Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying
1 giugno 2018
Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare un embrione di zebrafish arraying modello, seguita da una procedura dettagliata sull'uso di tale modello per throughput elevato zebrafish embrione arraying in una piastra a 96 pozzetti.
Questo metodo può accelerare significativamente la procedura di array degli embrioni di Zebrafish e rendere il Zebrafish veramente suscettibile di screening ad alto rendimento. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di un modello stampato in 3D per pre-disporre gli embrioni di Zebrafish in una matrice da 96 o 384 pozzetti, che facilita un processo di preparazione della piastra altamente efficiente. Abbiamo avuto l'idea del metodo per la prima volta durante l'esecuzione dello screening delle nanoparticelle prelevando e selezionando manualmente i singoli embrioni in ogni pozzetto di una piastra modulare e volevamo aumentare l'efficienza.
Oltre a Tianyu, il collega laureato Yue Jiang dimostrerà la procedura. Iniziare questa procedura con la progettazione del modello di array con un layout a 96 pozzetti dodici per otto che si adatta a una piastra standard da 96 pozzetti. Come dettagliato nel protocollo di testo.
Usa una stampante 3D con una precisione di 0,1 millimetri per stampare il modello. Alcuni componenti chiave del modello sono la camera di intrappolamento, il pozzetto di intrappolamento, la camera a vuoto e l'uscita dell'aria. Per eseguire la deposizione delle uova dell'embrione di pesce zebra, separare prima maschi e femmine con un divisore di plastica trasparente.
Quindi, posiziona due coppie di pesci maschio e femmina per scatola di accoppiamento un giorno prima della deposizione delle uova. Il giorno della deposizione delle uova, togliete i divisori al mattino per mescolare pesci maschio e femmina. Rimuovi il pesce maschio e femmina e raccogli gli embrioni di pesce zebra usando un colino a maglie fini.
Lavare gli embrioni con 250 millilitri di acqua d'uovo. Trasferisci gli embrioni raccolti in piastre di Petri con la soluzione di Holtfreter. Rimuovere gli embrioni morti e non fecondati utilizzando uno stereomicroscopio.
Metti gli embrioni in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius. A quattro ore dalla fecondazione, osservare gli embrioni e rimuovere gli embrioni morti e malsani. Gli embrioni sono ora pronti per la fase successiva.
Lavare la dima due o tre volte con 500 millilitri di acqua deionizzata prima di metterla nel forno di essiccazione per cinque minuti. Quindi, fissare la camera inferiore con una pellicola sigillante in pezzi. Collegare una pompa per vuoto attraverso l'uscita dell'aria nella parte inferiore della dima per generare una pressione negativa nella camera sigillata dalla pellicola sigillante.
Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, inserire circa 150 embrioni nella mascherina. Agitare l'intera mascherina orizzontalmente fino a quando ogni pozzetto non ha un embrione intrappolato. Con questo passaggio, è fondamentale controllare e assicurarsi di ogni embrione di pesce zebra disponibile.
Se il buffer Holtfreter era molto basso, si poteva aggiungere ulteriore buffer scuotendo il modello. Scartare la soluzione di Holtfreter in eccesso e gli embrioni che non sono intrappolati nei pozzetti. Spegnere e scollegare la pompa del vuoto.
Posizionare una piastra standard da 96 pozzetti capovolta contro la dima e ruotare entrambe contemporaneamente. Toccare la parte inferiore della dima o collegare l'uscita dell'aria a una bomboletta per spolverare gas compresso per trasferire tutti gli embrioni intrappolati dalla dima alla piastra a 96 pozzetti. Infine, rimuovere la pellicola sigillante e lavare la dima tre volte dall'alto verso il basso con 500 millilitri di acqua deionizzata per un uso futuro.
Qui è mostrata l'immagine parziale di una piastra a 96 pozzetti allineata con il modello. Al contrario, questa immagine mostra l'immagine parziale di una piastra a 96 pozzetti disposta manualmente. Qui viene visualizzato lo stato di salute generale degli embrioni dopo essere stati piastrati con metodi manuali e di mascherina.
