Name: Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Scopri come ottimizzare l'adesione di cellule staminali mesenchimali umane su filati elettrofilati di PCL. Questo metodo confronta condizioni statiche e dinamiche per massimizzare l'attacco cellulare iniziale.

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Gli autori desiderano ringraziare e riconoscere il Medical Research Council per il finanziamento di questa ricerca - MRC-FAP codice concessione G1000788-98812.

Fabrication 1.Scaffold e sterilizzazione <ol><li> Sciogliere PCL in 1,1,1,3,3,3-esafluoroisopropanolo per dare un 10% w / v concentrazione. Come descritto in Bosworth et al, 9 electrospin soluzione polimerica (parametri: 20 kV, 1 ml / hr, 20 cm). Raccogli fibre allineate sul bordo di un mandrino rotante (600 rpm). Con un bisturi rimuovere il nastro di fibra raccolte e poi tagliate in lunghezze più corte - 3 cm (per le depressioni e le navi rotanti) e 4 cm (per colture cellulari inserti) lunghezze. </li><li> Utilizzando una pinza sottile immergersi strisce individuali in acqua distillata e rimuovere. </li><li> Tenendo entrambe le estremità tra il pollice e l&#39;indice; ruotare manualmente il nastro fino a quando non assomiglia thread. </li><li> Brevemente immergere questo scaffold filiforme in acqua distillata e immissione sul pulito, carta non fibrose asciugare. </li><li> Una volta asciutto, posto singolarmente in tubi microcentrifuga pulito e aggiungere 1 ml di 50% v / v di etanolo in acqua distillata. Chiudere i coperchi e lasciare per 24 ore. Nota: Effettuare le seguenti operazioni sotto flusso laminare: </li><li> Inserire provette da microcentrifuga in una cappa a flusso laminare e aspirare il 50% v / v soluzione. Sostituire con 1 ml 70% v / v di etanolo in acqua distillata, chiudere i coperchi e lasciare per 24 ore. </li><li> Ripetere per 90% e il 100% v / v di etanolo in acqua distillata (1 ml volumi). </li><li> Lavare ponteggi due volte con tampone fosfato soluzione salina (PBS), 24 hr per lavaggio (2 x 1 ml). </li><li> Rimuovere PBS e sostituirlo con 1 ml di coltura cellulare multimediale. Nota: Ponteggi sono pronti per l&#39;uso post-24 ore. </li></ol> 2. Determinazione Area Scaffold superficie e numero di celle <ol><li> Utilizzando un microscopio e di imaging software luce, misurare il diametro del filo elettrofilate lungo la sua lunghezza per determinare un valore medio. </li><li> Si supponga che il filo ad una barra cilindrica e approssimare la superficie utilizzando: </li><li> Dove A = Superficie, r = raggio e h = lunghezza Nota: La superficie è stata calcolata essere 18.902, 800 micron 2. Inoltre, va notato che l&#39;area superficiale effettiva sarà maggiore di questo calcolo, il filo è costituito da centinaia di fibre fini, che aumentano la superficie. Di conseguenza un maggior numero di celle deve essere in grado di applicare al ponteggio. Tuttavia, questo non pregiudica un confronto diretto tra i gruppi di prova in corso. </li><li> Determinare il numero massimo di celle che possono attaccare alla superficie esposta scaffold da: Nota: Utilizzando un microscopio e di imaging software luce, il diametro di cellule staminali mesenchimali umane è stato determinato in 20 micron (cellule presumendo sono rotondi), quindi in questo caso, il numero di cellule = 60.200. </li></ol> 3. Scaffold Set-up - Colture Cellulari inserti (Figura 1A) <ol><li> Sotto flusso laminare, aprire i 6 e gli inserti di coltura cellulare sterili e separare gli anelli più brevi con i denti dai corpi più ampio inanellati. </li><li> Prendete l&#39;anello con i denti verso l&#39;alto. Telo unodei quattro centimetri scaffold sul centro del ring assicurandosi che sovrappone su entrambi i lati. Prendere il corpo e la posizione inanellati sopra l&#39;anello dentato e scaffold e spingere verso il basso assicurandosi che il ponteggio rimane in posizione e passa attraverso il centro dell&#39;inserto di coltura cellulare. </li><li> Collocare l&#39;inserto coltura cellulare con scaffold nel pozzo di una ben 6, basso piatto vincolante. </li><li> Aggiungere 10 ml di coltura al patibolo. </li></ol> 4. Scaffold Set-up - Trough (Figura 1B) <ol><li> Sotto flusso laminare, posto poli (tetrafluoroetilene) (PTFE) abbeveratoi in singole piastre di Petri e aggiungere 10 ml di terreni di coltura per la depressione. </li><li> Utilizzando pinze coprono una delle tre centimetri scaffold nel trogolo, assicurandosi che la sua lunghezza è parallelo al bordo più lungo del trogolo. </li></ol> 5. Scaffold Set-up - bioreattore Vessel (Figura 1C) <ol><li> Sotto flusso laminare, a meno di 10 ml di PBS sterile attraverso il bioreattore nave delporto principale e lasciare per 10 min. </li><li> Rimuovere la PBS e sostituirlo con 8 ml di coltura. </li><li> Utilizzando pinze, inserire uno dei ponteggi tre centimetri nel vaso attraverso la porta principale. </li><li> Chiudete la porta principale. </li></ol> 6. Conteggio delle cellule <ol><li> Le cellule staminali mesenchimali umane Cultura (hMSC) derivate dal midollo osseo in base al protocollo fabbricante, fino al passaggio 4 prima della raccolta. </li><li> Aspirare il supporto da 75 cm 2 pallone contenente hMSCs derivate dal midollo osseo (passaggio 4, 80% confluenza). </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS sterile e aspirare. </li><li> Aggiungere 3 ml di tripsina e incubare il matraccio a 37 ° C, 5% CO 2 finché le cellule hanno staccato dalla superficie matraccio. </li><li> Aggiungere 7 ml terreni di coltura per inattivare l&#39;enzima e trasferire questo volume totale (10 ml) in una provetta per centrifuga. </li><li> Risospendere la sospensione cellulare pipettando su e giù parecchie volte per disperdere in modo omogeneo le cellule all&#39;interno dellamedia e agglomerati di cellule limite (10 ml pipetta). </li><li> Rimuovere 20 ml di sospensione cellulare e trasferimento in un emocitometro. </li><li> Posizionare il emocitometro sotto un microscopio ottico e immagine a scopo x10. </li><li> Concentrarsi le griglie e contare il numero di cellule nei 4 x 4 quadrati in ogni angolo della rete e che rientra nell&#39;ambito di piazza e quelli che attraversano la mano destra o la linea di confine di fondo. Contare per ogni set di 4 x 4 quadrati (4 conteggi per griglia). </li><li> Ripetere il numero di risospensione e la cella per tre volte (passi 6,6-6,9). </li><li> Calcolare il numero medio di cellule e determinare il volume dei mezzi necessari per la risospensione delle cellule (concentrazione cellulare 60.200 in 200 ml). Ad esempio, determinare il numero di celle media dal emocitometro e quindi determinare il numero medio complessivo di cellule dai tre conteggi separati. Moltiplicare questo 1 x 10 4 invia il numero di cellule per ml e poi moltiplicare per il volume totale della sospensione cellulare per darenumero Tal di cellule. Utilizzare la seguente equazione per determinare il volume dei mezzi necessari per la risospensione: </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 241 xg per 5 min. </li></ol> Seeding 7. cellulare <ol><li> Aspirare il supporto dal tubo centrifugato lasciando il pellet e sostituire con il volume del supporto calcolato. </li><li> Risospendere le cellule e dei media per una miscela omogenea. </li><li> Usando una pipetta P200 Gilson, lentamente erogare 200 ml di sospensione cellulare su ogni scaffold eseguendo la punta della pipetta lungo la lunghezza scaffold e sotto la superficie del supporto liquido. Lasciare riposare per 20 minuti. </li><li> Per le navi bioreattori, erogare 200 ml di sospensione cellulare attraverso la porta principale. Top-up il rimanente mezzo di coltura 2 ml tramite le porte siringa per dare un volume totale di 10 ml. </li></ol> 8. Avvio sperimentale <ol><li> Trasferire i vasi bioreattore al bioreattore RCC-4DQ e impostare la rotazione a 9 giri. </li><li> TranSFER le piastre e con inserti di coltura cellulare e bassi alla piastra shaker e impostare la rotazione a 30 giri al minuto. </li><li> Trasferire le piastre e con inserti di coltura cellulare e bassi per il ripiano di un incubatore di cellule a 37 ° C, 5% CO 2 (cultura statica). </li></ol> 9. DNA Assay <ol><li> Preparare le soluzioni tampone - lisi, tampone 1x TE, standard di DNA e di soluzioni di lavoro del DNA delle cellule - come da istruzioni del produttore. </li><li> Dopo 4 ore, togliere i campioni dal termostato e mettere sotto flusso laminare. </li><li> Rimuovere le frazioni multimediali da tutti i campioni e metterli in provette etichettati separatamente. Centrifugare le provette 241 xg. Rimuovere il surnatante e aggiungere tampone di lisi 3 ml. Risospendere la soluzione a rottura, il pellet di cellule. </li><li> Utilizzando pinze rimuovere i ponteggi e posto in provette contenenti 3 ml di tampone di lisi (per i ponteggi all&#39;interno dei vasi bioreattori, rimuovere l&#39;impalcatura prima aspirazione del media). Per ponteggi condotte nell&#39;ambito inserti di coltura cellulare, prima liberare l&#39;impalcatura tagliando il ponteggio vicino al bordo dell&#39;inserto con un bisturi. </li><li> Aggiungere 3 ml di tampone di lisi per ogni recipiente scaffold e raschiare la superficie (agitare energicamente per i vasi bioreattori). Rimuovere il tampone di lisi e mettere in