Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell'isolamento individuale dopamina neuroni e l'intera area ventrale tegmentale

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i neuroni della dopamina dalle sezioni di tessuto sui vetrini. Ciò si ottiene sezionando prima il tessuto mesencefalo ventrale congelato su vetrini stilizzati o vetrini a membrana a penna. Successivamente, i neuroni della dopamina vengono marcati con un'immunoistochimica a fluorescenza rapida.

Quindi il tessuto viene disidratato e caricato nel microscopio a cattura laser. Quindi i neuroni dopaminergici marcati vengono attaccati al cappuccio LCM utilizzando il laser a infrarossi e l'RNA o la molecola di interesse viene isolata. I risultati dimostrano che è possibile ottenere RNA di quantità e qualità sufficienti per misure di PCR quantitativa utilizzando la microscopia a cattura laser.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la dissezione grossolana o i micro punch, è che le singole popolazioni cellulari possono essere isolate o regioni cerebrali molto discrete. Per prepararsi all'isolamento dell'RNA, immergere i vetrini di preparazione seline o il metilato di polietilene o i vetrini di vetro con membrana a penna nella soluzione di decontaminazione e utilizzare l'acqua priva di RNA per lavarli tre volte utilizzando una serie graduata di RNA di etanolo libero, disidratare i vetrini e asciugarli sottovuoto per 30 minuti con un criostato, tagliare sezioni di tessuto a 10 micron di spessore e montarle su RNA preparati. I vetrini liberi mantengono i campioni congelati durante il sezionamento per preservare la qualità dell'RNA.

Successivamente per eseguire l'immunoistochimica. Usa una penna idrofobica per delineare i tessuti e lasciali asciugare in una soluzione di acetone metanolo uno a uno. Fissare il fazzoletto a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per 10 minuti Dopo aver tolto il fazzoletto dal congelatore, coprire le sezioni con 100-200 microlitri di anticorpo tirosina idrossilasi NPBS e tritton all'1% per 10 minuti.

Quindi utilizzare PBS con tritton all'1% per sciacquare i vetrini prima di coprire le sezioni con 100-200 microlitri di IgG anti-coniglio di capra, etichettato con Alexa Fluor 4 88, incubare per cinque minuti e quindi utilizzare PBS per risciacquare i vetrini due volte. Successivamente, disidratare i campioni integrati in serie di RNA etanolo libero per 30 secondi ciascuno, come dimostrato in precedenza in questo video. Incubare in xilene per un minuto e un secondo, lavare per cinque minuti.

Rimuovere le diapositive immediatamente prima dell'uso per LCM e lasciarle asciugare all'aria. Dopo aver caricato i cappucci LCM e le diapositive e aver impostato il sistema LCM secondo il protocollo di testo, regolare e puntare l'acquisizione laser IR per la forza. Posizionare il cappuccio in una zona del vetrino lontana dal tessuto sulla barra degli strumenti del laser di acquisizione.

Selezionare abilita, regolare l'impulso di potenza e il numero di colpi del laser. Azionare il laser IR quando il cappuccio si trova su una parte del vetrino senza tessuto e verificare se il laser fonde sufficientemente la membrana del cappuccio LCM. Dopo aver regolato l'intensità del laser IR, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare il laser di acquisizione è qui per puntare il laser per eseguire LCM su singoli neuroni dopaminergici fuori dai vetrini di preparazione del clino.

Inizia spostandoti nella regione di interesse per catturare le cellule per catturare le singole cellule da un lato di preparazione del cline. Nella barra degli strumenti di microdissezione, selezionare la scheda LCM, quindi l'icona del punto singolo. Successivamente, nella barra degli strumenti del microscopio, utilizzare la linguetta dell'otturatore per passare dalla fluorescenza al campo chiaro con le schede dei filtri fluorescenti per scegliere i filtri appropriati e utilizzare le linguette degli obiettivi per modificare l'ingrandimento.

Una volta che le celle di interesse sono visibili nella finestra del video in diretta, regola la dimensione del punto utilizzata per contrassegnare le celle di interesse in base alla dimensione approssimativa delle celle. Contrassegna le celle di interesse selezionando l'icona a forma di punto singolo e quindi facendo clic sulle celle. Una volta che le cellule sono state contrassegnate sulla barra degli strumenti di microdissezione, selezionare la scheda Vai taglio e cattura e il laser IR sparerà automaticamente su tutte le celle contrassegnate selezionate.

Allontanare il cappuccio dalla sezione e posizionarlo su una regione aperta del vetrino per verificare se le cellule sono state catturate sul cappuccio LCM. Al termine della raccolta del tessuto, spostare il cappuccio facendo clic con il pulsante destro del mouse sul tappo e selezionando sposta su e quindi scarica come indicato nel protocollo di testo, utilizzare il vetrino elaborato per l'immunoistochimica come guida per selezionare la regione di interesse dal tessuto sulla membrana della penna. Nella barra degli strumenti di microdissezione, selezionare la scheda di taglio e cattura, quindi selezionare la scheda della linea di taglio e, utilizzando il vetrino etichettato con l'immunoistochimica come guida, delineare la regione di interesse sotto l'obiettivo 10x.

Testa, spara e punta i laser IR e UV come dimostrato in precedenza. In questo video, nella barra degli strumenti di microdissezione, selezionare la scheda Vai cattura e taglia. Quindi spostare il cappuccio LCM dal tessuto per determinare se il tessuto è stato rimosso dalla sezione e attaccarlo al tappo.

Al termine della raccolta del tessuto per rimuovere il tappo, fare clic con il pulsante destro del mouse sul tappo e selezionare Sposta per poi scaricare le micrografie in queste figure dimostrano che LCM è in grado di isolare singoli neuroni dopaminergici immunoreattivi della tirosina idrossilasi utilizzando il laser IR o i laser IR e UV perché l'uso più comune delle cellule nei tessuti isolati utilizzando LCM è l'analisi dell'RNA. Le procedure presentate sono state ottimizzate per preservare l'integrità dell'RNA, come si vede da una relativa riduzione dell'altezza del picco RRNA 28 S rispetto al picco 18 S, la qualità dell'RNA è risultata ridotta nei campioni LCM con integrità inferiore dopo immunoistochimica, seguita dalla fissazione dell'acetone rispetto all'intero RNA cerebrale. Per misurare la quantità di RNA ottenuta dai neuroni acquisiti tramite L-C-M-R-N-A dai neuroni dopaminergici dall'area verde acqua ventrale al di fuori della soluzione salina sono stati isolati vetrini in base alla curva standard che hanno generato un totale di 17,3, 24,8 e 50,9 picogrammi per microlitro sono stati isolati rispettivamente da 5, 100 e 200 neuroni dopaminergici.

Utilizzando la QPCR per misurare la qualità dell'RNA, una gamma di concentrazioni di RNA dell'intero cervello e RNA dai neuroni della dopamina sono state trascritte invertite e il gene beta actina è stato misurato da queste misurazioni le concentrazioni di tre virgola 55, 6, 0,82 e 20 virgola 58 picogrammi per microlitro sono state calcolate rispettivamente da 5, 100 e 200 neuroni dopaminergici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il microscopio a cattura laser per isolare singoli neuroni dopaminergici o per isolare regioni di neuroni dopaminergici.