Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva
5 giugno 2017
I neuroni sensoriali olfattivi esprimono un'ampia varietà di molecole di selezione dell'assone per stabilire una corretta circuiteria neurale. Questo protocollo descrive un metodo di colorazione immunohistochemical per visualizzare le espressioni combinatorie delle molecole di selezione dell'assone all'estensione degli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi.
L'obiettivo generale di questo metodo di colorazione immunoistochimica è quello di visualizzare l'espressione combinata di molecole di smistamento degli assoni ai terminali assonici dei neuroni sensoriali olfattivi. Questo metodo può aiutare a caratterizzare i processi chiave nel campo dello sviluppo olfattivo, come la guida degli assoni, la formazione delle sinapsi e la rigenerazione dei neuroni sensoriali olfattivi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli scienziati di confrontare e analizzare i modelli di espressione delle molecole di selezione degli assoni nel bulbo olfattivo senza sostenere variazioni tra le sezioni.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fase di inclusione è difficile da imparare, perché la posizione e l'angolo del campione di tessuti olfattivi nello stampo sono difficili da descrivere a parole. Inizia con le teste di topi di una o due settimane di età che sono state fissate mediante perfusione intracardiaca di paraformaldeide al 4%. Inserisci una lama a forbice nello spazio tra i denti superiore e inferiore e taglia orizzontalmente per rimuovere l'osso mascellare inferiore.
Quindi tagliare il tessuto in eccesso con pinze e forbici, per lasciare il tessuto olfattivo, compreso il bulbo olfattivo e l'epitelio olfattivo. Immergere il tessuto olfattivo nel PBS per rimuovere l'aria nella cavità nasale, quindi eseguire un taglio verticale per rimuovere la parte posteriore del cervello e posizionare il tessuto olfattivo sul fondo di uno stampo da inclusione con l'estremità tagliata rivolta verso il basso. Riempire lo stampo con il composto per la temperatura di taglio ottimale, quindi immergerlo in azoto liquido.
Dopo che il tessuto e l'OCT sono completamente congelati, equilibrare il tessuto nel criostato a 20 gradi Celsius per un'ora. Ora crea sezioni parasaggitali seriali del bulbo olfattivo con il criostato e raccoglile attaccandole a vetrini rivestiti di MAS. Dopo l'incollaggio, asciugare immediatamente le diapositive con un asciugacapelli.
Iniziare l'immunocolorazione lavando i vetrini asciutti con PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Bloccare i siti di legame aspecifici incubando i vetrini per un'ora con una soluzione bloccante al 5% a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 400 microlitri di un cocktail di anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante all'1% a ciascun vetrino.
Incubare i vetrini per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, scartare la soluzione di anticorpi primari e lavare i vetrini con PBST tre volte per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 400 microlitri di un cocktail di anticorpi secondari e PBS a ciascun vetrino.
Proteggere dalla luce e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione e lavare nuovamente i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno con PBS a temperatura ambiente. Infine, montare i vetrini coprioggetto sulle diapositive applicando due gocce di mezzo di montaggio su ciascuna diapositiva, posizionando il vetrino coprioggetto e rimuovendo le bolle d'aria.
Ottenere immagini fluorescenti con il microscopio a fluorescenza utilizzando il filtro appropriato per ogni fluoroforo. Regolare il tempo di esposizione per ottenere segnali fluorescenti dell'immagine senza saturazione. Definire la struttura glomerulare mediante segnali immunofluorescenti di GLUT2.
Utilizzare l'immagine J per misurare l'intensità di colorazione delle molecole di smistamento degli assoni all'interno dei glomeruli. Questa immagine mostra una sezione del bulbo olfattivo parasaggitale di un topo di due settimane immunocolorato con anticorpi contro VGLUT2, Kirrel2 mostrato in rosso, Semaforina 7A mostrato in verde e OLPC in blu. L'immagine unita dimostra che le molecole di smistamento degli assoni coinvolte nella segregazione glomerulare sono espresse in un modello a mosaico indipendente dalla posizione.
Ogni glomerulo è definito da segnali fluorescenti del marcatore presinaptico VGLUT2. Le strutture glomerulari sono circondate da linee tratteggiate. Le intensità del segnale delle molecole di smistamento degli assoni sono state misurate in ciascun glomerulo.
Come si vede qui, le molecole di smistamento degli assoni sono espresse in modo differenziale in ciascun glomerulo. Ad esempio, il glomerulo 3 ha alti livelli di OLPC, livelli intermedi di semaforina 7A e livelli più bassi di Kirrel2, e questa differenza può essere quantificata misurando l'intensità della colorazione. Mentre il glomerulo 4 ha alti livelli di OLPC e livelli più bassi di Kirrel2 e Semaforina 7A.
Anche in questo caso, questa differenza può essere quantificata misurando l'intensità della colorazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di omettere la post-fissazione con PFA e il trattamento con soluzione di saccarosio, che sono normalmente raccomandati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come posizionare più glomeruli sulla sezione del bulbo olfattivo singolo e di come eseguire un'immunocolorazione di alta qualità con più anticorpi, che possono essere applicati ad altre aree del cervello.
