Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare cellule muscolari purificate da biopsie muscolari di pazienti umani e immortalarle per studi a valle. Ciò si ottiene pesando, macinando e digerendo il tessuto raccolto per dissociare le cellule mononucleate. Come secondo passo, le cellule miogeniche vengono purificate da cellule non miogeniche dai fatti.

Successivamente, le cellule miogeniche vengono infettate sia con CDK four che con H turt per generare cellule immortalizzate. I risultati mostrano che le cellule muscolari viventi derivate da pazienti possono essere espanse per diversi passaggi e differenziate in base a saggi di fusione cellulare, alla presenza di miotubi contratti e all'espressione di marcatori miogenici. Le implicazioni di questa tecnica vanno oltre la diagnosi di malattia muscolare perché può potenzialmente fornire un numero illimitato di cellule miogeniche per lo screening di farmaci o altre applicazioni a valle in cui è richiesto un numero elevato di cellule.

Dimostrerò la procedura insieme a Jerome Robbin, un borsista post-dottorato del laboratorio del Dr. Woody Wright a Dallas. Inizia con la dissociazione della biopsia muscolare per purificare le cellule miogeniche. Innanzitutto, in una cappa di biosicurezza per coltura tissutale, registrare la massa della biopsia muscolare.

Successivamente, in un piatto di 10 centimetri, utilizzare bisturi sterili per tritare il fazzoletto in pezzi tritati finemente. Aggiungere alcune gocce di un X-H-B-S-S in modo che il tessuto non si secchi per grammo di tessuto. Aggiungere 3,5 millilitri di pasta a disco due e 3,5 millilitri di soluzioni di collagenasi D.

Quindi mescolare le cellule con una pipetta da 25 millilitri e trasferire la piastra in un'incubatrice ogni 15 minuti. Mescolare le cellule con una pipetta da cinque millilitri entro 90 minuti. Dovrebbe esserci una completa dissociazione tissutale.

Una volta dissociato il tessuto, aggiungere due volumi di terreno di coltura e filtrarlo attraverso un colino da 100 micron. Raccogliere il filtrato in una provetta da 50 millilitri. Pellettare le celle dal filtrato a 329 G per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi risospendere le cellule in HBSS con 0,5% BS, A e contarle. Regola il volume per ottenere 1 milione di cellule per 100 microlitri. Mettere da parte un'aliquota di 250.000 celle come controllo non colorato e mettere da parte due aliquote simili per i controlli a colorazione singola.

Questi sono tutti necessari per l'analisi del fax. Ora, colora le cellule con cinque microlitri di anticorpi anti CD 56 per milione di cellule e incuba tutti i campioni su ghiaccio per mezz'ora. Quindi, lavare rapidamente i campioni con 10 millilitri di HBSS.

Quindi pellettare le celle come prima, ma a quattro gradi Celsius dopo che le celle sono state pellettate, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un X-H-B-S-S a 5 milioni di celle per millilitro. Quindi aggiungere lo ioduro di propidio a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Ora purificare le cellule miogeniche CD56 positive dalle cellule non miogeniche utilizzando i fatti che seguono la piastra di purificazione.

Le cellule miogeniche a 50, 000 per pozzetto in piastre a sei pozzetti rivestite con coltura di gelatina allo 0,1%, le cellule fino a quando non sono attaccate, quindi le infettano con virus per la linea cellulare immortale. Nel protocollo del testo, c'è un'ulteriore revisione su come purificare e coltivare i fibroblasti dermici come descritto nel protocollo del testo. Preparare le cellule del tropico della fenice dopo aver incubato le cellule del tropico della fenice durante la notte con la miscela di plasmidi PolyJet.

Nutrire le cellule fresche, medie, composte da quattro parti di DME M1, parte di terreno, 1 99 e 10% siero di vitello. Preparare anche l'imballaggio inotropo. PA tre 17 celle in una piastra a sei pozzetti con circa 400.000 PA tre 17 celle per pozzetto.

12 ore dopo, raccogliere il virus contenente surnatante sulle cellule tropicali di Phoenix e farlo passare attraverso un filtro da 0,45 micron. Quindi utilizzare un millilitro di surnatante per infettare le tre cellule PA 17 e coltivarle durante la notte. Il giorno successivo, selezionare per una linea cellulare produttrice di virus dalle tre cellule PA 17 applicando antibiotici a 0,5 milligrammi per millilitro al terreno quando le cellule sono vicine alla cofluenza, raccogliere il surnatante dalle cellule tre volte a intervalli di 12 ore.

