Name: Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Impara a isolare e immortalizzare cellule muscolari da biopsie di pazienti per modellare malattie muscolari. Questo protocollo fornisce linee cellulari illimitate per screening farmacologico e ricerca.

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Questa pubblicazione è finanziata attraverso Cure CMD, una sovvenzione dell'Association Contre Les Myopathies (AFM) (progetto 16297), e dal National Institutes of Health (numeri di sovvenzione K08 AR059750, L40 AR057721 e 2R01NS047727).

NOTA: I protocolli per la raccolta di tessuti umani devono essere esaminati e approvati dal comitato istituzionale IRB. Raccolta di scartati, tessuti umani de-identificato è stato approvato dal Children Hospital di Boston e Brigham and Women Hospital IRB Comitati. I metodi descritti di seguito sono stati applicati per l&#39;isolamento di cellule miogeniche da de-identificati, scartato il tessuto. I metodi descritti sono applicabili ai tessuti raccolti da materiale paziente acconsentito. Isolamento 1. Cella <ol><li> La dissociazione della biopsia muscolare e purificazione di cellule miogeniche <ol><li> Pre-pesare un tessuto piastra di coltura 10 centimetri in una cappa coltura tissutale biosicurezza, e poi ri-pesare il piatto contenente la biopsia muscolare per calcolare la quantità di tessuto da dissociato. </li><li> Utilizzando bisturi sterili, il tessuto muscolare tritare finemente e aggiungere qualche goccia di sterile 1x HBSS per evitare che il tessuto si secchi. </li><li> Aggiungere 3,5 ml ciascuno di dispase II e collagenasi D per grammo di tessuto muscolare per essere digerito. Pipettare il tessuto macinata e soluzione enzimatica attraverso una sterile 25 ml pipetta un paio di volte. Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C con 5% di CO 2 per 15 min e digerire il tessuto fino slurry passa facilmente se un sterile 5 ml pipetta. NOTA: tessuto dissociazione avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90 min. Si prega di fare riferimento alla sezione &quot;Risultati Rappresentante &#39;per ulteriori dettagli. </li><li> Aggiungere 2 volumi di mezzo di crescita sterili per tessuti dissociato, filtrare attraverso un filtro 100 micron cellule sopra a 50 ml tubolare e pellet coniche per 10 min a 329 g (circa 1.100 rpm), a temperatura ambiente. Si prega di fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione media. </li><li> Risospendere il pellet in 1 volume di mezzo di crescita sterili ed aggiungere 7 volumi soluzione di lisi dei globuli rossi. Filtrare la soluzione attraverso un colino cella 40 micron, quindi pellet tlui cellule per 10 min a 329 xg, temperatura ambiente. </li><li> Contare le cellule in un emocitometro e risospendere le cellule in 1x HBSS 0,5% BSA ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / 100 microlitri. Mettere da parte ~ 250.000 cellule in un unico tubo che verranno utilizzati come controllo negativo (senza macchia). Impostare tubi da parte ulteriori monocolore macchiati di controllo per ioduro di propidio e per CD56, che sono necessari per il corretto gating di cellule positive CD56 da FACS ordinamento. Fare riferimento alla cella manuali smistamento o consultare FACS ordinamento esperti core facility per garantire controlli adeguati sono inclusi. </li><li> Macchiare le cellule da ordinare con 5μl / 10 6 cellule di anticorpo anti CD56. Incubare tutti i campioni (compresi i controlli) su ghiaccio per 30 min. </li><li> Lavare i campioni a 10 ml 1x HBSS e cellule pellet per 10 min a 329 g (circa 1.100 rpm) in una centrifuga refrigerata a 4 ° C di temperatura. </li><li> Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 1 ug / ml per il campione ad essere sorted per l&#39;esclusione di cellule morte. Purificare miogenici CD56 cellule positive dalle cellule non-miogeniche utilizzando la fluorescenza attivato cell sorter. </li></ol></li><li> La dissociazione della biopsia cutanea NOTA: Dermal fibroblasti possono essere isolati da un pugno di