provette etichettati separatamente. </li><li> Vortex ogni provetta da centrifuga per circa 1 min per garantire sufficiente agitazione delle cellule e bufferizzare e incoraggiare lisi della membrana cellulare. </li><li> In un nero 96 pozzetti, aggiungere 100 ml di tampone di lisi per ogni frazione del campione - impalcatura, media e ben (duplicare). </li><li> Nel buio, aggiungere 100 ml di soluzione di DNA delle cellule di tutti i pozzetti contenenti tampone di lisi e mescolare delicatamente. </li><li> Include pozzetti con tampone di lisi contenente nessun DNA e DNA cellulare soluzione per fornire un controllo negativo e positivo per la piastra bene. </li><li> Utilizzando una fluorescenza piatto-reader, l&#39;estinzione del pozzos utilizzando 485 nm di eccitazione e 520 nm di emissione. </li><li> Confrontare i dati con la curva standard generata dagli standard del DNA come da istruzioni del produttore. </li></ol> 10. Microscopio elettronico a scansione (SEM) Fixation <ol><li> Effettuare le seguenti operazioni in condizioni di flusso laminare: Dopo 4 ore, rimuovere tutti i ponteggi dai loro recipienti e posto all&#39;interno di un nuovo 6-pozzetti (pozzetti separati). </li><li> Lavare i ponteggi due volte con PBS. </li><li> Effettuare le seguenti operazioni sul banco aperto: per ogni bene, aggiungere 2 ml di 1,5% v / v glutaraldeide in PBS per garantire una copertura completa del patibolo. </li><li> Lasciare la piastra per almeno 30 minuti a 4 ° C per il fissaggio delle cellule. </li><li> Rimuovere la soluzione fissativo e lavare i ponteggi due volte con PBS. </li><li> Disidratare i ponteggi con concentrazioni crescenti di etanolo in acqua distillata partendo da 50% v / v, seguito dal 70% v / v e 90% v / v. Per ogni concentrazione, immergere completamente i ponteggi in solution (2 ml) e lasciare per 3 min. Scartare la soluzione e ripetere. </li><li> Disidratare in 100% etanolo submersing pienamente scaffold in soluzione (2 ml) e lasciando per 5 min. Scartare la soluzione e ripetere. </li><li> Chimicamente asciugare i ponteggi con esametildisilazano (HMDS) all&#39;interno di una cappa. Immergere i ponteggi in HMDS (2 ml) e lasciare per 5 min. Rimuovere le HMDS e ripetere. </li><li> Rimuovere le HMDS e permettere ai ponteggi asciugare. Montare i ponteggi su disponibili in commercio stub SEM (in questo caso mozziconi in acciaio inox con alette in carbonio adesive). </li><li> Per facilitare la visualizzazione all&#39;interno del SEM, cappotto i campioni utilizzando una verniciatura gold-polverizzazione per 2 minuti per assicurare una copertura sottile e uniforme. </li><li> I campioni all&#39;interno del SEM e visualizzare i ponteggi cellulari testa di serie con un fascio di elettroni 5 keV. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Matrici fibra elettrofilate fabbricati da biopolimeri vengono regolarmente utilizzati per sostenere l&#39;adesione delle cellule e la proliferazione di biomateriali e / o ingegneria dei tessuti applicazioni 11,12. In questi casi, le matrici sono spesso sottili fogli di fibre che coprono facilmente l&#39;intera base di una piastra di coltura cellulare bene e quindi sono in completo contatto con cellule seminate che migliora l&#39;adesione cellulare. Tuttavia, se il ponteggio biomateriale non copre completamente la base della piastra ben, c&#39;è un&#39;alta probabilità che una gran parte delle cellule seminate non rimanere in contatto con l&#39;impalcatura e alla fine non sarà in grado di collegare. Questo studio ha esaminato diversi metodi per la semina cellule su scaffold che non coprono la base del piatto bene, al fine di determinare una tecnica ottimizzata che potrebbe essere raccomandato per gli esperimenti a base di cellule futuri. Cinque diversi set-up sono stati studiati (Figura 1): ScaffoLDS (filati elettrofilate) ha tenuto con inserti di coltura di cellule all&#39;interno di pozzetti vincolante bassi e sia mantenuto in condizioni statiche o agitato al 30 rpm; ponteggi collocati all&#39;interno depressioni PTFE strette e detenuti statica o scosso al 30 rpm; e ponteggi alloggiati all&#39;interno dei vasi bioreattori che ruotano a 9 giri. Determinazione del numero di cellule che avevano aderito ai filati elettrofilate tramite test del DNA ha dimostrato una bassa percentuale di attacco per tutti semina set-up (Figura 2); e questo è stata ulteriormente confermata dalla scansione microscopio elettronico (SEM) (Figura 3). Adesione cellulare Greatest - 30% o ~ 18.060 cellule -è stato osservato per filati che si sono svolte all&#39;interno di inserti di coltura cellulare e sottoposti a movimento continuo. È interessante notare che l&#39;adesione cellulare più basso (15%) è stato raggiunto per i filati detenuti da inserti di colture cellulari, ma tenuti in condizioni statiche, che suggerirebbero che l&#39;inclusione del movimento radiale ha un effetto positivo sul mantenimento delle cellule a contatto con il patibolo. Tuttavia,va notato che circuitazione del flusso continuo dei media potrebbe essere responsabile per gli agglomerati cellulari osservati dalle immagini SEM. La piastra shaker è stato fissato sulla sua minima - 30 giri - che potrebbe essere una limitazione di questo set-up. Con un movimento radiale più bassa può aiutare a prevenire o ridurre l&#39;agglomerazione delle cellule e può anche migliorare l&#39;adesione delle cellule, come le cellule sperimenteranno meno forza. Esperimenti futuri dovrebbero concentrarsi sull&#39;ottimizzazione della velocità shaker ideale per il fissaggio delle cellule migliorata. Incorporando proposta di filati ricoperte all&#39;interno delle mangiatoie non ha comportato un andamento simile, con entrambi gli scenari cedendo il 18% di attacco (~ 10.836 cellule); se questo può essere dovuto al galleggiamento parziale dei ponteggi all&#39;interno delle depressioni (osservata per mangiatoie immessi sul piatto agitatore) in quanto non sono stati ancorati alla base. Parziale galleggiamento del ponteggio impedirà qualsiasi cellule che hanno toccato il fondo della vasca di venire a contatto con il materiale e aderente. Per tla sua particolare configurazione, la vasca è alloggiato all&#39;interno di una capsula di Petri e un volume totale di 10 ml di supporti aggiunto. Le ridotte dimensioni del trogolo significa che la maggioranza dei media è presente all&#39;interno della capsula di Petri e se c&#39;è alcun movimento, cellule può allontanarsi dal trogolo nella capsula di Petri e rimanere completamente fuori dalla portata del ponteggio. Per superare queste limitazioni, ulteriori esperimenti dovrebbero includere un ulteriore passo nel protocollo, per cui le estremità dei ponteggi sono riposte alla base delle depressioni mediante fine-aghi sterili, come questo dovrebbe impedire il loro galleggiamento e movimento (in particolare per ponteggi esposti a movimento radiale), che alla fine dovrebbe portare ad un aumento del numero di cellule inerenti al patibolo. 16% delle cellule era attaccato ai fili presenti all&#39;interno dei vasi rotanti. Pur essendo una tecnica ben consolidata per la cultura in 3D, i problemi si presentano con la rimozione dei ponteggi dal porto principale di vasi &#39;, che possa aver provocato attac vagamentecellule HED sta perdendo. Le navi che possono essere completamente aperte eliminerebbe questo problema; questi sono disponibili per l&#39;acquisto, ma sono molto più costosi di quelli delle navi e getta utilizzati in questo studio. Questo studio dimostra i problemi attuali con la semina ponteggi che non coprono l&#39;intera base di piatti e standard di coltura cellulare. Semina un numero di cellule noto portato in meno di un terzo fissaggio al ponteggio, nonostante superficie del ponteggio consentendo tutte le cellule di aderire. Ciò potrebbe avere conseguenze negative in altri saggi cellulari che possono valutare il comportamento biocompatibilità e cellula-materiale / cellula-cellula e le interazioni con il patibolo come futuro dispositivo medico potenziale. Ulteriori limitazioni dello studio possono includere il 4 hr time-point - nonostante sia abbastanza lungo per garantire semina cellula iniziale (cellule hanno dimostrato di fissare saldamente ai substrati in trenta minuti 13,14,15), può essere ragionevole investigate successivi punti temporali fornire cellule non proliferano durante un periodo di tempo più lungo in quanto ciò altrimenti inclinare il numero di cellule di partenza. Ridurre il volume del supporto, in questo caso 10 ml, potrebbe anche migliorare il contatto tra le cellule e scaffold ed infine aumentare l&#39;adesione cellulare. Studi futuri dovrebbero anche considerare la vitalità delle cellule, come il processo di semina cellulare può causare danni alle cellule e / o morte cellulare 16. Test del DNA cellulare non distinguono tra le cellule vitali e non vitali, come un live test del genere / morto, per esempio, potrebbe evidenziare il livello di redditività. Questa indagine sensibilizza al numero effettivo di cellule che si attaccano al ponteggio nonostante seminare una quantità nota. Per gli studi che si basano sul numero iniziale di cellule, è molto importante che i ricercatori sapere esattamente quanti di quella figura fanno infatti aderire al substrato di interesse.

