Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di separare le due principali popolazioni cellulari ottenute da campioni di biopsia muscolare umana con un'elevata efficienza e resa per consentire la valutazione di specifici marcatori fenotipici e dei fattori di trascrizione. Ciò si ottiene dissociando prima un campione di biopsia muscolare umana in una sospensione a cellula singola nella seconda fase. Dopo una coltura di sette giorni, le cellule vengono separate da microsfere immunomagnetiche che si smistano in CD 56 positive, che sono cellule miogeniche, e frazioni CD 56 negative, che sono i fibroblasti.

Le cellule vengono quindi colorate e sottoposte a imaging per individuare i marcatori fenotipici e proteici desiderati di interesse. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza e l'analisi quantitativa delle immagini possono essere utilizzate per misurare l'intensità di fattori di trascrizione nucleari localizzati selezionati all'interno delle popolazioni cellulari selezionate. I principali vantaggi di questa tecnica, che utilizza la selezione immunomagnetica delle cellule rispetto ai metodi esistenti come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, sono che è delicata, consente un'eccellente selezione delle cellule muscolari primarie umane con l'alta resa e vitalità e può essere eseguita rapidamente.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'aumento della nostra comprensione delle basi cellulari della degenerazione muscolare fibrograssa osservata nell'invecchiamento, così come in una serie di patologie muscolari Per isolare le cellule precursori derivate dal muscolo il prima possibile dopo aver ottenuto la biopsia. Innanzitutto, determinare il peso del campione di tessuto e quindi gonfiare più volte il muscolo in mezzo basale per eliminare il campione dal sangue in eccesso. Lasciare sedimentare il muscolo a temperatura ambiente per 30-60 secondi, quindi aspirare tutti i due o tre millilitri di terreno dal tubo, tranne gli ultimi due o tre millilitri.

Quindi, capovolgere il tubo su una capsula di Petri sterile per consentire al fluido rimanente di trasportare il muscolo sulla piastra. Ora pulisci il campione da tutti i pezzi visibili di grasso o tessuto connettivo evidente. Quindi ruotare il piatto per mobilitare il terreno rimanente, quindi aspirare tutto il terreno e aggiungere tre millilitri di una soluzione enzimatica di collagenasi e disbe per 100-400 milligrammi di tessuto e tagliare il campione muscolare in pezzi cubici molto piccoli da uno a due millimetri

Quando il campione è sufficientemente tritato. Utilizzare una pipetta larga da 25 millilitri di cinghiale per trasferire i frammenti di tessuto e la soluzione enzimatica in una provetta conica sterile da 10 a 20 millilitri. Lavare la piastra con altri tre millilitri di soluzione enzimatica e quindi utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire eventuali frammenti muscolari rimanenti nella provetta.

Posizionare il tubo a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Ripetere la sospensione tissutale ogni 15 minuti con una pipetta da 10 millilitri. Quindi terminare la dissociazione enzimatica con almeno una quantità equivalente di terreno di coltura fresco riscaldato.

Successivamente, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 100 micrometri per rimuovere eventuali pezzi di detriti di grandi dimensioni e quindi centrifugare le cellule in eccesso. Sospendere il pellet in sette-otto millilitri di terreno di crescita, quindi incubare le cellule in un pallone di coltura tissutale T 25 non rivestito. A 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sette giorni.

Alla fine della settimana, la tripsina osserva il monostrato cellulare per tre minuti. Quando le cellule si sono staccate, aggiungere da cinque a 10 millilitri di crescita del muscolo scheletrico, mezzo per prevenire una digestione eccessiva e applicare pellet le cellule mediante centrifugazione. Quindi, dopo il conteggio, riservare alcune delle cellule per la caratterizzazione dei marcatori della linea cellulare e lavare le cellule rimanenti in 15 millilitri di guadagno di centrifuga PBS.

Questa volta risospendere il pellet in 170 microlitri di tampone di selezione max a temperatura ambiente e pipettare delicatamente per risussuscitare. Sospendere le cellule a 35 microlitri di microsfere magnetiche coniugate anticorpi anti CD 56 ben miscelate. Mescolare la soluzione cellulare alcune volte con una pipetta e incubare la miscela per 15 minuti a quattro gradi Celsius con una vegetazione delicata.

A metà strada dopo l'incubazione, lavare la soluzione di cellule e perline con 10 millilitri di centrifuga tampone di selezione e reus. Sospendere il pellet in un millilitro di tampone di selezione fresco. Quindi, lubrificare il filtro di separazione pres e la colonna con 500 microlitri di tampone di approvvigionamento.

E poi mescolare e trasferire immediatamente l'intero millilitro di sospensione cellulare attraverso il filtro di preseparazione e nella colonna, sciacquare la colonna tre volte con un millilitro di tampone di approvvigionamento power wash, raccogliendo la frazione di fibroblasti non trattenibile, passando attraverso la colonna in un tubo conico sterile da 50 millilitri contenente una piccola quantità di terreno di crescita. Quindi rimuovere la colonna dal magnete e premere lo stantuffo nella parte superiore della colonna per raccogliere la frazione di celle positive CD 56. In un tubo conico separato da 50 millilitri contenente la crescita calda, da questo passaggio viene emesso un terreno di crescita medio.

