Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

La motilità della sciamatura è influenzata da fattori fisici e ambientali. Descriviamo un protocollo in due fasi e linee guida per aggirare le sfide comunemente associate alla preparazione del saggio a sciame e alla raccolta dei dati. Una tecnica di imaging macroscopico viene impiegata per ottenere informazioni dettagliate sul comportamento dello sciame che non sono fornite dalle attuali tecniche di analisi.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e quantificare la motilità della superficie batterica chiamata sciamatura in modo standard e riproducibile. Ciò si ottiene preparando e polimerizzando prima le piastre di motilità superficiale. Il secondo passo consiste nell'inoculare le piastre per il saggio della motilità superficiale con batteri e nell'incubazione di queste piastre in un ambiente controllato.

Successivamente, i modelli di crescita batterica sui saggi su piastra vengono riprodotti in tempo reale. La fase finale della procedura consiste nell'elaborare le immagini per la quantificazione. In definitiva, questa procedura fornisce un protocollo standardizzato per la preparazione del saggio su piastra di motilità superficiale per generare informazioni dinamiche quantitative come il tasso di espansione dello sciame o la distribuzione della densità del bioprodotto per i batteri modali di superficie.

Molti gruppi eseguono saggi di motilità superficiale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che forniamo un protocollo sistematico che riduce al minimo le molteplici variabili che possono portare a incoerenze. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della motilità batterica della superficie, come ad esempio il modo in cui i batteri colonizzano diversi tipi di superfici.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla motilità dello sciame di pseudomonas con alcune modifiche, può anche essere applicato per studiare altri batteri modali di superficie. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché piccoli cambiamenti nel protocollo o nell'ambiente di laboratorio possono influenzare notevolmente i risultati del test a sciame. A dimostrare la procedura sarà Morgan, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per iniziare il protocollo, preparare un agri mix combinando 200 millilitri di FAB meno il terreno di sciame di solfato di ammonio, 0,9 grammi di agar nobile e 0,2 grammi di acidi caino in un flacone da 500 millilitri. Utilizzare una piastra di agitazione per mescolare accuratamente il fluido. Quindi, sterilizzare il terreno in un'autoclave impostata a 121,1 gradi Celsius per 22 minuti con un'opzione di sfiato rapido.

Subito dopo la sterilizzazione, serrare il tappo del flacone del supporto per evitare l'evaporazione dell'acqua. Posizionare il terreno su una piastra di agitazione magnetica e raffreddare il DAE a 50 gradi Celsius in un ambiente a temperatura ambiente con agitazione attiva. Se l'agar deve essere utilizzato in un momento sperimentale successivo, può essere mantenuto caldo in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius o in un incubatore per 15 ore senza agitazione attiva.

Quando il terreno raggiunge circa 50 gradi Celsius a due millilitri di glucosio sterilizzato con filtro, utilizzando tecniche sterili standard, mescolare accuratamente con l'ancoretta magnetica per evitare la formazione di bolle nel supporto. In una cappa, utilizzare una pipetta sierologica sterile per aliquotare 7,5 millilitri di edia in singole piastre di Petri da 60 millimetri. Se si desidera una superficie di sciamatura più ampia, aliquotare 25 litri di edia in piastre di Petri da 100 millimetri.

Lasciare tutte le stoviglie non impilate e controllare la cappa con una livella a occhio di bue per garantire una superficie orizzontale uniforme su cui l'agar possa solidificarsi. Per piastre da 60 millimetri, mettere da parte i coperchi dei piatti e polimerizzare l'agar scoperto nella cappa per 30 minuti. I piatti più grandi da 100 millimetri richiedono un tempo di polimerizzazione più lungo.

L'umidità, il flusso d'aria e la temperatura di un determinato laboratorio possono richiedere di testare il tempo di polimerizzazione per una sciamatura ottimale del batterio. Dopo l'essiccazione, gli APL devono essere immediatamente inoculati con cellule che sono state pre-coltivate separatamente nella fase di crescita desiderata. Per iniziare, raccogli una colonia di batteri isolata da una piastra LB fresca e inoculare in sei millilitri di coltura. Media.

Incubare la coltura per una notte a 37 gradi Celsius con agitazione orizzontale. Il giorno successivo, inoculare da uno a cinque microlitri della coltura notturna sulle piastre di agar a sciame essiccate colpendo la superficie dell'agar con uno stuzzicadenti sterile o un ago da inoculazione a filo, a seconda del ceppo batterico, trasferire le piastre del saggio a sciame in un incubatore con una temperatura impostata su 30 gradi Celsius, 37 gradi Celsius, o 42 gradi Celsius. Capovolgere le piastre in modo che l'umidità in eccesso si condensi sul coperchio della piastra e non sull'agar, equilibrare i batteri a temperature specifiche del ceppo per due o quattro ore appena prima dell'imaging time-lapse.

Quindi, trasferire le piastre nell'unità di imaging in vivo in modo che i batteri sulla superficie agricola siano rivolti verso il basso verso la fotocamera invertita dell'unità. Riempi tutti i coperchi delle piastre di Petri con una piccola quantità d'acqua. Quindi posizionare ciascun coperchio con il lato dell'acqua rivolto verso l'alto sopra le piastre AER capovolte.

All'interno dell'unità immagini, sigillare l'involucro di imaging per mantenere un livello di umidità costante, regolare le impostazioni di imaging dell'unità imaging e avviare l'imaging time-lapse dell'attività di sciamatura. Dopo l'imaging in tempo reale, la dinamica dello sciame dei batteri può essere analizzata utilizzando l'analisi delle immagini standard come l'immagine J in un esperimento di motilità superficiale. Il dosaggio del contenuto di umidità dell'agar appena prima dell'inoculazione è fondamentale per ottenere risultati di sciamatura di successo.

In modo ottimale, le piastre AER faciliteranno un punto di inoculazione stretto e miglioreranno l'attività di sciamatura batterica, mentre le piastre troppo essiccate sopprimono la motilità superficiale oltre al contenuto di umidità, la presenza o l'assenza di additivi del terreno può anche influenzare l'attività di sciamatura dei batteri in funzione della temperatura di incubazione utilizzando ceppi batterici, che esprimono luminescenza o proteine fluorescenti. Le dinamiche di competizione tra due diverse specie di batteri possono essere catturate in un video time-lapse. Inoltre, i cambiamenti nella densità cellulare locale e il tasso di biosintesi dei lipidi che promuovono la mobilità all'interno dello sciame batterico possono anche essere accertati e quantificati con la microscopia fluorescente time-lapse.

Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia confocale, possono essere impiegati per rispondere a domande sul comportamento delle singole cellule per generare un'analisi dettagliata, microscopica e microscopica della motilità della superficie batterica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test a sciame standard e riproducibile e ottenere un'analisi completa della motilità della superficie batterica preparando, polimerizzando e inoculando i saggi di motilità superficiale e l'elaborazione e l'analisi del risultato nei modelli di crescita batterica.