Ponteggi sono regolarmente sviluppati e studiati per le applicazioni di biomateriali e di ingegneria tissutale. Come tali, essi sono comunemente seminati con cellule e il loro comportamento in vitro caratterizzati tramite saggi che determinano la proliferazione cellulare e il numero di cellule, per esempio. Per gli esperimenti di questo tipo, è imperativo che il numero cellula iniziale sia noto ricercatori spesso indicare la concentrazione semina in termini di numero di cellule per ml o cm 2. Mentre questo è buona pratica, specialmente per scopi di scale-up, non tiene conto del numero effettivo di cellule che aderiscono alla superficie ponteggio (che dipende anche le proprietà adesive della superficie biomateriale 1). Ciò è particolarmente vero per ponteggi che non coprono l&#39;intera base della piastra di coltura cellulare e le cellule potrebbero cadere dal costrutto e, a causa della natura spesso statica dell&#39;esperimento, non possono mai tornare a contatto con il materiale di interiposo. Filati di fibre elettrofilate sono un buon esempio di un ponteggio che non copre la base del pozzetto (Figura 1A). In questo caso, piastre basse e vincolanti che non sono stati trattati in superficie dovrebbero essere usati per impedire alle cellule di attaccarsi alla superficie del piatto e quindi falsare i risultati di qualsiasi test basato su bene. Pozzetti sono facilmente utilizzati per la semina delle cellule su impalcature, ma non sono l&#39;unico metodo disponibile. Sistemi di coltura di cellule del Rotary, un tipo di bioreattore sviluppato dalla divisione Life Sciences della NASA alla fine del 1980, possono essere usati in modo simile alle sementi ponteggi all&#39;interno di un (3D) ambiente tridimensionale con microgravità simulata. Questo tipo di bioreattore rimane una scelta popolare con i ricercatori di tutto il mondo ed è stata incorporata in studi per la segnalazione delle cellule 2,3, cellule staminali e ingegneria dei tessuti 4,5 6,7. Ciò che rende il bioreattore rotante preferibile pozzetti è il mantenimentodi un ambiente 3D, che aiuta a prevenire le cellule differenziate da dedifferentiating, come spesso accade quando coltivate all&#39;interno di condizioni 2D tradizionali 8. Questo documento esamina diverse tecniche per la semina di cellule staminali mesenchimali umane su poli elettrofilate (ε-caprolattone) fili di fibre come fabbricato in Bosworth et al., 9 al fine di massimizzare il numero iniziale di cellule inerenti a tali impalcature entro un periodo di 4 ore. Per la cultura 2D, filati si sono svolte in modo sicuro all&#39;interno di pozzetti o poli su misura (tetrafluoroetilene) (PTFE) abbeveratoi e tenuti in condizioni statiche, o agitati a 30 giri al minuto. Per la cultura 3D, filati e le cellule si sono svolte all&#39;interno dei vasi bioreattori che ruotano a 9 giri.

