Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra
10 aprile 2020
I modelli di xenotrapianto di pesce zebra consentono lo screening farmacologico ad alto consumo e l'imaging fluorescente delle cellule tumorali umane in un microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo screening automatizzato dei farmaci su su larga scala su campioni di leucemia derivati dal paziente nel pesce zebra utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza automatizzata.
Il nostro flusso di lavoro di screening dei farmaci allo xenograft zebrafish consente l'imaging automatizzato e la quantificazione delle cellule tumorali umane e la loro risposta al trattamento farmacologico. Può essere usato per testare rapidamente la risposta delle cellule tumorali di una pazienza a farmaci noti o per identificare nuovi composti anticancro. L'uso di modelli di xenografia zebrafish e lo screening farmacologico consentono numeri replicanti Inviva che in precedenza erano ottenibili solo con sistemi in vitro.
È anche molto più conveniente rispetto ai modelli di mouse allo screening attraverso grandi librerie di composti. Questo flusso di lavoro ha diversi passaggi dall'interiezione delle cellule tumorali nel pesce zebra all'imaging della risposta ai farmaci che si imparano meglio con la dimostrazione visiva. Per iniziare, centrifugare un minimo di due volte 10 alla sesta cellule in cinque millimetri di PBS a 200 volte g per cinque minuti e aspirare il supernatante.
Resuspend la tavolozza delle celle in cinque millimetri di soluzione di colorazione dii. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius protette dalla luce per 20 minuti. Quindi vortice delicatamente e incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti protetti dalla luce.
Quindi centrifugare le cellule a 200 volte g per cinque minuti e aspirare il supernatante. Lavare le cellule aggiungendo cinque millilitri di PBS, centrifugando a 200 volte g per cinque minuti e aspirando il supernatante. Ripetere il lavaggio un'altra volta.
Rimescolare le cellule in un microlitro di PBS per 250 mila cellule vive e trasferirle in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millimetri. Tenere le cellule rimorsiate sul ghiaccio al buio. Prima di macchiare le cellule e iniettare, fare piastre di agarosio per l'iniezione versando 25 millileer di agarosio al tre per cento in 1X TBE in una piastra di petri e lasciare che si solidifichi.
Conservare le piastre a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Anche prima di macchiare le cellule e iniettare, declorazione due giorni dopo la fecondazione zebra pesce usando le forcep al microscopio di sezionazione. Tirare dalle estremità opposte del chorion protettivo del pesce zebra con le forcep fino a quando il chorion si strappa e il pesce zebra si dipana.
Per prevenire l'accumulo di cellule durante la microiniezione, pre chill aghi di vetro borosilicati non filamentosi a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio. Immediatamente dopo la colorazione delle celle, utilizzare una punta della pipetta del microloader per caricare cinque microlitri di celle macchiate nell'ago refrigerato. Caricare l'ago nel braccio del microiniettore.
Livellare la punta dell'ago usando una lama sterile. Utilizzando un micrometro a stadio, misurare le dimensioni delle goccioline nell'olio minerale. Mantenere il volume delle goccioline in modo coerente a due nanolitri, che ha un diametro di circa 1,5 millimetri.
Un minuto dopo l'anestesia, trasferire le larve anestetizzate su una piastra di iniezione superficiale piatta preparata con il tre per cento di agarosio e iniettare alle larve una pompa di cellule macchiate nel sito di iniezione desiderato. Tutte le iniezioni devono essere completate entro una o tre ore dalla colorazione delle cellule per evitare l'accumulo dell'ago. Lavare le larve dalla piastra di iniezione in una piastra di petri di 10 centimetri contenente mezzi E3 senza blu di metilene e incubare a 28 gradi Celsius per un periodo di recupero di un'ora.
Spostare il piatto delle larve iniettate in un'incubatrice di 34 gradi Celsius. Con una piastra di petri vuota posta tra lo scaffale e la piastra di petri delle larve per fungere da tampone. A 48 ore dopo l'iniezione, scherma le larve di pesce zebra per l'innesto e la salute delle cellule tumorali fluorescenti.
