Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare la motilità superficiale batterica chiamata swarming in modo standardizzato e riproducibile. Questo viene ottenuto preparando e facendo maturare inizialmente le piastre per il test della motilità superficiale. Il secondo passaggio consiste nell'inoculare le piastre per il saggio della motilità superficiale con batteri e nell'incubare tali piastre in un ambiente controllato.

Successivamente, i modelli di crescita batterica negli assay su piastra vengono acquisiti in tempo reale. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'elaborare le immagini per la quantificazione. In definitiva, questa procedura fornisce un protocollo standardizzato per la preparazione degli assay su piastra per la motilità superficiale, al fine di ottenere informazioni dinamiche quantitative, come la velocità di espansione dello swarm o la distribuzione della densità del bio-prodotto per batteri modalità superficiale.

Molti gruppi eseguono saggi di motilità superficiale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che forniamo un protocollo sistematico che minimizza le molteplici variabili che possono portare a risultati non coerenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della motilità batterica su superfici, come ad esempio come i batteri colonizzano diversi tipi di superfici.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla motilità di swarming di pseudomonas con alcune modifiche, può anche essere applicato per studiare altri batteri modalità superficiali. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché piccole variazioni nel protocollo o nell'ambiente di laboratorio possono influenzare notevolmente i risultati del saggio di swarming. La procedura sarà dimostrata da Morgan, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per iniziare il protocollo, preparare un mix agro combinando 200 millilitri di mezzo FAB privo di solfato di ammonio, 0,9 grammi di agar nobilis e 0,2 grammi di acidi cani in una bottiglia per mezzo da 500 millilitri. Utilizzare un agitatore magnetico per mescolare accuratamente il mezzo. Successivamente, sterilizzare il mezzo in un'autoclave impostata a 121,1 gradi Celsius per 22 minuti con l'opzione di sfiato rapido.

Immediatamente dopo la sterilizzazione, stringere il tappo della bottiglia del terreno per prevenire l'evaporazione dell'acqua. Posizionare il terreno su un agitatore magnetico e raffreddare l'AED a 50 gradi Celsius in un ambiente a temperatura ambiente con agitazione attiva. Se l'agar deve essere utilizzato in un successivo punto sperimentale, può essere mantenuto al caldo in un bagno d'acqua o in un incubatore a 60 gradi Celsius per 15 ore senza agitazione attiva.

Quando il mezzo raggiunge circa 50 gradi Celsius, aggiungere due millilitri di glucosio filtrato e sterilizzato, e miscelare accuratamente con la barretta magnetica utilizzando tecniche sterili standard per evitare la formazione di bolle nel mezzo. In una cappa, utilizzare una pipetta sierologica sterile per distribuire 7,5 millilitri di mezzo in singole piastre di Petri da 60 millimetri. Se si desidera una superficie maggiore per lo swarming, distribuire 25 millilitri di mezzo in piastre di Petri da 100 millimetri.

Lasciare tutte le piastre separate e verificare la cappa con un livello a bolla per assicurare una superficie orizzontale uniforme sulla quale l'agar possa solidificare. Per piastre da 60 millimetri, mettere da parte i coperchi e lasciare indurire l'agar scoperto nella cappa per 30 minuti. Piastre più grandi da 100 millimetri richiederanno un tempo di indurimento più lungo.

L'umidità, il flusso d'aria e la temperatura di un determinato laboratorio potrebbero richiedere la verifica del tempo di indurimento per ottenere una condizione ottimale di swarming per il vostro batterio. Dopo l'essiccazione, i terreni APL devono essere immediatamente inoculati con cellule precedentemente coltivate separatamente fino alla fase di crescita desiderata. Per iniziare, selezionare una colonia batterica isolata da una piastra LB fresca e inoculare in sei millilitri di terreno di coltura.

Incubare la coltura tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione orizzontale. Il giorno successivo, inoculare da uno a cinque microlitri della coltura notturna sulle piastre di agar per saggio di swarming ormai essiccate, pungendo la superficie dell'agar con un bastoncino sterile o con un ago di inoculazione metallico, a seconda del ceppo batterico. Trasferire le piastre per il saggio di swarming in un incubatore impostato alla temperatura di 30 gradi Celsius, 37 gradi Celsius o 42 gradi Celsius. Capovolgere le piastre in modo che l'eccesso di umidità si condensi sul coperchio e non sull'agar, quindi equilibrare i batteri alla temperatura specifica per il ceppo per due o quattro ore immediatamente prima dell'acquisizione di immagini in time-lapse.

Successivamente, trasferire le piastre nell'unità di imaging in vivo in modo che i batteri sulla superficie dell'agar siano rivolti verso il basso, in direzione della telecamera capovolta dell'unità. Riempire tutti i coperchi delle piastre di Petri con una piccola quantità di acqua. Quindi posizionare ogni coperchio con il lato contenente l'acqua rivolto verso l'alto sopra le piastre AER capovolte.

All'interno dell'unità di imaging, sigillare l'involucro di imaging per mantenere un livello costante di umidità, regolare le impostazioni di imaging dell'unità e avviare l'imaging in time-lapse dell'attività di swarming. Dopo l'imaging in tempo reale, la dinamica di swarming dei batteri può essere analizzata mediante analisi standard delle immagini, come Image J, in un esperimento di motilità su superficie. Determinare il contenuto di umidità dell'agar poco prima dell'inoculo è fondamentale per ottenere risultati di swarming soddisfacenti.

Le piastre AER ottimali favoriscono una zona di inoculo compatta e potenziano l'attività di swarming batterico, mentre piastre troppo essiccate sopprimono la motilità superficiale; oltre al contenuto di umidità, la presenza o assenza di additivi nel terreno di coltura può influenzare l'attività di swarming dei batteri in funzione della temperatura di incubazione, utilizzando ceppi batterici che esprimono proteine luminescenti o fluorescenti. La dinamica di competizione nello swarming tra due diverse specie batteriche può essere registrata mediante un video in time-lapse. Inoltre, variazioni nella densità cellulare locale e nel tasso di biosintesi di lipidi che promuovono la motilità all'interno dello swarm batterico possono essere determinate e quantificate mediante microscopia fluorescente in time-lapse.

Seguendo questa procedura, altri metodi come la microscopia confocale possono essere impiegati per indagare il comportamento individuale delle cellule e ottenere un'analisi dettagliata e microscopica della motilità batterica sulla superficie. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di swarming standard e riproducibile e ottenere un'analisi completa della motilità batterica sulla superficie, preparando, incubando e inoculando saggi di motilità superficiale e analizzando i risultati in termini di schemi di crescita batterica.