pelle da pazienti quando biopsie muscolari non sono disponibili. Fibroblasti dermici possono essere utilizzati come biomateriale per vari studi, tra trasduzione con MyoD per generare cellule miogeniche. Inoltre, fibroblasti dermici possono essere utilizzati per generare cellule iPS, che possono essere differenziati in vari tipi di cellule per ulteriori studi. <ol><li> Trasportare la biopsia cutanea al laboratorio di mezzo di trasporto. Una volta ricevuto il campione, effettuare la coltura primaria appena possibile. Se la cultura primaria non è possibile stabilire il giorno stesso, conservare il campione a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Trasferire la biopsia cutanea di una piastra da 35 mm di Petri sterile nella cappa a flusso laminare. </li><li> Sciacquare la biopsia cutanea in una capsula di Petri con sterili 1x PBS per rimuovere il sangue e detriti. Rimuovere il tessuto adiposo con un bisturi sterile. </li><li> Aggiungere la soluzione di collagenasi 2 ml e tritare il tessuto con un bisturi, incubare a 37 ° C per 45 minuti a 1 ora, a seconda delle dimensioni del tessuto. </li><li> Trasferire il tessuto digerito in una provetta conica da 15 ml, lavare la capsula di Petri con 2 ml di mezzo di coltura di fibroblasti due volte, e raccogliere il fluido nel tubo stesso. </li><li> Agglomerare cellule a 200 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 3 ml di terreno di fibroblasti per rimuovere la collagenasi, poi di nuovo cellule pellet. Si prega di fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione media. </li><li> Ripetere il passaggio 1.2.7 ancora una volta. </li><li> Risospendere il pellet in cellule medie fibroblasti e la piastra 5 ml su un pallone di coltura di tessuto T25 sterile. Incubare la beuta a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Valutare la cultura per il fissaggio dei fibroblasti e la crescita nei prossimi 1-3 giorni. &lt;br /&gt; Nota: alcuni piccoli pezzi di tessuto può anche allegare al piatto e fibroblasti migrare di questi pezzi di tessuto. </li><li> Mantenere la cultura nelle stesse condizioni fino fibroblasti sono coltivate a circa l&#39;80% di confluenza. </li><li> Raccogliere fibroblasti da tripsinizzazione e trasferire su palloni di coltura fresco per l&#39;espansione ulteriore. Eseguire tripsinizzazione lavando culture 3 volte in 1x PBS libera di Ca ++ e Mg ++. Aggiungere tripsina-EDTA (vedi Materiali Table) alle cellule (2 ml / pallone T25) per 2 minuti a 37 ° C. </li><li> Split cellule staccate in fiaschi supplementari. Se alcuni pezzi di tessuto rimangono attaccati ai fiaschi T25 originali, aggiungere 5 ml di terreno di coltura fresco per questo pallone e più fibroblasti migreranno fuori continuamente. NOTA: La cultura fibroblasti espansa può essere congelato giù come P1 e conservato in azoto liquido per esperimenti futuri. </li></ol></li></ol> 2. Immortalizzazione di cellule miogeniche <ol><li&gt; cellule Tavola 5 milioni Phoenix Ecotropic Confezioni (PE) durante la notte in una piastra di coltura tissutale sterili 10 centimetri in DMEM e Medium 199 in un rapporto di 4: 1, integrato con siero di vitello al 10%. </li><li> Cellule di alimentazione 30 min prima di trasfezione con 5 ml di mezzi freschi integrato con 10 mM di caffeina. </li><li> Omogeneizzare una miscela di 2 mg di DNA plasmidico da una preparazione midi (CDK4 o hTERT plasmide) e Polyjet ed incubare a temperatura ambiente per 15 min, come raccomandato dal produttore. </li><li> Aggiungere il composto plasmide / Polyjet alle cellule PE durante la notte. </li><li> Cellule feed con mezzo fresco (DMEM e Medium 199 in un rapporto di 4: 1, supplementato con siero di vitello al 10%). Dodici ore dopo, raccogliere il surnatante contenente il virus e filtrare attraverso un filtro a 0,45 micron dimensione dei pori. </li><li> Usare 1 ml di surnatante raccolto di infettare tutta la notte la linea di cellule PA317 confezionamento amphotropic 5 e ottenere una linea di virus producono stabile cella dopo la selezione