Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell'isolamento individuale dopamina neuroni e l'intera area ventrale tegmentale
6 febbraio 2015
L'isolamento dei singoli neuroni dopaminergici o l'area tegmentale ventrale con immunoistochimica diretta o indiretta è dimostrata tramite microdissezione laser. Parametri per isolamento di tessuto da un vetrino utilizzando un laser a infrarossi e da diapositive membrana utilizzando la combinazione di un laser infrarosso ed ultravioletto sono discussi.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare neuroni dopaminergici da sezioni di tessuto su vetrini. Questo viene ottenuto prima sezionando il tessuto del mesencefalo ventrale congelato su vetrini appositi o su vetrini con membrana a penna. Successivamente, i neuroni dopaminergici vengono marcati mediante un'immunohistochimica fluorescente rapida.
Quindi il tessuto viene disidratato e caricato nel microscopio per la cattura laser. Successivamente, i neuroni dopaminergici marcati vengono fissati al tappo LCM mediante un laser a infrarossi e l'RNA o la molecola di interesse viene isolata. I risultati dimostrano che è possibile ottenere RNA in quantità e qualità sufficienti per analisi quantitative mediante PCR utilizzando la microscopia a cattura laser.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la dissezione macroscopica o i micro-prelievi, è che consente l'isolamento di popolazioni cellulari singole o di regioni cerebrali molto discrete. Per prepararsi all'isolamento dell'RNA, immergere sia vetrini da preparazione seline che vetrini in polietilene metilato o con membrana di vetro in soluzione disinfettante, quindi lavarli tre volte con acqua priva di RNAsi, disidratare i vetrini mediante una serie progressiva di etanolo privo di RNAsi ed essiccarli sotto vuoto per 30 minuti. Con un criostato, tagliare sezioni di tessuto di 10 micron di spessore e montarle su vetrini privi di RNAsi, mantenendo i campioni congelati durante il taglio per preservare la qualità dell'RNA.
Successivamente, eseguire l'immunohistochimica. Utilizzare una penna idrofoba per delineare il tessuto e lasciarlo asciugare, quindi fissare in una soluzione di acetone e metanolo in rapporto uno a uno. Fissare il tessuto a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver rimosso il tessuto dal congelatore, coprire le sezioni con 100-200 microlitri di anticorpo anti-tirosina idrossilasi in PBS e 1% Triton per 10 minuti.
Quindi utilizzare PBS con il 1% di Triton per risciacquare i vetrini prima di ricoprire le sezioni con 100-200 microlitri di anticorpo secondario caprino anti-coniglio IgG marcato con Alexa Fluor 488, incubare per cinque minuti e quindi risciacquare i vetrini con PBS due volte. Successivamente, disidratare i campioni mediante una serie crescente di alcol etilico privo di RNasi per 30 secondi ciascuno, come dimostrato precedentemente in questo video. Incubare nello xilene per un minuto e un secondo, quindi lavare per cinque minuti.
Rimuovere le slide immediatamente prima dell'uso per la LCM e lasciarle asciugare all'aria. Dopo aver caricato i cappucci per LCM e le slide e aver configurato il sistema LCM secondo il protocollo descritto, regolare e mirare il laser a infrarossi per la cattura, impostandone l'intensità. Posizionare il cappuccio in una zona della slide lontana dal tessuto, utilizzando la barra degli strumenti del laser di cattura.
Selezionare "abilita", regolare l'impulso di potenza e il numero di colpi del laser. Sparare il laser a infrarossi quando il cappuccio si trova sopra una porzione della lamellina priva di tessuto, e verificare se il laser scioglie adeguatamente la membrana del cappuccio LCM. Dopo aver regolato l'intensità del laser a infrarossi, fare clic con il tasto destro e selezionare "cattura laser qui" per puntare il laser ed eseguire la LCM su singoli neuroni dopaminergici prelevati da lamelline preparate con la tecnica della linea.
Iniziare spostandosi nella regione di interesse per acquisire le cellule, prelevandole singolarmente da un preparato cline. Nella barra degli strumenti della microdissezione, selezionare la scheda LCM, quindi l'icona del punto singolo. Successivamente, nella barra degli strumenti del microscopio, utilizzare la scheda dell'otturatore per passare tra fluorescenza e campo chiaro, con le schede dei filtri fluorescenti per scegliere i filtri appropriati, e le schede degli obiettivi per modificare l'ingrandimento.
Una volta che le cellule di interesse sono visibili nella finestra video in tempo reale, regolare le dimensioni del punto utilizzato per contrassegnare le cellule di interesse in base alle dimensioni approssimative delle cellule. Contrassegnare le cellule di interesse selezionando l'icona del punto singolo e quindi facendo clic sulle cellule. Dopo aver contrassegnato le cellule sulla barra degli strumenti di microdissezione, selezionare la scheda "go cut and capture" e il laser a infrarossi si attiverà automaticamente su tutte le cellule contrassegnate.
