcolare le aree delle coppie pesanti e leggere di MS uno cromatogrammi ionici estratti e i rapporti segnale/rumore dei peptidi includono le coppie peptidiche solo quando il loro rapporto segnale/rumore medio è superiore a cinque. Quantificare l'abbondanza relativa di un peptide nei due campioni come rapporto tra MS e le aree di picco delle versioni pesanti e leggere dello stesso peptide, calcolare le abbondanze proteiche relative come il rapporto mediano MS di un'area di picco per tutti i peptidi nella proteina quando filtrato a un tasso di falsa scoperta del peptide dell'1%.

L'efficienza di marcatura pronta di un mix di fermento di fito c da colture marcate pesanti e leggere che contengono 11.194 sequenze peptidiche uniche è stata analizzata in modo simile al 98% Il lisato proteico di visier non frazionato. Le differenze di espressione proteica riflettono in modo riproducibile i rapporti con cui i campioni pesanti e leggeri sono stati miscelati in un'ampia gamma di rapporti di miscelazione. In particolare, la variazione del 99% delle proteine era inferiore a 1,6 per i campioni misti uno-a-uno nei campioni da uno a 10 e da 10 a uno.

Il 99% delle proteine era entro 3,8 volte il rapporto atteso, mostrando un aumento della deviazione standard a una distanza maggiore da una miscela uno-a-uno. Quando la marcatura pronta è stata applicata al proteoma fitofermentato di Clostridium, sono state quantificate più di 2000 proteine con il 94% di proteine misurate entro livelli doppi per colture replicate che crescono sul ripiegamento delle proteine del glucosio. Anche i cambiamenti per coppie di colture duplicate erano altamente correlati.

Insieme, questi esperimenti supportano che la proteomica Ready è un metodo accurato e riproducibile per quantificare le differenze di espressione proteica tra campioni complessi. Poiché questa tecnica può essere applicata praticamente a qualsiasi tipo di campione, ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per esplorare i cambiamenti di espressione delle proteiche in tutti i tipi di campioni, compresi nuovi microbi, cellule di pesci e mammiferi.