o con 0,5 mg / ml neomicina (G418) per CDK4 o 0,5 mg / ml igromicina per hTERT. </li><li> Preparare lavoro surnatanti virali coltivando le cellule di packaging stabili nei pressi di confluenza, poi raccogliendo il surnatante ogni mattina, sera e la mattina, per tre raccolti. </li><li> Filtrare il surnatante virale e utilizzare direttamente o dividerli in aliquote di 1 ml e conservare a -80 ° C per un uso successivo. Si noti che il surnatante virale perde il 50% di efficienza infezione tra gelo e disgelo. Ricordarsi di candeggina-wash, prima di eliminare tutto ciò che ha toccato le particelle virali. NOTA: La linea cellulare PA317 virus-produzione stabile può essere congelato e mantenuta a -150 ° C per la memorizzazione permanente (congelamento medio è del 10% DMSO; 90% siero). </li><li> Cellule miogeniche Piastra FACS-purificato (descritto nei passaggi 1,1-1,9) ad una densità di 5 x 10 4 cellule / pozzetto in piastre da 6 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina. Assicurarsi che le cellule sono attaccati alla piastra prima di procedere con l&#39;infezione virale. </li><li> Aggiungere 400 microlitri filtrato, freshly prodotto surnatante virale o aliquote congelate di ogni piatto sei bene durante la notte (mantenere 2 pozzi come controlli). </li><li> Cambiare medio alimentando cellule con 2,5 ml / pozzetto di mezzi freschi muscolare (4: 1 di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) e Medium 199 supplementato con siero fetale bovino 15%; 0,02 M tampone HEPES, 1,4 mg / L di vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L desametasone, 2.5 mg / l il fattore di crescita degli epatociti e / L fibroblasti fattore di crescita di base 10 mg). Eliminare i media e pipette contenenti le particelle virali in un contenitore di candeggina. Lasciare cellule nello stesso mezzo per 3 giorni per recuperare da infezione, poi trattare per la selezione utilizzando 400 mg / ml di neomicina (infezione CDK4) o 300 mg / ml igromicina (infezione hTERT). </li><li> Mantenere le cellule sotto selezione di droga fino a quando le cellule della matrice piatto di controllo (1-2 settimane). </li><li> Passaggio cellule prima che diventino confluenti (60-80% di confluenza, utilizzando 0,05% tripsina EDTA), anche durante la selectisul periodo. Cellule replate 10 centimetri in più piatti con media mioblasti fresca (come descritto in 2.11) integrati con il farmaco di selezione. Mantenere celle selezionate immortalizzate come popolazione eterogenea clonare o per ottenere un background genetico completamente omogenea (stessa inserimento del transgene in ogni cellula). </li><li> Eseguire la selezione clonale utilizzando le seguenti operazioni: <ol><li> Seme le cellule a bassa densità (ad esempio da 300 a 500 cellule in 10 piatti cm) e mantenere per circa due settimane, fino a quando si formano piccole colonie (10-20 cellule). </li><li> Rimuovere la maggior parte del mezzo, a questo punto, lasciando solo una sottile pellicola per impedire le cellule si secchi. </li><li> Posizionare un anello di clonazione (con una estremità immersa in grasso per vuoto silicone) su ogni clone desiderato e aggiungere qualche goccia di tripsina / EDTA. </li><li> Celle di raccolta una volta che diventano arrotondati aspirando attentamente le cellule con una punta 1 ml o una pipetta Pasteur e trasferirli al più piccolo disponibile pla pozzettite (96 o 48, 24 o 12 pozzetti). </li><li> Espandere cloni come necessario per evitare confluenza locale. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le cellule come una risorsa utile L&#39;isolamento e la cultura delle popolazioni di cellule miogeniche è estremamente utile quando si stabilisce fenotipi di malattia o in modelli in vitro di malattia. La procedura di isolamento delle cellule miogeniche qui descritto consente l&#39;isolamento di mioblasti e fibroblasti da campioni del muscolo scheletrico, che possono poi essere propagate, differenziati, o immediatamente analizzati. La struttura e la funzione dei mioblasti p...

