Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying

Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare un embrione di zebrafish arraying modello, seguita da una procedura dettagliata sull'uso di tale modello per throughput elevato zebrafish embrione arraying in una piastra a 96 pozzetti.

Questo metodo può accelerare significativamente la procedura di array degli embrioni di Zebrafish e rendere il Zebrafish veramente suscettibile di screening ad alto rendimento. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di un modello stampato in 3D per pre-disporre gli embrioni di Zebrafish in una matrice da 96 o 384 pozzetti, che facilita un processo di preparazione della piastra altamente efficiente. Abbiamo avuto l'idea del metodo per la prima volta durante l'esecuzione dello screening delle nanoparticelle prelevando e selezionando manualmente i singoli embrioni in ogni pozzetto di una piastra modulare e volevamo aumentare l'efficienza.

Oltre a Tianyu, il collega laureato Yue Jiang dimostrerà la procedura. Iniziare questa procedura con la progettazione del modello di array con un layout a 96 pozzetti dodici per otto che si adatta a una piastra standard da 96 pozzetti. Come dettagliato nel protocollo di testo.

Usa una stampante 3D con una precisione di 0,1 millimetri per stampare il modello. Alcuni componenti chiave del modello sono la camera di intrappolamento, il pozzetto di intrappolamento, la camera a vuoto e l'uscita dell'aria. Per eseguire la deposizione delle uova dell'embrione di pesce zebra, separare prima maschi e femmine con un divisore di plastica trasparente.

Quindi, posiziona due coppie di pesci maschio e femmina per scatola di accoppiamento un giorno prima della deposizione delle uova. Il giorno della deposizione delle uova, togliete i divisori al mattino per mescolare pesci maschio e femmina. Rimuovi il pesce maschio e femmina e raccogli gli embrioni di pesce zebra usando un colino a maglie fini.

Lavare gli embrioni con 250 millilitri di acqua d'uovo. Trasferisci gli embrioni raccolti in piastre di Petri con la soluzione di Holtfreter. Rimuovere gli embrioni morti e non fecondati utilizzando uno stereomicroscopio.

Metti gli embrioni in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius. A quattro ore dalla fecondazione, osservare gli embrioni e rimuovere gli embrioni morti e malsani. Gli embrioni sono ora pronti per la fase successiva.

Lavare la dima due o tre volte con 500 millilitri di acqua deionizzata prima di metterla nel forno di essiccazione per cinque minuti. Quindi, fissare la camera inferiore con una pellicola sigillante in pezzi. Collegare una pompa per vuoto attraverso l'uscita dell'aria nella parte inferiore della dima per generare una pressione negativa nella camera sigillata dalla pellicola sigillante.

Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, inserire circa 150 embrioni nella mascherina. Agitare l'intera mascherina orizzontalmente fino a quando ogni pozzetto non ha un embrione intrappolato. Con questo passaggio, è fondamentale controllare e assicurarsi di ogni embrione di pesce zebra disponibile.

Se il buffer Holtfreter era molto basso, si poteva aggiungere ulteriore buffer scuotendo il modello. Scartare la soluzione di Holtfreter in eccesso e gli embrioni che non sono intrappolati nei pozzetti. Spegnere e scollegare la pompa del vuoto.

Posizionare una piastra standard da 96 pozzetti capovolta contro la dima e ruotare entrambe contemporaneamente. Toccare la parte inferiore della dima o collegare l'uscita dell'aria a una bomboletta per spolverare gas compresso per trasferire tutti gli embrioni intrappolati dalla dima alla piastra a 96 pozzetti. Infine, rimuovere la pellicola sigillante e lavare la dima tre volte dall'alto verso il basso con 500 millilitri di acqua deionizzata per un uso futuro.

Qui è mostrata l'immagine parziale di una piastra a 96 pozzetti allineata con il modello. Al contrario, questa immagine mostra l'immagine parziale di una piastra a 96 pozzetti disposta manualmente. Qui viene visualizzato lo stato di salute generale degli embrioni dopo essere stati piastrati con metodi manuali e di mascherina.

Sulla base dei tassi di schiusa, sopravvivenza e malformazione degli embrioni, in entrambi i casi non sono stati osservati effetti significativi sulla salute generale degli embrioni. Una volta padroneggiata, questa tecnica preparerà una piastra da 96 o 384 pozzetti in soli due o tre minuti, se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per sfruttare appieno le nuove caratteristiche di questo organismo modello e ottenere veramente uno screening in vitro ad alto rendimento.