Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva

L'obiettivo generale di questo metodo di colorazione immunoistochimica è quello di visualizzare l'espressione combinata di molecole di smistamento degli assoni ai terminali assonici dei neuroni sensoriali olfattivi. Questo metodo può aiutare a caratterizzare i processi chiave nel campo dello sviluppo olfattivo, come la guida degli assoni, la formazione delle sinapsi e la rigenerazione dei neuroni sensoriali olfattivi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli scienziati di confrontare e analizzare i modelli di espressione delle molecole di selezione degli assoni nel bulbo olfattivo senza sostenere variazioni tra le sezioni.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fase di inclusione è difficile da imparare, perché la posizione e l'angolo del campione di tessuti olfattivi nello stampo sono difficili da descrivere a parole. Inizia con le teste di topi di una o due settimane di età che sono state fissate mediante perfusione intracardiaca di paraformaldeide al 4%. Inserisci una lama a forbice nello spazio tra i denti superiore e inferiore e taglia orizzontalmente per rimuovere l'osso mascellare inferiore.

Quindi tagliare il tessuto in eccesso con pinze e forbici, per lasciare il tessuto olfattivo, compreso il bulbo olfattivo e l'epitelio olfattivo. Immergere il tessuto olfattivo nel PBS per rimuovere l'aria nella cavità nasale, quindi eseguire un taglio verticale per rimuovere la parte posteriore del cervello e posizionare il tessuto olfattivo sul fondo di uno stampo da inclusione con l'estremità tagliata rivolta verso il basso. Riempire lo stampo con il composto per la temperatura di taglio ottimale, quindi immergerlo in azoto liquido.

Dopo che il tessuto e l'OCT sono completamente congelati, equilibrare il tessuto nel criostato a 20 gradi Celsius per un'ora. Ora crea sezioni parasaggitali seriali del bulbo olfattivo con il criostato e raccoglile attaccandole a vetrini rivestiti di MAS. Dopo l'incollaggio, asciugare immediatamente le diapositive con un asciugacapelli.

Iniziare l'immunocolorazione lavando i vetrini asciutti con PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Bloccare i siti di legame aspecifici incubando i vetrini per un'ora con una soluzione bloccante al 5% a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 400 microlitri di un cocktail di anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante all'1% a ciascun vetrino.

Incubare i vetrini per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, scartare la soluzione di anticorpi primari e lavare i vetrini con PBST tre volte per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 400 microlitri di un cocktail di anticorpi secondari e PBS a ciascun vetrino.

Proteggere dalla luce e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione e lavare nuovamente i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno con PBS a temperatura ambiente. Infine, montare i vetrini coprioggetto sulle diapositive applicando due gocce di mezzo di montaggio su ciascuna diapositiva, posizionando il vetrino coprioggetto e rimuovendo le bolle d'aria.

Ottenere immagini fluorescenti con il microscopio a fluorescenza utilizzando il filtro appropriato per ogni fluoroforo. Regolare il tempo di esposizione per ottenere segnali fluorescenti dell'immagine senza saturazione. Definire la struttura glomerulare mediante segnali immunofluorescenti di GLUT2.

Utilizzare l'immagine J per misurare l'intensità di colorazione delle molecole di smistamento degli assoni all'interno dei glomeruli. Questa immagine mostra una sezione del bulbo olfattivo parasaggitale di un topo di due settimane immunocolorato con anticorpi contro VGLUT2, Kirrel2 mostrato in rosso, Semaforina 7A mostrato in verde e OLPC in blu. L'immagine unita dimostra che le molecole di smistamento degli assoni coinvolte nella segregazione glomerulare sono espresse in un modello a mosaico indipendente dalla posizione.

Ogni glomerulo è definito da segnali fluorescenti del marcatore presinaptico VGLUT2. Le strutture glomerulari sono circondate da linee tratteggiate. Le intensità del segnale delle molecole di smistamento degli assoni sono state misurate in ciascun glomerulo.

Come si vede qui, le molecole di smistamento degli assoni sono espresse in modo differenziale in ciascun glomerulo. Ad esempio, il glomerulo 3 ha alti livelli di OLPC, livelli intermedi di semaforina 7A e livelli più bassi di Kirrel2, e questa differenza può essere quantificata misurando l'intensità della colorazione. Mentre il glomerulo 4 ha alti livelli di OLPC e livelli più bassi di Kirrel2 e Semaforina 7A.

Anche in questo caso, questa differenza può essere quantificata misurando l'intensità della colorazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di omettere la post-fissazione con PFA e il trattamento con soluzione di saccarosio, che sono normalmente raccomandati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come posizionare più glomeruli sulla sezione del bulbo olfattivo singolo e di come eseguire un'immunocolorazione di alta qualità con più anticorpi, che possono essere applicati ad altre aree del cervello.

Non dimenticare di sperare, questo metodo ti aiuterà ad avere successo nei tuoi esperimenti futuri.