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Stacy C. Cossette
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Stacy A. Cossette

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Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

La diagnostica molecolare si è evoluta notevolmente negli ultimi 20 anni. Il DNA genomico viene ora isolato di routine dall'espettorato o dal tampone della guancia, mentre in passato richiedeva un prelievo di sangue. Con gli attuali tempi di consegna rapidi e la facilità di sequenziamento genico, molte mutazioni della malattia vengono identificate di routine senza bisogno di ulteriori test. Nel caso della diagnostica delle malattie muscolari, l'identificazione di dozzine di nuovi geni nell'ultimo decennio responsabili della distrofia muscolare o della miopatia ha cambiato radicalmente il modo in cui queste malattie vengono diagnosticate 1,2. Attualmente, ci sono dozzine di geni che sono stati identificati come cause della distrofia muscolare e della miopatia congenita, anche se i meccanismi con cui molti di questi geni producono la malattia rimangono poco chiari. In particolare, le malattie rare costituiscono una sfida a causa delle piccole dimensioni della popolazione di pazienti. Per questi casi, così come per le malattie più comuni, è altamente auspicabile la generazione di strumenti stabili che facilitino gli studi sul meccanismo di patogenesi e lo screening dei farmaci terapeutici. 
Nonostante i notevoli progressi nella diagnostica del DNA, le biopsie muscolari vengono ancora eseguite per stabilire la diagnosi primaria in molti pazienti in cui si sospetta una malattia metabolica primaria o muscolare. Quando è necessaria una biopsia muscolare, offre l'opportunità di un'ulteriore raccolta di tessuti diagnostici e di ricerca con un rischio aggiuntivo minimo di morbilità per il paziente. Poiché ci sono una serie di usi per ogni campione di tessuto, è altamente auspicabile stabilire tecniche per la coltura cellulare primaria utilizzando tessuti chirurgici che siano semplici, efficienti e richiedano quantità minime di tessuto. È necessario un adeguato triage delle biopsie muscolari o cutanee per massimizzare l'isolamento delle cellule primarie dai tessuti e la conservazione a lungo termine del materiale vivo. Inoltre, la ricerca sulle cellule staminali e lo screening dei farmaci sono molto promettenti per lo sviluppo di terapie per molte malattie utilizzando saggi basati su cellule 3,4.
Descriviamo qui i metodi per l'isolamento delle cellule primarie da biopsie muscolari o cutanee umane. Inoltre, includiamo un protocollo per l'immortalizzazione delle cellule miogeniche, utile per generare un gran numero di cellule da un individuo. Queste cellule possono essere utilizzate per applicazioni a valle, come gli screening farmacologici personalizzati, che altrimenti sarebbero irrealizzabili con il numero complessivo basso di cellule ottenute dal tessuto primario.