<table><tbody><tr><td>Acqua distillata</td><td>Fornitura interna</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Soluzione salina tamponata</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Cellule staminali mesenchimali umane</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di coltura MSC</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Riscaldato a 37 oC prima dell'uso</td></tr><tr><td>Miscela di integratori</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Aggiungere ai terreni di coltura</td></tr><tr><td>Miscela antibiotica/antimiotica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Aggiungere ai terreni di coltura</td></tr><tr><td>Tripsina (0,05%) EDTA (0,02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Riscaldato a 37 &#176; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Fiasche per colture cellulari (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti a basso legame</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Corone cellulari a 6 pozzetti</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>Petri-dish 50 ml di profondità</td><td>Sterilin</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>trogoli in PTFE</td><td>produzione interna</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>RCCS monouso recipienti 10 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>Bioreattore del sistema di coltura cellulare rotante a 4 recipienti</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Piastra shaker</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini agitatore orbitale</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Digital Bio</td><td>DHC-F01</td><td>Centrifuga monouso C-Chip</td></tr><tr><td></td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>Centrifuga da 15 ml e 50 ml</td></tr><tr><td></td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 e 25 ml</td></tr><tr><td>Gilson pipette SLS</td><td></td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Puntali per pipette</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Micro provetta 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Set-up del test al buio</td></tr><tr><td>Piastra nera a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre fluorescente</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Realizzato ad una concentrazione dell'1,5% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Esametildisilazano (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Stub di alluminio (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Linguette di carbonio (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Gold sputter coater</td><td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione (SEM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

