Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare e modificare la superficie dell'acido polilattico, dell'acido co-glicolico, delle fibre elettrofilate, con quantità variabili della proteina antivirale Griffithsin. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della somministrazione di farmaci, come ad esempio come formulare e caratterizzare nuovi veicoli di somministrazione in grado di prevenire le infezioni virali sessualmente trasmissibili, come l'HIV-1. Il vantaggio principale della tecnica è che l'attività antivirale di Griffithsin è massimizzata utilizzando fibre polimeriche-elettrofilate come scaffold stazionario per Griffithsin altamente localizzato sulla superficie della fibra.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di altre infezioni virali e batteriche, a causa del potente potenziale profilattico e terapeutico di Griffithsin contro una varietà di tipi di infezione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla prevenzione dell'infezione da HIV-1, può essere applicato anche ad altri sistemi, come altre infezioni virali o batteriche in cui Griffithsin ha dimostrato potenza. Per iniziare questa procedura, pesare 720 milligrammi di PLGA 50/50 in una fiala di scintillazione da 10 millilitri.

Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, aggiungere 3,0 millilitri di HFIP. Coprite la fiala con pellicola di plastica. Quindi, misura e registra la massa vile.

Incubare la sospensione polimerica a 37 gradi Celsius durante la notte per garantire la completa dissoluzione del polimero. Successivamente, preparare l'apparecchio di elettrofilatura come indicato nel protocollo di testo. Utilizzare una siringa da tre millilitri per aspirare la soluzione polimerica.

Quindi, collegare una punta dell'ago smussata da 18 gauge da 0,5 pollici alla siringa. Erogare la soluzione in eccesso per rimuovere lo spazio vuoto della testa nell'ago. Posizionare la siringa su una pompa a siringa e impostare la portata dello strumento su 2,0 millilitri all'ora.

Collegare la fonte di alimentazione all'ago della siringa. Elettrocentrifugare la soluzione polimerica utilizzando una tensione positiva di 27 kilovolt. Dopo che l'intera soluzione è stata elettrofilata, spegnere la fonte di alimentazione.

Lasciare girare la mandrina per altri 30 minuti, per far evaporare completamente il solvente. Quindi, spegnere il collettore a mandrino rotante. Usando una lama di rasoio, stacca delicatamente la fibra dalla mandria.

Raccogliere la fibra di PLGA elettrofilata in una capsula di Petri etichettata. Mettere il piatto in un essiccatore per una notte per rimuovere eventuali residui di solvente. Per iniziare, prepara le soluzioni PBS e MES come descritto nel protocollo di testo.

Quindi, rimuovere l'EDC e l'NHS dal congelatore. Lasciateli riposare per equilibrarli a temperatura ambiente. Successivamente, pesare quattro milligrammi di EDC in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Pesare sei milligrammi di NHS in una diversa provetta per microcentrifuga. Aggiungere un millilitro di tampone MES a ciascuna provetta. Agitare energicamente entrambe le provette per assicurarsi che i reagenti siano completamente disciolti.

Quindi, pesare 70 milligrammi di idrossilammina in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di PBS e vortice. Estrarre una quantità appropriata di fibra PLGA in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri.

Aggiungere otto millilitri di tampone MES alla fibra. Quindi, aggiungi un millilitro di entrambe le soluzioni EDC e NHS. Utilizzare una pellicola di plastica per sigillare la provetta da centrifuga conica da 15 millilitri.

Posizionare il tubo su un rotatore per capovolgere delicatamente la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 14 microlitri di beta-mercaptoetanolo per estinguere la reazione. Capovolgere il tubo più volte per garantire una miscelazione completa.

Scartare il surnatante e risciacquare la fibra PLGA due volte utilizzando 10 millilitri di PBS per ogni lavaggio. Aggiungere una quantità appropriata di soluzione madre GRFT alla provetta, come indicato nel protocollo di testo. Quindi, aggiungi abbastanza PBS per portare il volume finale a otto millilitri.

Chiudere e capovolgere il tubo per garantire una miscelazione accurata. Sigillare il tubo con pellicola di plastica. Posizionare il tubo sul rotatore per capovolgere delicatamente la soluzione per due ore.

Successivamente, spegnere la reazione aggiungendo due millilitri della soluzione di idrossilammina preparata e agitare per 30 secondi. Scartare il surnatante. Sciacquare due volte la fibra PLGA modificata in superficie, utilizzando 10 millilitri di acqua ultra pura e agitando a vortice per ogni lavaggio.