<table><tbody><tr><td>Attrezzature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue&nbsp; cappa di biosicurezza per coltura</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>Modello SterilGuard Hood</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco, come il modello Beckman&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modello Allegra 6R</td><td>Se viene eseguita la selezione cellulare, è preferibile una centrifuga con refrigerazione</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Modello Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture tissutali, collegato a una fonte CO2 Forma</td><td>Scientific&nbsp;</td><td>Serie II</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare attivato da fluorescenza (FACS)</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model Aria</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per l'isolamento di mioblasti primari dal tessuto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Science</td><td>#04942078001</td><td>Preparare una soluzione di calza di 2,4U/ml in DMEM</td></tr><tr><td>Collagenasi D&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>#088882001</td><td>Preparare una soluzione madre da 10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x Hank' sterile s Soluzione salina bilanciata (HBSS), priva di calcio e magnesio</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina, frazione V</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>Preparare una soluzione sterile di 1X HBSS 0,5% BSA per la selezione FACS</td></tr><tr><td>Terreno di crescita sterile per mioblasti: Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio (4,5 g) integrato con il 30% di siero fetale bovino</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Contiene L-glutammina</td></tr><tr><td>Soluzione di lisi RBC</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio 10mg/ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Preparare la soluzione madre diluendo la polvere in acqua distillata sterile</td></tr><tr><td>Anticorpo CD56 umano per citometria a flusso</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td>Anticorpo coniugato APC, sono disponibili altre etichette</td></tr><tr><td>Reagenti per l'immortalizzazione dei mioblasti</td><td></td><td></td><td></td>primari</tr><tr><td>Linea cellulare di imballaggio ecotropico PE</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare di confezionamento anfotropico PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina di pelle di maiale</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>Preparare una soluzione madre di gelatina allo 0,1% in acqua. Rivestire il piatto con la soluzione a 37 gradi C per un'ora. Rimuovere la soluzione e aggiungere il terreno.</td></tr><tr><td>PolyJet&nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>plasmidi pBabe contenenti mCDK4 e hTERT</td><td>non disponibili</td><td></td> in commercio <td>Stadler et al, 2013</td></tr><tr><td>Kit midiprep del plasmide Qiagen</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Medio 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle medium modificato (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td><td>Mix 4:1 DMEM:199</td></tr><tr><td>Terreno di crescita mioblasto: 4:1 Dulbecco' s modificato Eagle medium (DMEM) e Medium 199 integrato con il 15% di siero fetale bovino; tampone HEPES da 0,02 M; 1,4 mg/L di vitamina B12; 0,03 mg/L di ZnSO4, 0,055 mg/L di desametasone, 2,5 &mu; g/L fattore di crescita degli epatociti e 10 &mu; g/L di fattore di crescita dei fibroblasti beta.</td><td>Tecnologie per la vita (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (solfato di zinco); Sigma (Vit.B12, Desametasone); Chemicon internazionale (HGF); Biopioniere (betaFGF)&nbsp;</td><td>#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&nbsp;</td><td>Preparare il terreno e la soluzione madre Vit. B12 (20mg/ml); Solfato di zinco (60&micro; g/ml); Dex (55&micro; g/&micro; l) separatamente per un uso più semplice. Soluzione madre di HGF (5&micro; g/ml) e FGF (20&micro; g/ml) deve essere aggiunto fresco ogni settimana alla concentrazione di lavoro finale.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo a catena pesante della miosina per l'immunocolorazione</td><td>Banca degli ibridomi dello sviluppo</td><td>MF20</td><td>Clone MF20</td></tr><tr><td>Desmin Anticorpo per l'immunocolorazione</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Clone D33</td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per l'isolamento dei fibroblasti cutanei primari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno di trasporto: RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e lo 0,2% di penicillina/streptomicina</td><td>Terreno RPMI 1640: GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura di fibroblasti primari umani: RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina</td><td>Siero fetale bovino: Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di collagenasi: Collagenasi di tipo 2 (100 mg) risospesa in 12,5 ml di terreno di coltura per fibroblasti e sterilizzata con filtro</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) senza calcio e magnesio</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Materiali per l'isolamento dei mioblasti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>primari Provette coniche sterili da 50 ml e 15 ml</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi sterili</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sterili da 5, 10 e 25 ml Vetro</td><td>Bellco</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)</td><td>Le pipette riutilizzabili vengono lavate, tappate con cotone e sterilizzate in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Piastre in plastica sterili trattate con coltura tissutale (10 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari sterili in nylon (100 &; micro; m e 40 &micro; taglia m)</td><td>BD Falcon</td><td>352340 (40&micro; m); 352360 (100&micro; m)</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Materiali per l'immortalizzazione dei mioblasti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 0,45 & micro; m filtri</td><td>Millipore</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Anelli di clonazione</td><td>Corning</td><td>#3166-8</td><td>Da pulire e sterilizzare in autoclave prima e dopo l'uso</td></tr><tr><td>Materiali per linee cellulari di fibroblasti&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre sterili in plastica trattate per colture tissutali da 35 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi sterili</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi sterili per colture tissutali T25</td><td>Techno Plastic Product, TPP</td><td>90026</td><td>venduti negli Stati Uniti da MIDSCI</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da muscle biopsia per la malattia modeling

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

La generazione di linee cellulari specifiche per il paziente rappresenta uno strumento inestimabile per la ricerca diagnostica o traslazionale, e queste cellule possono essere raccolte dal tessuto bioptico cutaneo o muscolare disponibile durante l'iter diagnostico del paziente. In questo protocollo, descriviamo una tecnica per l'isolamento di cellule vive da piccole quantità di tessuto muscolare o cutaneo per la coltura cellulare primaria. Inoltre, forniamo una tecnica per l'immortalizzazione di linee cellulari miogeniche e linee cellulari di fibroblasti da cellule primarie. Una volta immortalizzate le linee cellulari, è possibile ottenere una sostanziale espansione delle cellule derivate dai pazienti. Le cellule immortalizzate sono suscettibili di molte applicazioni a valle, tra cui lo screening farmacologico e la correzione in vitro della mutazione genetica. Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.

Figura 1 illustra alcuni dei passaggi chiave coinvolti nella dissociazione tessuti primaria: l&#39;esatta quantità di tessuto è pesato in un piatto di coltura di tessuti petri sterile (Figura 1A, B). Il tessuto viene quindi macinato finemente usando bisturi sterile, fino ad ottenere uno slurry di tessuto (Figura 1C, D). Dopo l&#39;aggiunta di enzimi digestivi, il muscolo principale dissociazione del tessuto avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90 m...