Rimuovere qualsiasi pesce zebra morto o malformato e selezionare i pesci zebra con un innesto simile. Rimuovere i pesci zebra non innestati. Per i pesci iniettati al tuorlo, rimuovere i pesci dove i bordi del giogo non possono essere visti intorno alla massa cellulare intasata.
Per i pesci iniettati al pericardio, rimuovere i pesci in cui la massa cellulare iniettata invade il sacco di tuorlo. Per trasferire il pesce selezionato su una piastra da 96 pozzetti, tagliare prima la punta da una punta di pipetta da 200 microliter, abbastanza grande da far passare un pesce zebra post fertilizzazione di quattro giorni. Aspirare 150 microlitri di supporti E3 con un pesce zebrato dalla piastra utilizzando la pipetta P200 e aggiungerlo a un pozzo vuoto di una piastra piatta inferiore a 96 poggia.
Aggiungere 150 microlitri di soluzione di farmaci diluiti 2X a ciascuna larva di pesce zebra ben contenente per raggiungere un volume finale di 300 microlitri con soluzione di farmaco 1X per pozzo. Incubare la piastra a 34 gradi Celsius. Controlla ogni giorno la presenza di pesci zebra morti.
Dopo due giorni, se lo si desidera, aggiornare il farmaco sostituendo 200 microlitri di liquido da ogni pozzo con soluzione di farmaco 1X o DMSO nei supporti E3. Nel software Zen blue, rimuovere tutti i canali fluorescenti indesiderati nel software di imaging e aggiungere il canale Dii. Controllare il canale fluorescente desiderato.
Nella stessa finestra, seleziona come verranno scattate le immagini, gli stack Z, l'automazione, i loop e le serie, eccetera. Immagini il pesce di controllo DMSO prima del pesce trattato con farmaci. E impostare il tempo di esposizione appropriato nel software di imaging.
Per quantificare la fluorescenza, aprire il software imagej. Passare al file, aprire e selezionare il file CZI desiderato. Il software fa emergere una finestra delle opzioni di importazione.
Per la visualizzazione dello stack, selezionare hyperstack, controllare i file aperti singolarmente, controllare la scalabilità automatica e controllare i canali divisi. Per l'opzione colore, selezionare colorazione. Quindi fare clic su plugin, macro, registrare.
Fare clic su immagine, regolare, soglia. Selezionare il tipo di immagine come rosso nel menu a discesa sul lato destro della finestra di soglia. Regolare la soglia minima fino a quando il software evidenzia solo le aree con fluorescenza, quindi fare clic su applica.
Il software converte la foto in bianco e nero con l'area selezionata in nero. Fare clic su analizza e misura. Il software estrae una finestra dei risultati contenente l'area fluorescente per quell'immagine.
Fare clic su Crea nella finestra del registratore di macro. In questo modo viene aperta una nuova finestra con il codice per la macro. Evidenzia tutte le immagini desiderate per l'analisi e apri in base all'opzione di visualizzazione dell'impilamento o colore.
Selezionare Esegui nella finestra con la macro. La finestra dei risultati ora contiene l'area per ogni immagine. In questo protocollo, a 48 ore dalla post iniezione, i pesci xenografati sono stati vengono etichettati con etichette fluorescenti le cellule tumorali e trattati con chemioterapia o DMSO.
Nel complesso, i pesci xenografati trattati con Vincristine hanno mostrato la più grande e consistente diminuzione della massa cellulare xenografata rispetto al pesce trattato con DMSO. Il pesce trattato con desametasone ha mostrato circa la metà della riduzione dell'area tumorale rispetto alla Vincristina. Ma ha comunque mostrato una riduzione dell'area tumorale rispetto al DMSO.
Questa procedura può essere utilizzata per migliorare qualsiasi linea cellulare tumorale o campione di paziente per rispondere a diversi farmaci o terapie mirate specifiche che forniscono informazioni sul tumore di ogni paziente.