Se è necessario eseguire il doppio smistamento, considerare le frazioni cellulari raccolte positive e negative. Se è necessario un doppio approvvigionamento per una maggiore purezza, non posizionare i terreni nella provetta di raccolta positiva CD 56 sul primo tipo, ma ripetere i passaggi a partire dalla lubrificazione del filtro e della colonna al punto finale sperimentale appropriato. Fissare le colture cellulari positive CD 56 nel loro terreno di coltura, utilizzando un volume equivalente di paraldeide ghiacciata all'8%.

I 10 minuti con una vegetazione dolce. Quindi aspirare il fissativo e lavare le cellule due volte con PBS per immunocolorare gli antigeni della superficie cellulare. Bloccare le cellule per almeno un'ora in 1% BSA in PBS, quindi etichettare le cellule con gli anticorpi primari e secondari pertinenti.

Ottimizza il guadagno del rivelatore, la potenza del laser e le impostazioni di esposizione pertinenti al microscopio e alla colorazione. Prima dell'imaging, le cellule acquisiscono le immagini delle cellule nel numero desiderato di canali di rilevamento e in più di sei diversi campi visivi. Per l'analisi, aprire i file immagine TIFF appropriati e trascinare le immagini l'una nell'altra per sovrapporre i canali corrispondenti appropriati.

Ogni canale apparirà come un livello separato nel pannello dei livelli. Successivamente, nella finestra di analisi, scegliere Seleziona punti dati, quindi Personalizza e seleziona le misurazioni desiderate. Per analizzare l'intensità della fluorescenza nucleare, aprire la finestra di dialogo dell'intervallo di colori e selezionare i colori campionati dal menu a discesa.

Quindi, tenendo premuto il tasto Maiusc, selezionare i toni specifici per i nuclei etichettati. Fare clic su Salva per memorizzare questa maschera di selezione della gamma di colori da utilizzare con altre immagini selezionate nella stessa sessione. Una volta selezionati i nuclei, scrivi clic e seleziona riempi.

Quindi scegli il nero dal menu a discesa e conferma che l'opacità è impostata su 100%Successivamente, fai clic su seleziona e inverti. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere di nuovo Riempi e scegliere un riempimento bianco dal menu a discesa. Eseguire un algoritmo spartiacque per separare eventuali nuclei parzialmente sovrapposti sullo strato nucleare ora binario.

Vai a selezionare quindi la gamma di colori, quindi le ombre per selezionare i singoli nuclei separati. Quindi trasferire la selezione sul livello contenente un'immagine in scala di grigi a 16 bit del marcatore desiderato e fare clic su registra misurazioni. Infine, esportare le misurazioni selezionate come file di testo nel software di analisi appropriato per l'ulteriore lavorazione dell'olio.

La colorazione con il rosso delle popolazioni cellulari purificate in combinazione con l'immunocolorazione per i marcatori di linea adipogenica e miogenica rivela che solo la frazione dei fibroblasti è in grado di una differenziazione epigenica con il massiccio accumulo di grasso da parte dei fibroblasti visibile ad occhio nudo e con un'ulteriore dimostrazione della loro completa trasformazione mediante la forte espressione di PPAR gamma nucleare da parte di queste cellule entro il giorno 15 di trattamento, queste cellule hanno rilasciato l'antigene del tessuto connettivo TE seven A rimanente sul loro substrato. Al contrario, le cellule miogeniche mantengono il loro fenotipo normale, compresa l'espressione della desmina e della catena pesante della miosina senza sovraregolazione dell'espressione nucleare di PPAR gamma. In questa figura, viene mostrato un esempio dell'analisi quantitativa di un campo di cellule miogeniche Desmond positive e il campo da cui sono stati ottenuti questi dati che illustrano la variazione dell'espressione miogenica nei singoli nuclei a questa specifica densità di semina e punto temporale.

In questo grafico, viene dimostrata l'utilità del metodo per confrontare direttamente i livelli dei fattori di trascrizione in diversi tipi di cellule a livello di cellula per cellula. Ad esempio, questi fibroblasti muscolari CD 56 negativi esprimono un alto livello del fattore di trascrizione adipogenico nucleare, PPAR gamma, mentre le cellule miogeniche CD56 positive assortite mantengono solo livelli molto bassi del fattore di trascrizione del recettore nucleare dopo l'esposizione al terreno che induce gli adipociti. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo della biologia muscolare di esplorare i meccanismi delle decisioni sul destino cellulare in campioni di muscolo umano sano o patologico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere in primo luogo, una buona comprensione di come ottenere alte rese di cellule derivate dal muscolo umano purificate e ben caratterizzate e, in secondo luogo, come eseguire un'analisi quantitativa oggettiva dei costituenti cellulari identificati mediante colorazione immunofluorescente.