Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e coltivare singole fibre vive e le loro cellule staminali associate dal muscolo EDL di topi adulti. Ciò si ottiene sezionando prima l'EDL utilizzando una procedura di dissezione da tendine a tendine che non danneggia le fibre. Successivamente, viene eseguita una digestione muscolare per disaggregare le fibre preservando l'associazione delle cellule staminali della miofibra, che è un passaggio unico di questo protocollo.

Nella fase finale, le singole fibre myo vengono delicatamente separate l'una dall'altra, mentre i detriti o le fibre ipercontratte vengono rimossi mediante lavaggi sequenziali. In definitiva, le miofibre isolate con questa tecnica possono essere mantenute in uno stato semi-quiescente con stimoli di attivazione minimi o essere coltivate in un alto livello di siero per lo studio dell'attivazione e della differenziazione delle cellule satelliti. Negli ultimi anni, l'uso di fibre di fango coltivate è stato un approccio molto potente per studiare l'attivazione, la proliferazione e il differenziamento di cellule satelliti in una nicchia fisiologica rilevante.

Questo approccio ci ha davvero permesso di fare grandi progressi nella comprensione di una funzione di queste cellule a livello molecolare e cellulare. Per ogni topo da cui vengono isolati gli EDL, preparare cinque piastre di Petri di plastica da 60 millimetri con una pipetta di siero di cavallo, quattro millimetri di siero di cavallo su una piastra e agitarle per un rivestimento uniforme. Quindi rimuovere il siero di cavallo aspirando il siero avanzato e lasciare asciugare il piatto per almeno 30 minuti.

Dopo mezz'ora, aggiungere quattro millilitri di materiale di lavaggio a quattro piatti. Etichettare i piatti come segue, muscolo dopo digerire, lavare uno, lavare due e lavare tre. Aggiungere quattro millilitri di terreno di coltura in fibra al piatto di coltura in fibra rimanente.

Conservare le stoviglie a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica prima dell'uso. Successivamente, per l'isolamento di una fibra, preparare due pipette sterili al microscopio. Realizzare una pipetta di grande diametro tagliando una pipetta di piccolo diametro con una penna diamantata in modo che l'apertura sia abbastanza grande da consentire l'espulsione dell'intero muscolo.

La seconda pipetta è una pipetta di piccolo diametro per la manipolazione di MyFi. Ora fiammare le pipette per levigare i bordi e per la sterilizzazione utilizzando la curva di fiamma, la punta della pipetta di piccolo diametro. Ciò aiuterà a gestire le singole fibre durante l'isolamento.

Quindi rivestire entrambe le pipette con siero di cavallo. Infine, assicurati di pulire la stazione del microscopio e gli strumenti di dissezione con etanolo al 70%. Per questa dimostrazione, topi transgenici SV 1 29 di otto settimane.

Sono stati soppressi. Spruzzare gli arti posteriori con etanolo al 70%. Quindi fissa l'animale a una tavola di supporto a faccia in su.

Questo è necessario per fornire una migliore presa degli arti posteriori. Quindi, taglia l'intera lunghezza dell'arto ed esponi il muscolo sottostante. Rimuovere la pelle, i peli o il pelo.

Usando una forbice sottile, taglia la sottile fascia che circonda il muscolo senza danneggiare il tessuto sottostante. Esporre i tendini distali TA ed EDL utilizzando il cohan Vana affilato. Forbici a molla.

Tagliare i tendini distali EDL e TA. Successivamente, con l'aiuto di una pinza, tieni entrambi i muscoli TA ed EDL per i tendini e tira delicatamente i muscoli verso l'estremità prossimale. A questo punto, dovresti essere in grado di vedere chiaramente il muscolo EDL appena sotto il muscolo TA.

Ora separa l'EDL dal muscolo TA tirando i due tendini in direzioni opposte. Evitare di allungare il muscolo EDL durante l'esecuzione di questa operazione. Poiché ciò danneggerà le fibre miometriche.

Esporre il tendine EDL. A questo punto, può essere utile rimuovere il muscolo TA per visualizzare meglio il tendine prossimale. Può anche essere utile tagliare parte del tessuto connettivo intorno al ginocchio.

Una volta che il tendine è chiaramente visibile, usa le forbici affilate cohan Venus Spring per liberare il muscolo EDL. Se la procedura è stata eseguita correttamente, se l'EDL deve essere in grado di mantenere la sua forma allungata, una volta rimosso dall'arto, tenendo il muscolo EDL attraverso i suoi tendini, trasferirlo in una soluzione di collagenasi preriscaldata da due millilitri e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Ripetere il processo per isolare il secondo EDL e trasferirlo nella stessa provetta di collagenasi per una digestione irregolare.