Filtra le collezioni dopo ogni raccolto. Il filtrato è il surnatante virale funzionante. Dividilo in un millilitro. Aliquote.

Mettere da parte alcune aliquote per un uso immediato. Le aliquote extra possono essere conservate a meno 80 gradi Celsius, ma perderanno il 50% di efficienza ad ogni ciclo di congelamento e scongelamento. Si noti che in tutto il processo l'apparecchiatura che ha toccato le particelle virali deve essere lavata con candeggina prima di essere gettata nel cestino dei rifiuti.

Per conservare in modo permanente la linea cellulare stabile che produce il virus PA 3 17, congelare le cellule nel siero al 10% di DMSO 90% e conservarle a meno 150 gradi Celsius in ogni pozzetto di cellule purificate via fax. In una piastra a sei pozzetti, aggiungere 400 microlitri di surnatante virale appena prodotto. Lasciare due pozzetti senza virus come controlli.

Incubare la piastra per una notte e il giorno successivo cambiare il terreno in ciascun pozzetto a 2,5 millilitri di terreno muscolare fresco. Assicurati di gettare i terreni e le pipette che contengono particelle virali nel contenitore della candeggina. Lasciare incubare le cellule nel terreno muscolare fresco per tre giorni.

Quindi selezionare le cellule per la resistenza agli antibiotici utilizzando 400 microgrammi di neomicina per millilitro per l'infezione da CDK quattro o 300 microgrammi di igromicina per millilitro per la telomerasi umana. Infezione da trascrittasi inversa per una settimana o due. Mantenere le cellule nelle condizioni selettive fino a quando le cellule e i pozzetti di controllo sono tutti morti.

Far passare sempre le cellule prima che diventino confluenti, anche durante la selezione quando raggiungono una fluenza di Co compreso tra il 60 e l'80%, utilizzare una soluzione di EDTA allo 0,05% di tripsina per raccogliere e far passare le cellule. Passare le cellule in piastre di 10 centimetri con mioblasto fresco, medio con antibiotici. Per prima cosa semina le cellule a una densità molto bassa, da tre a 500 per piatto da 10 centimetri.

Mantenere le cellule in questi piatti per circa due settimane fino a quando non si formano piccole colonie da 10 a 20 cellule quando le piccole colonie sono evidenti. Rimuovere la maggior parte del terreno lasciando solo una sottile pellicola di terreno per evitare che le cellule si secchino. Ora, immergi un lato di un anello di clonazione nel grasso per sottovuoto al silicone e l'anello sopra un clone desiderato.

Metti un anello diverso attorno a ogni clone desiderato in ogni anello. Aggiungere alcune gocce di soluzione di tripsina EDTA. Quando le cellule sono arrotondate, utilizzare un microscopio per aspirare con cura ogni sfera di cellule in un puntale per pipetta da 200 microlitri.

Trasferire le sfere di cella nei pozzetti della più piccola piastra multipozzetto disponibile. Quindi espandere ogni clone secondo necessità per evitare la cofluenza. Utilizzando il protocollo descritto, le cellule miogeniche sono state isolate insieme a fibroblasti, cellule adipogeniche e possibilmente cellule immunitarie, e quindi purificate dai fatti.

Le cellule sono state quindi immortalizzate come descritto utilizzando virus che esprimono la chinasi ciclina dipendente quattro, CDK quattro e la trascrittasi inversa della telomerasi umana h turt. Era fondamentale mantenere le piastre al di sotto della cofluenza ad ogni passaggio, in quanto potevano entrare nel programma di differenziazione e formare miotubi confrontando la formazione e la contrazione dei miotubi nelle cellule di controllo non immortalizzate e nelle cellule immortalizzate. Non sono state osservate differenze.

L'immortalità della linea cellulare è stata confermata misurando la lunghezza dei telomeri e l'attività dei telomeri. L'immortalità era evidente anche dalle curve di crescita cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come dissociare le cellule muscolari primarie dalla biopsia del paziente.

Immortalare il mioblasto primario e isolare e selezionare i cloni miogenici. Non dimenticare che lavorare con il virus richiede l'uso di una specifica coltura tissutale e di un sistema di ventilazione sicuro. Inoltre, tutto ciò che è coinvolto nella manipolazione del virus, come pipette, puntali, piatti, siringhe e filtri, deve essere sbiancato per evitare contaminazioni indesiderate.

Le particelle virali possono essere pericolose e per precauzione devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.