Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di marcare i neuroni sensoriali olfattivi in vivo per visualizzare la morfologia e lo sviluppo assonale. Ciò si ottiene porando prima il destrano accoppiato al fluoro quattro in singoli neuroni sensoriali olfattivi. Il secondo passo consiste nell'attendere 24 ore per consentire al colorante di diffondersi nei processi assonali dei neuroni sensoriali.

Successivamente, un girino viene anestetizzato e viene acquisita una pila di immagini tridimensionali del bulbo olfattivo utilizzando la microscopia multifotone. Il passo finale consiste nell'esaminare ripetutamente il neurone marcato nello stesso animale dopo intervalli di tempo specificati. In definitiva, la ricostruzione della morfologia cellulare consente la visualizzazione dei cambiamenti nella morfologia assonale.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come gli assoni crescono verso le regioni bersaglio del proencefalo e come si formano le sinapsi. Prima dell'esperimento. Assicurarsi che l'impianto di elettroporazione sia costituito da uno stereomicroscopio con un'ampia distanza di lavoro e sia dotato di illuminazione fluorescente e set di filtri per il colorante.

Utilizzato per l'elettroporazione, utilizza un'elettroporazione a cella singola dedicata o un generatore di impulsi quadrati generico collegato a un oscilloscopio. Collegare le uscite di elettroporazione a un portapipette e a un elettrodo da bagno. Assicurarsi che sia il portapipetta che l'elettrodo da bagno contengano fili d'argento rivestiti con un sottile strato di cloruro d'argento.

Quindi, montare il portapipetta su un micromanipolatore per consentire un posizionamento preciso. Successivamente, fabbricare le micro pipette per l'elettroporazione con capillari in vetro silicato bo con filamento interno. Impostare i parametri della micro pipetta polare per produrre un gambo più lungo e una micropipetta con apertura del puntale più piccola con un'elevata resistenza della pipetta per l'elettroporazione di singole cellule.

Quindi misurare la resistenza della pipetta direttamente con l'apposita cella singola elettroporosa. In questa procedura, sciogliere il destrano accoppiato al fluoro quattro nel ringer della rana a una concentrazione di tre millimolari. Dividere questa soluzione madre in piccole aliquote e conservare quella per un uso futuro nel congelatore.

Quindi, riempire nuovamente la micropipetta con da uno a cinque microlitri di soluzione di destrano. Azionare con cautela la micropipetta per rimuovere le bolle d'aria residue dal puntale della pipetta. Quindi montare la micropipetta nel portapipetta.

Assicurarsi che il filo d'argento all'interno della pipetta sia a contatto con la soluzione colorante. Ora, metti un piccolo pezzo di tessuto in una capsula di Petri e coprilo con una piccola quantità di acqua contenente lo 0,02% di trica. Successivamente, anestetizzare un girino pre-metamorfico in acqua contenente lo 0,02% di trica.

Confermare la corretta anestesia toccandola e assicurandosi che non risponda. Quindi trasferire con cura il girino nella piastra di Petri ricoperta di tessuto. Assicurarsi che l'elettrodo sia a contatto con il tessuto umido e posizionare la punta della micropipetta vicino all'organo olfattivo del girino utilizzando un micro manipolatore.

Successivamente, penetrare nella pelle che copre l'organo olfattivo. Con la punta della pipetta, far avanzare con cautela la punta nello strato di neuroni sensoriali situato centralmente dell'epitelio olfattivo principale o dell'epitelio nasale MRO. Ora innesca gli impulsi di tensione quadra positiva per trasferire il colorante nei neuroni sensoriali applicando un singolo polo di tensione o treni di impulsi multipli.

Quindi visualizza l'estrusione e l'elettroporazione del colorante con successo utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza. Il colorante si diffonde rapidamente nel corpo cellulare e nei dendriti dopo un'elettroporazione riuscita. Dopo aver ripetuto le procedure per il secondo organo olfattivo del girino, trasferire il girino in un becher riempito di acqua fresca per il recupero e lasciare che il colorante elettroporato si diffonda ai neuroni sensoriali e al bulbo olfattivo.

Almeno 24 ore dopo l'elettroporazione, anestetizzare il girino in acqua contenente lo 0,02% di trica. Quindi, trasferire con cura il girino in una camera di imaging. Ritaglia un piccolo rettangolo da una striscia di param.

Quindi copri il girino con il param, lasciando il cephalon anteriore della coda attraverso la finestra ritagliata. Fissare il param con gli aghi sul piatto senza ferire il girino e assicurarsi che il girino sia immerso in acqua sufficiente contenente lo 0,02% di Trica. Successivamente montare la camera di imaging sul tavolino di un microscopio multifotone verticale o di un microscopio confocale.

Acquisisci una pila tridimensionale di immagini del bulbo olfattivo e assicurati che la procedura di imaging non superi i 10-15 minuti. Dopodiché, riporta il girino all'acqua normale in un serbatoio separato e impediscigli di esporlo alla luce. In questa immagine, quattro filamenti di ponte accoppiati a diversi fluoro quattro sono stati elettroporati in quattro posizioni distanti dell'organo olfattivo, lateralmente indicato dal verde, intermedio indicato dal giallo mediale indicato dal rosso e l'organo nasale del vomere indicato dall'arancione.

Ciò consente la visualizzazione del bulbo olfattivo accessorio e dei tre principali campi di proiezione del bulbo olfattivo principale. Questa immagine mostra ricostruzioni tridimensionali di diversi modelli di crescita assonale di singoli neuroni sensoriali olfattivi sovrapposti alla struttura del bulbo olfattivo, e qui c'è un esempio di un singolo assone sensoriale olfattivo che si proietta nel bulbo olfattivo e forma un'arborizzazione trapuntata in glomerulare sferico. Come si vede qui in Opus Levu, questi assoni si biforcano regolarmente prima di connettersi a uno, due o più gmer.

Questo è un esempio rappresentativo di un singolo neurone sensoriale olfattivo ripetutamente studiato mediante imaging time lapse in vivo che mostra continui cambiamenti nella morfologia assonale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare i neuroni sensoriali olfattivi tramite elettroporazione e come monitorare il loro sviluppo utilizzando l'imaging TimeLapse in vivo.