Questo protocollo descrive le tecniche per l'isolamento di cellule vive e la coltura primaria di linee cellulari miogeniche e fibroblastiche da tessuto muscolare o cutaneo. Viene anche descritta una tecnica per l'immortalizzazione di queste linee cellulari. Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare cellule muscolari purificate da biopsie muscolari di pazienti umani e renderle immortali per studi successivi. Questo viene ottenuto innanzitutto pesando, tritando e digerendo il tessuto raccolto per dissociare le cellule mononucleate. Come secondo passaggio, le cellule miogeniche vengono purificate dalle cellule non miogeniche mediante facts.In seguito, le cellule miogeniche vengono infettate con CDK4 e H turt per generare cellule immortalizzate. I risultati mostrano che le cellule muscolari vitali derivate dai pazienti possono essere espanse per diverse passaggi e differenziate in base a saggi di fusione cellulare, alla presenza di miotubi contrattili e all'espressione di marcatori miogenici. Le implicazioni di questa tecnica vanno oltre la diagnosi delle malattie muscolari, poiché potrebbero fornire un numero illimitato di cellule miogeniche per lo screening di farmaci o altre applicazioni successive in cui è richiesto un elevato numero di cellule.Illustrerò la procedura insieme a Jerome Robbin, un ricercatore post-dottorato del laboratorio del dott. Woody Wright a Dallas. Iniziare dissociando il campione di biopsia muscolare per purificare le cellule miogeniche. Prima di tutto, all'interno di una cappa biologica per colture cellulari, registrare la massa del campione di biopsia muscolare.Successivamente, in una piastra da 10 centimetri, utilizzare bisturi sterili per tritare finemente il tessuto in pezzi molto piccoli. Aggiungere alcune gocce di una soluzione X-H-B-S-S per evitare che il tessuto si secchi, per ogni grammo di tessuto. Aggiungere 3,5 millilitri di disc paste due e 3,5 millilitri di soluzione di collagenasi D.Quindi mescolare le cellule con una pipetta da 25 millilitri e trasferire la piastra in un incubatore ogni 15 minuti. Mescolare le cellule con una pipetta da cinque millilitri entro 90 minuti. Si dovrebbe ottenere una completa dissociazione del tessuto.Dopo la dissociazione del tessuto, aggiungere due volumi di mezzo di crescita e filtrare attraverso un setaccio da 100 micron. Raccogliere il filtrato in un tubo da 50 millilitri. Pellettare le cellule dal filtrato a 329 G per 10 minuti a temperatura ambiente.Quindi risospendere le cellule in HBSS con 0,5% di BS, A, e contarle. Regolare il volume per ottenere 1 milione di cellule per 100 microlitri. Mettere da parte un'aliquote di 250.000 cellule come controllo non colorato e mettere da parte due aliquote simili per i controlli con colorazione singola.Tutti questi sono necessari per l'analisi tramite fax. Ora, colorare le cellule con cinque microlitri di anticorpo anti-CD56 per ogni milione di cellule e incubare tutti i campioni sul ghiaccio per mezz'ora. Successivamente, lavare rapidamente i campioni con 10 millilitri di HBSS.Quindi centrifugare le cellule come in precedenza, ma a quattro gradi Celsius; dopo che le cellule sono state pellettizzate, eliminare il sopranatante e risospendere il pellet cellulare in un X-H-B-S-S a 5 milioni di cellule per millilitro. Aggiungere quindi ioduro di propidio fino a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Ora purificare le cellule miogeniche positive per CD 56 dalle cellule non miogeniche utilizzando facts seguendo la piastra di purificazione.Le cellule miogeniche a 50.000 per pozzetto in piastre a sei pozzetti rivestite con gelatina 0,1%, coltivare le cellule fino a quando non si sono attaccate, quindi infettarle con il virus per l'immortalizzazione della linea cellulare. Nel protocollo descritto nel testo, è presente una revisione aggiuntiva su come purificare e coltivare i fibroblasti dermici come descritto nel protocollo testuale. Preparare le cellule phoenix tropic dopo averle incubate durante la notte con la miscela plasmidica PolyJet.Alimentare le cellule con mezzo fresco, composto da quattro parti di DME M1, una parte di mezzo 199 e 10% di siero di vitello. Preparare anche l'imballaggio inotropico. Piastrare 400.000 PA three 17 per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.12 ore dopo, raccogliere il surnatante contenente il virus dalle cellule Phoenix tropiche e filtrarlo attraverso un filtro da 0,45 micron. Quindi utilizzare un millilitro del surnatante per infettare le cellule PA three 17 e coltivarle per tutta la notte. Il giorno successivo, selezionare una linea cellulare produttrice di virus a partire dalle cellule PA three 17 aggiungendo antibiotici al mezzo alla concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro quando le cellule sono quasi confluenti, raccogliendo il surnatante dalle cellule per tre volte a intervalli di 12 ore.Filtrare i campioni dopo ogni raccolta. Il filtrato costituisce il surnatante virale di lavoro. Dividerlo in aliquote da un millilitro.Mettere da parte alcune aliquote per un uso immediato. Le aliquote aggiuntive possono essere conservate a meno 80 gradi Celsius, ma perderanno il 50% dell'efficienza ad ogni ciclo di congelamento e scongelamento. Si noti che durante il processo tutte le attrezzature che sono venute a contatto con le particelle virali devono essere lavate con candeggina prima di essere gettate nel cestino dei rifiuti.Per conservare stabilmente la linea cellulare produttrice del virus PA tre 17, congelare le cellule in DMSO al 10% e siero al 90% e conservarle a meno 150 gradi Celsius in ciascun pozzetto di cellule purificate. In una piastra a sei pozzetti, aggiungere 400 microlitri di surnatante virale appena prodotto. Lasciare due pozzetti senza virus come controlli.Incubare la piastra durante la notte e il giorno successivo sostituire il mezzo in ogni pozzetto con 2,5 millilitri di mezzo muscolare fresco. Assicurarsi di smaltire i mezzi e le pipette contenenti particelle virali nel contenitore con candeggina. Lasciare incubare le cellule nel mezzo muscolare fresco per tre giorni.Quindi selezionare le cellule per la resistenza all'antibiotico utilizzando 400 microgrammi di neomicina per millilitro per l'infezione da CDK4, oppure 300 microgrammi di igromicina per millilitro per la telomerasi umana. Eseguire l'infezione con la trascrittasi inversa per una o due settimane. Mantenere le cellule in condizioni selettive fino a quando le cellule e i pozzetti di controllo non siano tutti morti.Passare sempre le cellule prima che diventino confluenti, anche durante la selezione, quando raggiungono una confluenza del 60-80%. Utilizzare una soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per raccogliere e passare le cellule. Passare le cellule in piatti da 10 centimetri con mezzo per mioblasti fresco contenente antibiotici. Seminare inizialmente le cellule a una densità molto bassa, da tre a 500 cellule per piatto da 10 centimetri.Mantenere le cellule in queste piastre per circa due settimane, fino a quando si formano piccole colonie di 10-20 cellule, visibili chiaramente. Rimuovere la maggior parte del mezzo, lasciando solo un sottile strato di mezzo per evitare che le cellule si secchino. A questo punto, immergere un lato di un anello di clonaggio in grasso per pompa da vuoto al silicone e posizionare l'anello sopra una colonia desiderata.Mettere un anello diverso attorno a ciascuna colonia desiderata in ogni piatto. Aggiungere alcune gocce di soluzione di tripsina EDTA. Quando le cellule assumono una forma arrotondata, utilizzare un microscopio per aspirare con attenzione ogni ammasso di cellule in una punta pipetta da 200 microlitri.Trasferire le sferette cellulari nelle pozzette della piastra multi-pozzo disponibile più piccola. Successivamente, espandere ogni clone secondo necessità per evitare la confluenza. Utilizzando il protocollo descritto, le cellule miogeniche sono state isolate insieme a fibroblasti, cellule adipogeniche e possibilmente cellule immunitarie, quindi purificate mediante FACS.Le cellule sono state quindi immortalizzate come descritto, utilizzando virus che esprimono la chinasi dipendente dal ciclina quattro, CDK4, e la telomerasi trascrittasi inversa umana hTERT. È stato fondamentale mantenere le piastre al di sotto della confluenza a ogni passaggio, poiché le cellule avrebbero potuto entrare nel programma di differenziamento e formare tubuli miotubulari. Confrontando la formazione e la contrazione dei miotubi nelle cellule di controllo non immortalizzate e in quelle immortalizzate, non è stata osservata alcuna differenza.L'immortalità della linea cellulare è stata confermata misurando la lunghezza dei telomeri e l'attività telomerica. L'immortalità è risultata evidente anche dalle curve di crescita cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissociare cellule muscolari primarie da un'analisi bioptica del paziente.Immortalizzare i mioblasti primari e isolare e selezionare cloni miogenici immortalizzati. Non dimenticare che lavorare con virus richiede l'uso di un'apposita cappa per colture cellulari e un sistema di ventilazione sicuro. Inoltre, tutto ciò che entra in contatto con il virus, come pipette, punte, piastre, siringhe e filtri, deve essere trattato con candeggina per evitare contaminazioni indesiderate.Le particelle virali possono essere pericolose e si devono sempre adottare precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.