Non dimenticare di sperare, questo metodo ti aiuterà ad avere successo nei tuoi esperimenti futuri.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo di colorazione immunohistochimica per visualizzare l'espressione di molecole di ordinamento degli assoni alle terminazioni assonali dei neuroni sensoriali olfattivi. Questa tecnica è fondamentale per comprendere i processi di sviluppo olfattivo, come il guidaggio degli assoni e la formazione delle sinapsi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Sviluppo olfattivo
- Immunoeistochemica
Sfondo
- I neuroni sensoriali olfattivi svolgono un ruolo fondamentale nel senso dell'olfatto.
- Le molecole di ordinamento degli assoni sono essenziali per stabilire una corretta circuitazione neuronale.
- Comprendere i loro modelli di espressione può fornire informazioni sulle funzioni del sistema olfattivo.
- La visualizzazione di queste espressioni può agevolare lo studio dei processi di rigenerazione nei neuroni sensoriali olfattivi.
Scopo dello studio
- Per visualizzare l'espressione combinata delle molecole di ordinamento degli assoni.
- Per caratterizzare i processi chiave nello sviluppo olfattivo.
- Per facilitare il confronto dei pattern di espressione nel bulbo olfattivo.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di colorazione immunohistochimica.
- Utilizzo di teste di topo di età compresa tra una e due settimane.
- Perfusione intracardiaca con paraformaldeide al 4% per la fissazione.
- Inclusione e sezionamento dei campioni di tessuto olfattivo.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita delle espressioni delle molecole di ordinamento degli assoni.
- Dimostrata la capacità di analizzare i modelli di espressione senza variazioni tra sezioni.
- Fornito un metodo chiaro per l'inclusione dei tessuti olfattivi.
- Evidenziata l'importanza delle dimostrazioni visive per l'apprendimento della tecnica.
Conclusioni
- Il metodo immunohistochimico è efficace per lo studio dei neuroni sensoriali olfattivi.
- Comprendere le molecole coinvolte nel sorting degli assoni può migliorare la conoscenza dello sviluppo del sistema olfattivo.
- Questa tecnica può rappresentare uno strumento prezioso per future ricerche sulla rigenerazione olfattiva.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente un'analisi molecolare precisa delle molecole di ordinamento degli assoni nel bulbo olfattivo, supportando la validazione degli obiettivi nella ricerca sullo sviluppo neurologico. Permettendo il confronto quantitativo dei modelli di espressione proteica tra i glomeruli senza variabilità tra sezioni, aumenta l'affidabilità predittiva negli studi meccanicistici sulla formazione dei circuiti neurali. L'approccio fornisce una piattaforma scalabile e riproducibile per ridurre i rischi associati alle ipotesi riguardanti l'orientamento degli assoni e la specificità sinaptica nei percorsi di scoperta preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei codici di identità molecolare alle terminazioni assonali per chiarire i meccanismi di interazione con le cellule bersaglio nello sviluppo dei neuroni sensoriali olfattivi.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio correlando l'espressione delle molecole coinvolte nel sorting assonale con i modelli di organizzazione glomerulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo protocolli standardizzati di immunomarcatura per la rilevazione multiplex di proteine.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso una definizione costante dei glomeruli utilizzando VGLUT2 come marcatore presinaptico.
- Valore strategico: Evidenzia la prontezza per lo screening mediante misurazioni quantitative dell'intensità che consentono un confronto affidabile dell'espressione molecolare tra diverse condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discute la rilevanza per le malattie collegando i codici delle molecole di ordinamento degli assoni ai processi di formazione dei circuiti neurali, applicabili ai modelli di neurodegenerazione.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo l'analisi longitudinale dei modelli di rigenerazione assonale e di reinnervazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo una risoluzione molecolare dei meccanismi di guidaggio degli assoni, fondamentali per lo sviluppo di neuroterapie.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti il test di ipotesi sulla guida assonica specifica per recettore olfattivo, attraverso la visualizzazione di codici molecolari combinatori alle terminazioni assoniche.
- Screening: Descrive la preparazione del saggio mediante raccolta standardizzata di sezioni e immunomarcatura, che riduce al minimo le variazioni tecniche tra i campioni.
- Analisi: Mette in evidenza letture quantitative ottenute da misurazioni dell'intensità basate su ImageJ, che permettono il confronto statistico dell'espressione delle molecole di ordinamento assonico tra diversi glomeruli.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica, consentendo l'analisi dei processi di rigenerazione olfattiva rilevanti per modelli di lesione.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per il profilo multiplex di proteine in altre regioni cerebrali oltre al sistema olfattivo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile della validazione degli obiettivi mediante la visualizzazione diretta dei determinanti molecolari della segregazione assonale.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità ottenute attraverso protocolli costanti di inclusione e sezionamento dei tessuti.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei modelli di percorsi neurali.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio mediante letture quantitative, simili a biomarcatori, dei modelli di co-espressione delle molecole coinvolte nel sorting degli assoni.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in immunohistochemia, criosezionamento e microscopia fluorescente.
- Esigenze di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi criostato, microscopio a fluorescenza e software per l'analisi delle immagini.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi per la validazione degli anticorpi e la coerenza dei protocolli di colorazione.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, in particolare per tessuti con proprietà di inclusione differenti.
- I limiti pratici includono la difficoltà tecnica nell'orientamento del tessuto nei mold di inclusione, che richiede un addestramento pratico per essere padroneggiata.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