ottimizzare allegato di cellule staminali mesenchimali umane su poli (ε-caprolattone) elettrofilate filati

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

La ricerca di biomateriali e ingegneria dei tessuti include spesso indagini basate sulle cellule in vitro, che richiedono la conoscenza iniziale del numero di cellule di partenza. Mentre i ricercatori comunemente riferimento loro densità di semina questo non indica necessariamente il numero effettivo di cellule che hanno aderito al materiale in questione. Ciò vale in particolare per i materiali, o ponteggi, che non coprono la base di piatti e standard di coltura cellulare. Questo studio indaga l&#39;attacco iniziale di cellule staminali mesenchimali umane seminate in un numero conosciuto su poli elettrofilate (ε-caprolattone) filato dopo 4 ore di cultura. Filati elettrofilate sono svolte all&#39;interno di diversi diversi set-up, comprese le navi bioreattore rotante a 9 giri, inserti di coltura cellulare posizionati in piastre e vincolanti bassi e politetrafluoroetilene (PTFE) abbeveratoi posti all&#39;interno piastre di Petri. Gli ultimi due sono stati sottoposti a condizioni sia statiche o posizionato su una tavola oscillante (30 37 ° C, 5% CO 2, la posizione di cellule seminate era determinato mediante saggio DNA cellulare. Scaffolds sono stati rimossi dai loro contenitori e collocate in tampone di lisi. La frazione di supporto è stato rimosso e centrifugato simile - il supernatante scartato e pellet rotto con tampone di lisi. Tampone di lisi è stato aggiunto a ciascun recipiente, o ben, e raschiato per liberare eventuali cellule che possono essere presenti. Il test del DNA delle cellule determinato la percentuale di cellule presenti nel patibolo, i media e le frazioni pure. Attaccamento cellulare era bassa per tutti nelle configurazioni, con la più grande attacco (30%) per i filati ricoperti nell&#39;ambito inserti di coltura cellulare e sottoposti a scuotimento movimento. Questo studio solleva la consapevolezza per il numero effettivo di cellule inerenti alle impalcature a prescindere dal dichiarato densità di semina delle cellule.