Spostare il cappuccio lontano dalla sezione e su una regione aperta del vetrino per verificare se le cellule sono state catturate sul cappuccio LCM. Al termine del prelievo del tessuto, spostare il cappuccio facendo clic con il tasto destro sul cappuccio, selezionando quindi "sposta" e poi "rimuovi", come indicato nel protocollo testuale; utilizzare il vetrino processato per immunohistochimica come riferimento per selezionare la regione di interesse dal tessuto presente sulla membrana a pennarello. Nella barra degli strumenti di microdissezione, selezionare la scheda "taglia e cattura", quindi scegliere la scheda "linea di taglio" e, utilizzando il vetrino etichettato per immunohistochimica come guida, delimitare la regione di interesse sotto l'obiettivo 10x.
Prova, accendi e punta i laser IR e UV come mostrato in precedenza. In questo video, nella barra degli strumenti della microdissezione, seleziona la scheda vai a catturare e tagliare. Quindi sposta il cappuccio LCM dal tessuto per determinare se il tessuto è stato rimosso dalla sezione e si è attaccato al cappuccio.
Al termine della raccolta del tessuto, per rimuovere il cappuccio, fare clic con il tasto destro sul cappuccio e selezionare "sposta in", quindi scaricare le microfotografie. Le figure dimostrano che la LCM è in grado di isolare singoli neuroni dopaminergici immunoreattivi per la tirosina idrossilasi utilizzando il laser IR o i laser IR e UV, poiché l'uso più comune delle cellule nei tessuti isolati mediante LCM è l'analisi dell'RNA. Le procedure presentate sono state ottimizzate per preservare l'integrità dell'RNA, come evidenziato da una riduzione relativa dell'altezza del picco dell'rRNA 28 S rispetto al picco 18 S. L'integrità dell'RNA è risultata ridotta nei campioni ottenuti con LCM dopo immunohistochimica, seguita da fissazione con acetone, rispetto all'RNA ottenuto dal cervello intero. Per misurare la quantità di RNA ottenuta da neuroni acquisiti tramite L-C-M-R-N-A da neuroni dopaminergici della regione ventrale tegmentale, su vetrini preparati con soluzione salina, i campioni sono stati isolati in base alla curva standard generata: sono stati ottenuti rispettivamente 17,3, 24,8 e 50,9 picogrammi per microlitro da 5, 100 e 200 neuroni dopaminergici.
E utilizzando la QPCR per misurare la qualità dell'RNA, un intervallo di concentrazioni di RNA proveniente dall'intero cervello e da neuroni dopaminergici è stato sottoposto a trascrizione inversa e il gene della beta-actina è stato misurato da queste misurazioni; concentrazioni di 3,55, 6,82 e 20,58 picogrammi per microlitro sono state calcolate rispettivamente da 5, 100 e 200 neuroni dopaminergici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il microscopio a cattura laser per isolare singoli neuroni dopaminergici o per isolare regioni di neuroni dopaminergici.
Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento di neuroni dopaminergici da sezioni di tessuto mediante microdissezione laser assistita da cattura (LCM) combinata con immunohistochemia. Il metodo consente la raccolta precisa di singoli neuroni dopaminergici o di specifiche regioni anatomiche, come l'area tegmentale ventrale, per analisi molecolari successive. Il protocollo sottolinea le fasi necessarie per preservare l'integrità dell'RNA, permettendo un'estrazione di RNA di alta qualità adatta per PCR quantitativa e altre applicazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Molecolare
- Biologia Cellulare
Sfondo
- La LCM consente l'isolamento di popolazioni cellulari specifiche o di regioni anatomiche da sezioni di tessuto.
- La combinazione della LCM con l'immunohistochimica permette di indirizzare le cellule in base a marcatori proteici, come la tirosina idrossilasi per i neuroni dopaminergici.
- Metodi tradizionali come la dissezione macroscopica non offrono la specificità cellulare garantita dalla LCM.
- L'integrità dell'RNA è fondamentale per le analisi molecolari successive, richiedendo una manipolazione e una lavorazione accurata del tessuto.
Scopo dello studio
- Dimostrare un protocollo per l'isolamento di neuroni dopaminergici mediante LCM e immunohistochimica.
- Confrontare l'efficacia di vetrini in vetro rispetto a vetrini con membrana PEN per il recupero del tessuto.
- Valutare la qualità e la quantità di RNA ottenuti dai neuroni isolati per la PCR quantitativa.