Quindi, trasferisci la fibra lavata in una capsula di Petri. Posizionare la capsula di Petri all'interno di un essiccatore, fino a quando la fibra non è completamente asciutta. Quindi conservare la capsula di Petri a quattro gradi Celsius.

Per iniziare, prepara tre provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Metti due milligrammi di fibra in ciascuno. Quindi, aggiungere un millilitro di DMSO a ciascun tubo.

Agitare per un minuto a temperatura ambiente per sciogliere completamente la fibra. Successivamente, diluire un'aliquota da 10 microlitri almeno 100 volte, in tampone TE. Conservare a meno 20 gradi Celsius, fino al caricamento della caratterizzazione con Eliza.

Pesare tra 5 e 10 milligrammi di fibra modificata in superficie e trasferirla in una provetta da microcentrifuga. Registrare la massa della fibra posizionata in ciascun tubo. Quindi, aggiungere un millilitro di una soluzione che imita l'ambiente fisiologico di ciascun campione.

Incubare i campioni su un agitatore rotante a 200 giri/min e 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, rimuovere circa un millilitro della soluzione contenente il GRFT desorbito e aliquotarlo in provette a grappolo. Conservare a meno 20 gradi Celsius fino al momento di eseguire la quantificazione delle proteine.

Quindi trasferire il campione in una nuova provetta per microcentrifuga. Aggiungere un millilitro di soluzione tampone fresca e incubare fino al punto temporale successivo, come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, vengono esaminate le condizioni per la fabbricazione di fibre elettrofilate PLGA.

L'analisi SEM di fibre GRFT bianche, 0,05 nanomole, 0,5 nanomoli e 5 nanomoli indica che la modifica GRFT non ha alcun effetto sulla morfologia delle fibre. Tutte le formazioni hanno diametri medi simili, circa 1,9 micron, dimostrando la coerenza del processo di fabbricazione modificato tra i lotti. Viene quindi determinata la quantità di GRFT coniugata nelle fibre elettrofilate.

La modifica a 5 nanomoli contiene 373 nanogrammi di GRFT, mentre le modifiche a 0,5 e 0,05 ne contengono rispettivamente 165 e 42. Ciò dimostra che le fibre coniugate con una maggiore densità teorica di modifica della superficie producono più GRFT coniugato alla fibra. Tuttavia, si può vedere una correlazione inversa nell'efficienza di coniugazione risultante.

Successivamente, viene valutata la quantità di GRFT coniugata covalentemente alla fibra. Entro le prime quattro ore, 113 nanogrammi, 25 nanogrammi e 10 nanogrammi di GRFT per milligrammo di fibra elettrofilata sono stati rilevati rispettivamente nelle concentrazioni di modifica teorica di 5 nanomoli, 0,5 nanomoli e 0,05 nanomole. Dopo quattro ore, viene rilevato un GRFT trascurabile nell'eluito di rilascio per tutte e tre le formulazioni.

Questi dati indicano che la maggior parte del GRFT è legata covalentemente alle fibre elettrofilate e che il GRFT assorbito in superficie viene rilasciato entro le prime quattro ore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro giorni. L'elettrofilatura dell'impalcatura in fibra polimerica, richiede due giorni per preparare la soluzione polimerica e per l'elettrofilatura.

Mentre la modifica della superficie, la successiva essiccazione e la caratterizzazione delle fibre hanno richiesto almeno due giorni aggiuntivi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere i rapporti corretti dei reagenti per garantire una modifica ottimale. Inoltre, è anche importante verificare che i parametri di electospinning siano corretti per garantire un'adeguata morfologia delle fibre.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della somministrazione di farmaci per fabbricare fibre elettrofilate, che non solo incapsulano agenti antivirali all'interno della fibra, ma hanno la capacità di coniugare agenti attivi attraverso la superficie della fibra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elettrofilare la fibra polimerica, eseguire la modifica della superficie della fibra con la proteina antivirale Griffithsin e Griffithsin qualitativa coniugata alla fibra. Non dimenticare che lavorare con reagenti come HFIP, beta-mercaptoetanolo, EDC e NHS può essere estremamente pericoloso.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come la corretta applicazione dei DPI e l'uso di cappe chimiche per la combustione di sostanze chimiche.