I risultati evidenziano la posizione delle celle seguenti 4 ore post-semina per ciascun set-up sperimentale indagato. Figura 2A mostra la percentuale di cellule che sono attaccati alla superficie ponteggio durante questo periodo. Un fattore di conversione di 8,5 pg / cella è stata utilizzata per convertire il contenuto di DNA misurata in numero di cellule e determinare la percentuale di cellule 10 così. Per tutti semina set-up studiato, la percentuale di adesione cellulare è relativamente bassa, con grande adesione cellulare (30%) per i ponteggi condotte nell'ambito inserti colture cellulari e scosso al 30 rpm (Insert Shaker). Aderenza più basso (15%) è stato per ponteggi detenuti all'interno degli inserti di coltura cellulare e tenuto in condizioni statiche (Insert statiche). Un gran numero di cellule erano presenti all'interno della frazione supporto (Figura 2B), in particolare per gli inserti di coltura cellulare condotte nell'ambito piastre basse vincolanti (Insert statiche) e imbarcazioni rotanti essendo il 50% e il 51%rispettivamente. Ponteggi ricoperte all'interno delle depressioni hanno dimostrato un numero elevato di cellule presenti all'interno del supporto stesso - 48% delle cellule per Trough Shaker e il 50% per Trough statico. Microscopia elettronica a scansione ha permesso una valutazione visiva degli scaffold di cellule-teste di serie (Figura 3). Immagini rappresentative evidenziato una limitata presenza di cellule sulla superficie fibrosa, indipendentemente semina set-up. Tuttavia, un numero maggiore di cellule e agglomerati cellulari erano presenti sui ponteggi condotte nell'ambito degli inserti di coltura cellulare e scosso al 30 rpm (Insert Shaker). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg"> Figura 1. sperimentali Set-up, dove elettrofilate filato si svolge all'interno; (A) inserti colture cellulari e piatto basso e vincolante; (B) poli (tetrafluoroetilene) (PTFE) attraverso e Petri; e (C) nave bioreattore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg"> Figura 2. Posizione di celle a 4 ore post-semina su PCL elettrofilate Filati utilizzando diversi Seminatrice Set-up. (A) dimostra la percentuale di cellule che si sono collegati al patibolo PCL (media ± deviazione standard); (B) evidenzia la diffusione percentuale di posizione della cella all'interno delle tre frazioni - dei media, bene e scaffold (n = 4, i dati presentati come I valori medi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig3.jpg" files ftp_upload> Figura 3. Rappresentante elettronici a scansione Micrografie per PCL elettrofilate Filati con cellule staminali mesenchimali umane, 4 ore dopo la semina iniziale utilizzando diversi set-up. (Tutte le immagini a 1,000X ingrandimento, barra della scala = 130 micron.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un grande versione di questa figura.</a>

Questo articolo descrive una serie di configurazioni per la semina di cellule staminali mesenchimali umane su materiali, in questo caso filati elettrofilati, che non coprono la base delle piastre standard dei pozzetti di coltura al fine di massimizzare e quantificare il numero di cellule che si attaccano inizialmente rispetto alla densità di semina nota.

Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

In questa procedura, gli scaffold PCL elettrofilati vengono impostati in modi diversi per determinare una configurazione ottimale di semina cellulare. In primo luogo, gli scaffold sterili vengono posizionati nelle diverse configurazioni oggetto di indagine, inclusi inserti per colture cellulari, trogoli e recipienti rotanti per bioreattori. Una volta posizionate, un numero noto di cellule viene seminato sull'impalcatura e poi lasciato indisturbato per 20 minuti.Quindi tutti i campioni vengono accuratamente spostati in un incubatore, posizionati al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius e sottoposti a condizioni statiche o dinamiche prima di ore. Dopo questo periodo di coltura, il numero di cellule che si sono attaccate all'impalcatura viene determinato mediante un saggio del DNA per quantificare la quantità di cellule nel terreno di impalcatura e nelle frazioni dei pozzetti. In definitiva, ciò si ottiene quantificando il DNA presente sullo scaffold, sul pozzetto e nei mezzi circostanti per visualizzare l'attaccamento delle cellule agli scaffold viene utilizzata la microscopia elettronica a scansione o SEM.Abbiamo avuto l'idea di questa indagine quando sapevamo che i nostri scaffold non coprivano l'intera base della piastra del pozzetto, il che significava che c'era la possibilità che non tutte le celle sarebbero state in contatto con l'impalcatura e quindi in grado di attaccarsi. Per iniziare, impostare gli inserti per colture cellulari sotto il flusso di lamina aprendo gli inserti sterili per colture cellulari a sei pozzetti e separando gli anelli più corti con i denti dai corpi ad anelli più larghi. Quindi prendi l'anello con i denti rivolti verso l'alto e drappeggia una delle impalcature di quattro centimetri al centro dell'anello, assicurandoti che si sovrapponga su entrambi i lati.Prendi il corpo ad anello e posizionalo sopra l'anello del dente e l'impalcatura. Quindi spingere verso il basso, assicurandosi che l'impalcatura rimanga in posizione e si trovi al centro della coltura cellulare. Inserire. Posizionare l'inserto per colture cellulari con scaffold nel pozzetto di una piastra di legatura a sei pozzetti e aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura allo scaffold.Successivamente, posizionare le vasche di politetrafluoroetilene nelle singole piastre di Petri e aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura alla vasca. Usando una pinza, drappeggia una delle impalcature di tre centimetri nella mangiatoia, assicurandoti che la sua lunghezza sia parallela al bordo più lungo della mangiatoia. Per impostare il recipiente del bioreattore sotto il flusso di lamina, erogare 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato sterile o PBS attraverso la porta principale del recipiente del bioreattore.Dopo 10 minuti, rimuovere il PBS e sostituirlo con otto millilitri di terreno di coltura utilizzando una pinza. Inserire una delle impalcature da tre centimetri nell'imbarcazione attraverso la porta principale. Quindi posa fuori dalla porta principale.Dopo aver eseguito il conteggio delle cellule staminali mesenchimali umane come descritto nel protocollo di testo, aspirare il terreno dalla provetta da centrifuga lasciando il pellet cellulare e sostituirlo con il volume del terreno calcolato. Resus sospendere le cellule e il terreno per una miscelazione uniforme. Utilizzando una pipetta Gilson P 200, erogare lentamente 200 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna impalcatura facendo scorrere la punta della pipetta lungo la lunghezza dell'impalcatura e al di sotto della superficie del liquido del terreno.Lasciare indisturbato per 20 minuti, altrimenti i recipienti del bioreattore hanno erogato 200 microlitri di sospensione cellulare attraverso la porta principale. Rabboccare i restanti due millilitri di terreno di coltura dalle porte della siringa per ottenere un volume totale di 10 millilitri. Quindi, trasferire i recipienti del bioreattore nel bioreattore a recipiente rotante e impostare la rotazione.A nove giri/min, trasferire le piastre a pozzetti con gli inserti e le trogoli per colture cellulari sulla piastra di agitazione e impostarle per ruotare a 30 giri/min in un incubatore a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica al 5% o nella coltura statica. Trasferire le piastre a pozzetti con gli inserti e le mangiatoie per colture cellulari sullo scaffale di un incubatore per colture cellulari. Impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo quattro ore, rimuovere i campioni dall'incubatore e metterli sotto il flusso di lamina. Quindi, rimuovere le frazioni di terreno da tutti i campioni e metterle in provette da centrifuga etichettate separatamente. Dopo la centrifugazione per cinque minuti a 241 volte G, rimuovere il supinato prima di aggiungere tre millilitri di vortice tampone di lisi, la soluzione per rompere il pellet cellulare che gli scaffold tenevano all'interno degli inserti di coltura cellulare Innanzitutto, liberare lo scaffold tagliando lo scaffold vicino al bordo degli inserti utilizzando uno scaffold.Quindi, utilizzando una pinza, rimuovere gli scaffold e metterli in provette da centrifuga contenenti tre millilitri di tampone di lisi. Quindi aggiungere tre millilitri di tampone di lisi a ciascun recipiente dell'impalcatura e raschiare la superficie. Rimuovere il tampone di lisi e metterlo in provette da centrifuga etichettate separatamente.Agitare ogni provetta da centrifuga per circa un minuto per garantire un'agitazione sufficiente e favorire la lisi della membrana cellulare. In una piastra nera a 96 pozzetti, aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi per ogni mezzo di impalcatura della frazione del campione e, quindi, al buio, aggiungere 100 microlitri di soluzione di DNA cellulare a tutti i pozzetti contenenti tampone di lisi e mescolare. Includere delicatamente i pozzetti con tampone di lisi che non contiene DNA e soluzione di DNA cellulare per fornire un controllo negativo e positivo per la piastra a pozzetti.Utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza, misurare l'assorbanza dei pozzetti a 485 nanometri di eccitazione e 520 nanometri di emissione. Confrontare i dati con la curva standard generata dagli standard del DNA secondo le istruzioni del produttore per eseguire la fissazione SEM. Dopo quattro ore di incubazione, rimuovere tutti gli scaffold dai loro recipienti e collocarli all'interno di pozzetti separati di una nuova piastra a sei pozzetti e di un flusso di lamina.Quindi lavare le impalcature due volte con PBS su ciascuna. Aggiungere bene due millilitri di glutaraldeide all'1,5% in PBS per garantire una copertura completa all'impalcatura. Lasciare la piastra per un minimo di 30 minuti a quattro gradi Celsius per il fissaggio del cel.Rimuovere la soluzione fissativa e lavare due volte gli scaffold con PBS. Quindi trasferire gli scaffold in una nuova piastra a pozzetti per disidratarli con concentrazioni crescenti di etanolo in acqua distillata, iniziando con il 50% di etanolo seguito dal 70% e poi dal 90% per ogni concentrazione. Immergere completamente gli scaffold in soluzione e lasciarli agire per tre minuti prima di scartare la soluzione e ripetere.Una volta disidratati gli scaffold in etanolo al 100% immergendoli completamente in soluzione e lasciandoli agire per cinque minuti, scartare la soluzione e ripetere l'asciugatura chimica degli scaffold. Utilizzo di HMDS all'interno di una cappa aspirante. Immergere le impalcature nell'HMDS e lasciarle agire per cinque minuti prima di rimuovere l'HMDS dopo aver ripetuto una volta.Rimuovere l'HMDS e lasciare asciugare le impalcature. Quindi montare gli scaffold su tronchetti SEM disponibili in commercio per facilitare la visualizzazione all'interno del rivestimento SEM, i campioni con un rivestimento spotter dorato per due minuti per garantire una copertura sottile e uniforme. Infine, posizionare i campioni all'interno del SEM e visualizzare gli scaffold posizionati nella cella utilizzando un fascio di elettroni a volta di cinque chili.I risultati evidenziano la posizione delle cellule dopo quattro ore dalla semina per ogni configurazione sperimentale studiata. Questa figura mostra la percentuale di celle che si sono attaccate alla superficie dell'impalcatura durante questo periodo in cui sono state esaminate tutte le configurazioni di semina. La percentuale di attaccamento cellulare è relativamente bassa, ma la massima aderenza cellulare per gli scaffold tenuti all'interno di inserti di coltura cellulare e agitati a 30 giri/min.L'aderenza più bassa era per gli scaffold tenuti all'interno degli inserti di coltura cellulare e mantenuti in condizioni statiche. Un gran numero di cellule era presente all'interno della frazione del terreno, in particolare per la coltura cellulare. Gli inserti tenuti all'interno di piastre a basso legame al 50% e i recipienti rotanti al 51%Gli scaffold tenuti all'interno dei trogoli hanno dimostrato un numero elevato di celle presenti all'interno del supporto stesso.48% per l'agitatore e 50% per la scansione statica del trogolo. L'elettromicroscopia ha permesso una valutazione visiva degli scaffold seminati nelle cellule. Le immagini rappresentative hanno evidenziato una presenza limitata di cellule sulla superficie fibrosa, indipendentemente dall'impostazione della semina.Tuttavia, un numero maggiore di cellule e agglomerati cellulari era presente sugli scaffold tenuti all'interno degli inserti di coltura cellulare e agitati a 30 RP M.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del fatto che la semina di un numero noto di cellule non equivaleva necessariamente a quel numero di cellule che si attaccano effettivamente allo scaffold, specialmente per gli scaffold che non coprono l'intera base delle placche selvatiche. Per scaffold come questi, si raccomanda di ottimizzare prima diverse configurazioni di semina cellulare al fine di massimizzare l'adesione iniziale delle cellule allo scaffold.