L'isolamento della seconda EDL deve essere completato entro cinque minuti dall'isolamento. Potrebbe essere necessario regolare il primo tempo di incubazione EDL a seconda dell'attività del collagene, delle dimensioni dei muscoli, dell'età dell'animale o delle condizioni muscolari. Ad esempio, i muscoli con molto tessuto fibrotico possono richiedere un tempo di incubazione più lungo.

Inoltre, si noti che è stato dimostrato che l'agitazione durante questo periodo attiva le cellule S Durante il tempo di digestione controllare regolarmente il muscolo per evitare una digestione eccessiva. Interrompere la digestione quando i muscoli iniziano a sciogliersi e le miofibre diventano visibili. Utilizzando la pipetta di diametro grande, trasferire con cura entrambi i muscoli in una capsula di Petri preriscaldata.

Con quattro millilitri di terreno di lavaggio, la digestione eccessiva deve essere evitata in quanto si traduce in miofibre ipercontratte. Per rilasciare le fibre mio, utilizzare la pipetta di vetro di grande diametro per lavare il muscolo con un terreno caldo fino a quando le fibre iniziano a essere rilasciate naturalmente. Non tritrare il muscolo in quanto ciò comporterà inevitabilmente il danneggiamento delle fibre.

Continuare a rilasciare le myo fibre fino a raggiungere il numero desiderato. Non lasciare il piatto a temperatura ambiente per più di 10 minuti. Rimettilo nell'incubatrice per cinque minuti per riequilibrarlo prima di lavorarci ulteriormente.

La coltura contiene attualmente una miscela di singole fibre miogeniche vive, che sono strutture tubolari lunghe e lucenti, fibre ipercontratte, che sono scure e corte e detriti. Ora, utilizzando la pipetta di piccole dimensioni, trasferire le singole fibre MYOP vive in un nuovo piatto pre-sverminato. Gestisci ogni fibra myop individualmente.

Invece di trasferire la maggior parte delle fibre di myo tutte in una volta, se necessario, rimetti il piatto in un'incubatrice per 10-15 minuti per riequilibrare il mezzo. Trasferire le singole fibre myop altre due volte per rimuovere tutte le fibre myo morte e i detriti entro la fine di almeno tre lavaggi consecutivi. Solo singole myo fibre vive devono rimanere nella piastra per la coltura o l'analisi a valle.

Le fibre vive hanno una morfologia lunga. Al contrario, le fibre ipercontratte sono più corte e più spesse. Ora, incubare le fibre di miogenio isolate in terreno di lavaggio per almeno un'ora prima di passare al terreno di coltura.

In una nuova parabola di preriscaldamento, un mezzo alto consentirà l'attivazione delle cellule satelliti per colture lunghe. Matrigel potrebbe essere appropriato indipendentemente dal mezzo scelto. Cambialo a giorni alterni al momento dell'isolamento.

Le cellule satelliti su ciascun MyFi appaiono come minuscole protuberanze sulla superficie della miofibra se osservate al microscopio ottico. Se le miofibre vengono mantenute in un terreno ricco di siero per lunghi periodi di tempo, nella coltura si osservano prevalentemente miotubi completamente differenziati. I ceppi di topi reporter come la linea MIFF five Cree Rosa YFP sono strumenti ottimali per studiare il processo di rigenerazione muscolare.

Le provette Myo derivate da una coltura di fibre Miff five Cree Rosa YFP esprimevano il MIFF five reporter YFP. Ciò suggerisce che la rigenerazione muscolare richiede l'attivazione di Miff five. Il ceppo di topo pomodoro PAX seven Cree TD è un'altra linea reporter.

Il segnale di fluorescenza del pomodoro TD viene rilevato solo dalle cellule satelliti mentre i nuclei myON sono chiaramente negativi. Ciò suggerisce che il fattore di trascrizione PAX sette è espresso in modo univoco dalle cellule staminali muscolari e non dalla loro progenie differenziata. Le fibre myo e le celle satelliti associate possono essere fissate a valle.

Le cellule satelliti myo D positive PAC in immunofluorescenza sono classicamente considerate progenitori muscolari impegnati proliferativi. Completeranno il programma di differenziazione DOWNREGOLANDO PAC sette mantenendo la mia espressione OD o torneranno alla quiescenza sottoregolando la mia OD e mantenendo l'espressione PAC sette. La tecnica di isolamento a fibra singola ha la caratteristica unica di preservare la fisiologica Associazione di Cellule Satelliti Myofiber.

La fase più critica di questa procedura è la dissezione del muscolo EDL da tendine a tendine. La manipolazione minima delle fibre consente inoltre di preservare l'integrità e la vitalità delle fibre. Il successo dell'isolamento di singole fibre myop dipende da diversi fattori come l'attività del collagene, la condizione muscolare o l'età.

Ancora più importante, l'isolamento del muscolo da tendine a tendine consente di mantenere l'integrità delle fibre. Inoltre, una manipolazione minima delle fibre durante la procedura consente un tasso di sopravvivenza più elevato.