Metodi Utilizzati
- Sezionamento del tessuto del mesencefalo ventrale congelato su vetrini preparati (in vetro o con membrana PEN).
- Etichettatura immunofluorescente rapida dei neuroni dopaminergici mediante anticorpo anti-idrossilasi della tirosina.
- Disidratazione del tessuto con etanolo a gradazione crescente e xilene.
- Micromanipolazione laser mediante laser a infrarossi (IR) e ultravioletti (UV) per isolare singoli neuroni o regioni.
- Estrazione dell'RNA e valutazione della qualità mediante PCR quantitativa.
Risultati principali
- LCM ha isolato con successo singoli neuroni dopaminergici positivi per la tirosina idrossilasi e regioni dell'area tegmentale ventrale.
- I vetrini con membrana PEN hanno fornito un'acquisizione del tessuto più consistente ed efficiente rispetto ai vetrini in vetro.
- È stato ottenuto RNA di quantità e qualità sufficienti già da soli 5 neuroni dopaminergici, con rese crescenti all'aumentare del numero di cellule.
- L'integrità dell'RNA è stata preservata mediante il protocollo ottimizzato, come dimostrato da misurazioni di PCR quantitativa dell'espressione genica della beta-actina.
Conclusioni
- Il protocollo di LCM descritto consente l'isolamento preciso di neuroni dopaminergici per l'analisi molecolare.
- I vetrini con membrana PEN offrono significativi vantaggi per il recupero del tessuto e la conservazione dell'RNA.
- Questo metodo permette l'estrazione di RNA di alta qualità, adatto ad applicazioni successive come la qPCR, ed è suscettibile di adattamento per altre analisi molecolari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microdissezione con laser (LCM) combinata con immunohistochemia consente l'isolamento preciso di neuroni dopaminergici o di regioni cerebrali definite, supportando un profilo molecolare ad alta fedeltà nelle fasi iniziali della scoperta. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nella validazione degli obiettivi, garantendo che le analisi successive siano effettuate su popolazioni cellulari altamente specifiche. La capacità del metodo di produrre RNA di alta qualità da quantità minime di materiale iniziale ha un impatto diretto sulla continuità traslazionale e sulle decisioni di portafoglio corrette in base al rischio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando popolazioni neuronali definite in base alla funzione.
- Consente la riduzione del rischio biologico mediante analisi molecolari specifiche per tipo cellulare.
- Migliora l'affidabilità predittiva per la validazione degli obiettivi riducendo al minimo l'eterogeneità del campione.
Sviluppo di screening e saggi
- Facilita la preparazione di popolazioni cellulari validate per saggi molecolari successivi.
- Migliora la riproducibilità del saggio standardizzando l'isolamento cellulare in base ai marcatori proteici.
- Fornisce output quantitativi adatti alla qPCR e ad altre letture molecolari.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il profilo molecolare a sistemi neuronali rilevanti per la malattia.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, sostenendo l'analisi dei biomarcatori in tipi cellulari definiti.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli preclinici garantendo la specificità del campione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La LCM con immunohistochemia si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica consentendo l'isolamento preciso di cellule per analisi molecolari, sostenendo sia la verifica di ipotesi sia lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Biologia della scoperta: Supporta l'isolamento guidato da ipotesi di sottotipi neuronali per l'analisi dei percorsi.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari riproducibili, basate su marcatori, per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi di RNA e DNA per studi molecolari comparativi.
- Ricerca traslazionale: Permette di correlare i risultati molecolari con regioni cerebrali rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato e adattabile per l'isolamento di diversi tipi cellulari in vari progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento cellulare, migliorando la riproducibilità e la scalabilità tra studi.
- Valore strategico: Supporta decisioni informate di prosecuzione/cessazione e l'efficienza del capitale consentendo dati molecolari di alta qualità da popolazioni cellulari definite.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo solide evidenze molecolari da sistemi neuronali rilevanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella sezionatura dei tessuti, nell'immunohistochimica e nell'uso di strumenti per la microdissezione laser.
- Richiede l'accesso a microscopi a cattura laser e a infrastrutture per l'analisi molecolare.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione e di etichettatura dei vetrini.
- Adattabile a diversi tipi cellulari e regioni anatomiche con un'opportuna selezione dei marcatori.
- Dipende da rigorosi passaggi di disidratazione del tessuto e di conservazione dell'RNA per ottenere risultati ottimali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Preparaion of Slides and Tissue for Laser Capture Microscopy
3:08
Laser Capture Microdissection System
5:19
Capturing the Ventral Tegmental Area from PEN Membrane Slides
6:19
Results: Dopamine Neuron Isolation Using Laser Capture Microdissection
8:05
Conclusion