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Il processo di electrospinning polimeri per l'ingegneria tissutale e colture cellulari è affrontato in questo articolo. In particolare, il electrospinning di macromers fotoreattivo con capacità di elaborazione aggiuntive di photopatterning e multi-polimero electrospinning è descritto.

Electrospinning Ponteggi polimeri fibrosi per l&#39;ingegneria tissutale e colture cellulari

Lo scopo di questo studio era quello di imitare il nativo tre architettura a strati della parete arteriosa. Per fare questo, electrospinning è stato impiegato con l'uso di un 3-1 (input-output) ugello e miscele di policaprolattone, elastina e collagene.

Tri-strato Electrospinning di Mimic nativa Architettura arteriosa utilizzando Policaprolactone, elastina e collagene: uno studio preliminare

Allineati fibre elettrofilate diretta la crescita dei neuroni in vitro e sono una componente potenziale di ponteggi rigenerazione nervosa. Abbiamo descritto una procedura per la preparazione di substrati di fibre elettrofilate e il siero senza cultura di primaria ratto E15 sensoriali (DRG) e neuroni motori. Visualizzazione dei neuroni mediante immunocitochimica è anche incluso.

La cultura del motore principale e neuroni sensoriali in Media definiti in elettrofilate Poli-L-lactide Ponteggi nanofibre

Electrospinning tecniche possono creare una varietà di impalcature nanofibrous per l'ingegneria tissutale o altre applicazioni. Descriviamo qui una procedura per ottimizzare i parametri della soluzione elettrofilatura e gli apparecchi di ottenere fibre con la morfologia e l'allineamento desiderato. Problemi comuni e le tecniche di risoluzione dei problemi sono anche presentato.

Fondamenti electrospinning: Soluzione Ottimizzazione e parametri Apparatus

Ponteggi elettrofilate possono essere trattati post-produzione per applicazioni di ingegneria tissutale. Qui si descrivono i metodi per la filatura ponteggi complessi (da spinning consecutivi), per rendere più spessi (da ponteggi multi-layering che utilizza il calore o vapore ricottura), per ottenere la sterilità (produzione asettica o di post produzione la sterilizzazione) e per il raggiungimento di adeguate proprietà biomeccaniche.

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l&#39;ingegneria tissutale

È stata riportata la sintesi e la fabbricazione di fibre lunghe elettrofilate coprono un'area più grande deposito tramite un collettore di nuova concezione da un polimero biodegradabile romanzo chiamato poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD). Le fibre sono in grado di sostenere la crescita di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti di topo.

Elettrofilate Fibrosa Ponteggi di Poli (glicerolo-dodecanedioate) per l&#39;ingegneria neurale tessuti da cellule staminali embrionali di topo

Qui, vi presentiamo un protocollo per fabbricare scaffold elettrofilate nanofibre con organizzazione sfumati di fibre e di esplorare le loro applicazioni nella regolazione della morfologia delle cellule / orientamento. Gradienti per quanto riguarda le proprietà fisiche e chimiche dei ponteggi nanofibre offrono un'ampia varietà di applicazioni in campo biomedico.

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

I materiali polimerici superidrofobici bidimensionali e tridimensionali sono preparati mediante elettrofilatura o elettrospruzzatura di polimeri biodegradabili miscelati con un polimero a bassa energia superficiale di composizione simile.

Realizzazione superidrofobiche Materiali Polimerici per applicazioni biomediche

Questo protocollo serve come una guida di riferimento completa per fabbricare impalcature tramite elettrofilatura con il polimero si scioglie in una modalità di scrittura diretta. Abbiamo sistematicamente delineare il processo e definire le impostazioni di parametro appropriato per la realizzazione di architetture di impalcatura mirati.

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

Questo manoscritto descrive la procedura per fabbricare e caratterizzare fibre elettrofilate per volta Griffithsin poli (acido lattico-co-glicolico) che illustrano le attività di adesivo ed antivirale potente contro l'infezione di tipo 1 del virus dell'immunodeficienza umana in vitro. Metodi utilizzati per sintetizzare, superficie-modificare e caratterizzare la morfologia risultante, coniugazione, e desorbimento di Griffithsin dalle fibre modificate in superficie sono descritti.

Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse

Scopri come ottimizzare l'adesione di cellule staminali mesenchimali umane su filati elettrofilati di PCL. Questo metodo confronta condizioni statiche e dinamiche per massimizzare l'attacco cellulare iniziale.

Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

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