Sulla base dei tassi di schiusa, sopravvivenza e malformazione degli embrioni, in entrambi i casi non sono stati osservati effetti significativi sulla salute generale degli embrioni. Una volta padroneggiata, questa tecnica preparerà una piastra da 96 o 384 pozzetti in soli due o tre minuti, se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per sfruttare appieno le nuove caratteristiche di questo organismo modello e ottenere veramente uno screening in vitro ad alto rendimento.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per progettare e fabbricare un modello di disposizione per embrioni di zebrafish, che consente una disposizione ad alto rendimento in una piastra a 96 pozzetti. Il metodo migliora significativamente l'efficienza della procedura di disposizione degli embrioni di zebrafish.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia dello sviluppo
- Screening ad alto rendimento
Contesto
- Gli zebrafish sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica grazie ai loro embrioni trasparenti.
- Una disposizione efficiente degli embrioni è cruciale per le applicazioni di screening ad alto rendimento.
- I metodi tradizionali comportano una selezione manuale, che può essere dispendiosa in termini di tempo.
- L'introduzione di un modello stampato in 3D offre una nuova soluzione per migliorare l'efficienza.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la disposizione ad alto rendimento di embrioni di zebrafish.
- Utilizzare un modello stampato in 3D per un'efficiente disposizione degli embrioni.
- Migliorare il processo di screening per varie applicazioni, incluso il test di nanoparticelle.
Metodi utilizzati
- Progettazione di un modello di disposizione stampato in 3D con un layout di 12 per 8.
- Pre-disposizione degli embrioni di zebrafish in una matrice di 96 o 384 pozzetti.
- Dimostrazione della procedura da parte di studenti laureati.
- Protocollo testuale dettagliato per l'implementazione.
Principali risultati
- Il modello stampato in 3D consente una disposizione rapida ed efficiente degli embrioni.
- Risparmio di tempo significativo rispetto ai metodi manuali.
- Facilita le capacità di screening ad alto rendimento.
- Ha dimostrato efficacia nella preparazione di piastre per esperimenti.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato migliora l'efficienza della disposizione degli embrioni di zebrafish.
- L'utilizzo di un modello stampato in 3D è un'innovazione chiave.
- Questo metodo è vantaggioso per i ricercatori che conducono screening ad alto rendimento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High throughput zebrafish embryo arraying is a critical bottleneck in phenotypic screening and early-stage compound evaluation. The introduction of a 3D-printed template with vacuum manipulation enables rapid, reproducible preparation of multi-well plates, directly supporting scalable screening workflows. This innovation enhances operational efficiency and supports portfolio-wide compound triage in discovery-stage biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates preparation of zebrafish embryos for hypothesis-driven compound testing.
- Enables robust phenotypic screening by standardizing embryo placement across wells.
- Supports functional target validation by facilitating high-content, parallelized assays.
Screening & Assay Development
- Delivers rapid, reproducible arraying of embryos for multi-well plate-based screening.
- Improves assay throughput and consistency, reducing manual variability.
- Enables efficient scaling to 96- and 384-well formats for compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Supports disease-relevant phenotypic assays in zebrafish embryos for translational insights.
- Facilitates continuity from early discovery to preclinical model validation.
- Reduces operational barriers to implementing high-throughput in vivo screening platforms.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D-printed template method integrates at the interface of early discovery and screening, enabling seamless transition from embryo collection to high-throughput phenotypic assays.
- Discovery Biology: Streamlines hypothesis testing by enabling rapid setup of parallel experimental conditions.
- Screening: Provides standardized, reproducible embryo arraying for quantitative screening outputs.
- Analytics: Supports consistent measurement of phenotypic endpoints across large sample sets.
- Translational Research: Bridges early discovery and preclinical validation by enabling scalable in vivo assays.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for repeated high-throughput screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological variability in screening assays.
- Operational Value: Standardizes embryo arraying, enabling reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, high-throughput phenotypic data generation.
Implementation Considerations
- Requires access to precision 3D printing and basic vacuum instrumentation.
- Demands operator proficiency in embryo handling and template operation.
- Standardization of washing and transfer steps is critical for reproducibility.
- Adaptable to both 96- and 384-well plate formats for diverse screening needs.
- Template cleaning and maintenance are essential for sustained performance.