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Panoramica
Questo studio presenta un flusso di lavoro di screening farmacologico con xenotrapianto di zebrafish che consente l'imaging e la quantificazione automatizzati di cellule tumorali umane. Il metodo permette il test rapido di campioni di leucemia derivati da pazienti contro farmaci noti e l'identificazione di nuovi composti antitumorali.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Screening farmacologico
Contesto
- I modelli di zebrafish forniscono un ambiente in vivo per la ricerca sul cancro.
- L'imaging automatizzato migliora l'efficienza della valutazione della risposta ai farmaci.
- I campioni derivati dai pazienti offrono un modello più rilevante per i test.
- Costo-efficacia rispetto ai modelli tradizionali di topo.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un flusso di lavoro per lo screening farmacologico ad alto rendimento.
- Automatizzare il processo di imaging per una migliore quantificazione delle risposte ai farmaci.
- Facilitare l'identificazione di nuovi composti antitumorali.
Metodi utilizzati
- Iniezione di cellule tumorali in zebrafish.
- Microscopia a fluorescenza automatizzata per l'imaging.
- Quantificazione delle risposte ai farmaci in vivo.
- Test contro grandi librerie di composti.
Risultati principali
- Imaging e quantificazione riusciti di cellule tumorali umane.
- Valutazione rapida delle risposte ai farmaci in campioni derivati dai pazienti.
- Identificazione di potenziali nuovi composti antitumorali.
- Dimostrazione della costo-efficacia dei modelli di zebrafish.
Conclusioni
- Il modello di xenotrapianto di zebrafish è uno strumento prezioso per lo screening farmacologico.
- I flussi di lavoro automatizzati migliorano l'efficienza della ricerca.
- Questo approccio potrebbe portare a migliori opzioni terapeutiche per la leucemia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Zebrafish patient-derived xenograft (PDX) drug screening enables rapid, high-throughput in vivo evaluation of cancer therapies, addressing the need for scalable, cost-effective models in early oncology discovery. This workflow supports predictive confidence in drug response by combining large replicate numbers with automated quantification, bridging the gap between in vitro screens and traditional mouse PDX models. The approach enhances portfolio triage and accelerates actionable insights for translational oncology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of patient tumor samples in a living system for target validation.
- Supports biological de-risking by providing in vivo context for drug response.
- Facilitates rapid hypothesis testing across diverse compound libraries.
- Improves predictive confidence for advancing candidate therapies.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative readouts of tumor area and drug response using automated imaging.
- Enables high-throughput screening with large replicate numbers previously limited to in vitro systems.
- Supports reproducibility and scalability for compound evaluation workflows.
- Prepares validated in vivo models for downstream translational studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns drug response data with patient-specific tumor biology for translational relevance.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation using clinically derived samples.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on in vivo efficacy signals.
- Supports identification of actionable mutations and targeted therapy responses.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish PDX screening method integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, offering a scalable alternative to mouse models for in vivo drug response assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using patient-derived tumor cells in vivo.
- Screening: Provides assay readiness and reproducible, quantitative outputs for large-scale compound evaluation.
- Analytics: Delivers automated measurements of tumor area and drug response for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages with patient-relevant efficacy data.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for oncology drug screening across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early oncology discovery.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of in vivo drug screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling rapid, cost-effective in vivo assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and fluorescence imaging.
- Needs access to automated imaging platforms and analytical software for quantification.
- Demands cross-team standardization of injection, imaging, and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different tumor types or targeted therapies.
- Current limitations include automation and quantification scalability for larger screening campaigns.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Fluorescently Labeling Cells with DiI(1,1 -Dioctadecyl-3,3,3 ,3 -Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)
2:10
Microinjecting Zebrafish Larvae
4:37
Setting up Drug Screen with Xenografted Zebrafish
6:22
Imaging Xenografted Zebrafish and Quantifying Fluorescence
8:36
Results: Xenografted Tumor Area
9:22
Conclusion