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Il micro-dissezionato tecnica espianti è un metodo robusto e affidabile per isolare proliferativa delle cellule del muscolo scheletrico da giovani, adulte o embrionali muscoli come fonte di cellule staminali del muscolo scheletrico. Unicamente, queste cellule sono state derivate clonazione per la produzione di muscolo scheletrico linee di cellule staminali utilizzate per trapianto in vivo.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

L'isolamento e la cultura della miofibre è il gold...

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

I principali tipi di cellule aderenti derivati dal muscolo umano sono le cellule miogeniche e i fibroblasti. Qui, le popolazioni cellulari vengono arricchite utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente basato sull'antigene CD56. La successiva immunomarcatura con anticorpi specifici e l'uso di tecniche di analisi delle immagini consentono la quantificazione delle caratteristiche citoplasmatiche e nucleari nelle singole cellule.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Questo protocollo utilizza l'elettroporazione per introdurre ed esprimere proteine marcate in fluorescenza nelle fibre muscolari del topo. Dopo il recupero dopo l'elettroporazione, le fibre vengono isolate. Le singole fibre vengono quindi visualizzate utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione per visualizzare la struttura muscolare.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Qui descriviamo una metodologia per ottenere una popolazione pura di mioblasti umani dal tessuto muscolare adulto. Queste cellule sono utilizzate per studiare la differenziazione muscolare scheletrica in vitro e, in particolare, per studiare le proteine ​​coinvolte nella segnalazione Ca 2+ .

Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell&#39;entrata del calcio a livello di deposito

Presentiamo tecniche per isolare, coltivare, caratterizzare e differenziare le cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMMP) ottenute dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica.  Gli hMPC ottenuti e caratterizzati attraverso questi metodi possono essere utilizzati per affrontare successivamente le domande di ricerca relative alla miogenesi umana e alla rigenerazione muscolare scheletrica.

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

I mioblasti stanno proliferando cellule precursori che si differenziano per formare miotubi polinucleati e infine mitole muscolari scheletriche. Qui, presentiamo un protocollo per un isolamento efficiente e la cultura dei mioblasti primari dai muscoli scheletrici dei topi giovani adulti. Il metodo consente studi molecolari, genetici e metabolici delle cellule muscolari in coltura.

Isolamento e differenziazione dei mioblasti primari dagli esopanti muscolari scheletrici del topo

Qui, proponiamo un metodo per ottenere in modo efficiente le singole fibre muscolari nelle prime fasi dello sviluppo post-natale dal mutante omozygoso lamin modello murino 8, un modello molto severo per la distrofia muscolare Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal

Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule staminali muscolari e dei progenitori fibro-adipogeni dai singoli muscoli scheletrici nei topi. Il protocollo prevede la dissezione di un singolo muscolo, l'isolamento delle cellule staminali mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza, la valutazione della purezza mediante colorazione con immunofluorescenza e la misurazione quantitativa dell'ingresso in fase S mediante saggio di incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina.

Isolamento di popolazioni di cellule staminali quiescenti da singoli muscoli scheletrici

Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per isolare e arricchire mioblasti primari da muscoli scheletrici di topo adulti e neonati attraverso dissociazione tissutale, filtrazione sequenziale, preplaccatura e condizioni di coltura definite, consentendo l'istituzione e il mantenimento di colture mioblastiche derivate da cellule satellitari per applicazioni sperimentali a valle.

Isolamento delle cellule satelliti muscolari scheletrici per studi in vitro sulla miogenesi

Impara a isolare e immortalizzare cellule muscolari da biopsie di pazienti per modellare malattie muscolari. Questo protocollo fornisce linee cellulari illimitate per screening farmacologico e ricerca.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

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