Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi
20 aprile 2015
In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare organoidi trasdotti stabilmente dall'epitelio intestinale primario di topo per l'analisi a valle degli organoidi intestinali. Ciò si ottiene effettuando prima il sezionamento di cellule T HEC 2 93 con vettori di imballaggio lentivirali e plasmidi lentivirali, codificando il gene di interesse per produrre particelle lentivirali ad alto titolo. Il secondo passo consiste nel pretrattare organoidi intestinali di topo in coltura con una serie di fattori di crescita per ottenere cripte iper proliferative cistiche.
Successivamente, trasdurre gli organoidi con il lentivirus ad alto titolo e incubare gli organoidi trasdotti in matrigel. Il passaggio finale consiste nell'incorporare organoidi trasdotti adulti in paraffina per l'analisi immunoistochimica a valle. In definitiva, la trasduzione dell'organoide lentivirale viene utilizzata per generare alterazioni genetiche in un modello in vitro dell'epitelio intestinale che è affidabile, riproducibile e veloce.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le linee cellulari tumorali, è che gli organoidi sono gerarchie di cellule staminali spostate non mutate. Nella polarizzazione cellulare del testo, può differenziarsi in tutti i diversi tipi di cellule dell'epitelio dell'intestino tenue. Inoltre, gli organoidi trasdotti possono essere utilizzati per studiare specifici elementi genetici, superando così l'uso di topi transgenici e gli aspetti del costo e della velocità.
La produzione di particelle lentivirali è un protocollo di cinque giorni che inizia con la scissione delle cellule T HEC 2 93 al 60-80% di fluenza di co in un pallone di 162 centimetri quadrati in terreno di coltura cellulare. Incubare le cellule per una notte in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Preparare la soluzione di trasfezione del DNA e la soluzione di trasfezione di polietilene ammina o PEI come descritto nel testo del protocollo.
Aggiungere la soluzione di trasfezione del DNA al vortice della soluzione PEI o capovolgere un certo numero di volte e incubare per cinque minuti. A temperatura ambiente. Versare due millilitri della soluzione di DNA TRANSFECTION più PEI sulle cellule T HEC 2 93 e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius dopo quattro ore.
Aggiornare il terreno di coltura. Per rimuovere il PEI, incubare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius il quarto giorno, raccogliere il surnatante in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere nuovo terreno di coltura alle cellule e rimettere il pallone nell'incubatore, centrifugare il surnatante raccolto a 500 Gs per cinque minuti.
Per rimuovere le cellule morte, utilizzare una grande siringa da 60 millilitri per spingere SUPERNAT attraverso un filtro da 0,45 micrometri. Conservare il supernat filtrato durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Raccogliere la centrifuga e filtrare il secondo lotto di surnatante come mostrato per il primo lotto.
Raggruppare i due lotti di surnatante in provette da ultra centrifuga. Centrifugare a 50.000 GS per 90 minuti. Al termine della centrifugazione, con molta attenzione, rimuovere le capsule contenenti le provette da ultra centrifuga e metterle in una cappa a flusso laminare.
Aprire la capsula che contiene la provetta dell'ultra centrifuga e decantare accuratamente il terreno con il pellet sul lato superiore della provetta. È importante ricordare da che parte del tubo si sarebbe formato l'appellativo, poiché i pellet virali possono essere difficili da visualizzare. Quindi, utilizzare una micropipetta per rimuovere l'ultimo pezzetto di terreno facendo attenzione a non agitare il pellet marrone opaco visibile sul lato del fondo della provetta dell'ultracentrifuga.
Risospendere questo pellet in 500 microlitri di terreno di coltura di organoidi integrato con inibitori della nicotinamide chinasi e resur cerebrale poli. La sospensione in questo mezzo è importante poiché il virus ad alto titolo verrà utilizzato direttamente per la trasduzione degli organoidi due giorni prima della trasduzione. Dividere un pozzetto completo di organoidi di 0,95 centimetri quadrati in un nuovo pozzetto di una piastra da 48 pozzetti.
Seguendo un protocollo precedentemente pubblicato. Obiettivo di ottenere circa 50 piccoli organoidi in coltura di organoidi. Terreno integrato con un inibitore della glicogeno sintasi chinasi e nicotinamide.
Per ottenere cripte iper proliferative cistiche. Incubare gli organoidi per due giorni il giorno della trasduzione, raccogliere gli organoidi con una micropipetta P 1000. Pipettare il gel matra e il terreno su e giù, interrompendo così la miscela.
Mettere il composto in un tubo da 15 millilitri. Interrompere ulteriormente la miscela utilizzando una pipetta PE in cui l'apertura distale è stata ridotta fondendo in pellet gli organoidi centrifugando a 100 Gs per cinque minuti. Quindi rimuovere il surnatante a 500 microlitri di preriscaldare una x tripsina e risospendere gli organoidi in cova per tre minuti.
In un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, inattivare la tripsina aggiungendo 3,5 millilitri di centrifuga di terreno di coltura cellulare per cinque minuti. A 500 Gs.Rimuovere il super natan per lasciare il pellet in circa 20 microlitri di terreno. Trasferire gli organoidi in quest'ultima piccola quantità di terreno in un pozzetto.
Su una piastra da 48 pozzetti. Aggiungere agli organoidi il lentivirus ad alto titolo precedentemente preparato in mezzo di trasduzione e risospendere. Incubare la miscela di organoidi virali per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura per consentire la trasduzione dopo un'ora, aggiungere un millilitro di organoidi di coltura, mezzo alla miscela di organoidi virali, risospendere e trasferire la miscela in una microcentrifuga a 850 GS per cinque minuti.
Per pellettare gli organoidi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet. In 20 microlitri di gel matra ghiacciato, metti la gocciolina al centro di un pozzo. In una piastra da 48 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Affinché la gocciolina si solidifichi dopo 15 minuti. Aggiungere con cura 250 microlitri di coltura di organoidi. Terreno integrato con nicotinamide e inibitori delle chinasi.
Preriscalda un blocco di alluminio in un'incubatrice a 70 gradi Celsius per mantenere la paraffina liquida. Rimuovere il terreno da un singolo pozzetto con organoidi adulti lasciando intatti gli organoidi incorporati e aggiungere un millilitro di aldeide paraforme al 4% in PBS direttamente al pozzetto. Sostituire l'aldeide paraforme con un millilitro di PBS.
Risospendere gli organoidi fissati nel PBS e trasferirli in una fiala di vetro. Lasciate che gli organoidi affondino sul fondo per un minuto. Quindi, pipettare il PBS e sostituirlo con etanolo al 70% in cui sono disciolte un paio di goccioline di soluzione di eoina.
Per consentire la visualizzazione degli organoidi durante il processo di inclusione, lasciare gli organoidi in etanolo al 70% a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere l'etanolo al 70% pipettandolo accuratamente. Gli organoidi possono essere visualizzati ad occhio grazie al colore eoin rosato.
Sostituire la soluzione di inclusione con etanolo al 96% e lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti in questo modo. Successivamente, passare gli organoidi attraverso etanolo al 70%, etanolo al 90%, etanolo al 96%, etanolo, etanolo, 100% etanolo, xilene e xilene. Decantare l'ultimo lavaggio con xilene e versare la paraffina nella fiala di vetro.
Mettere immediatamente la fiala nel blocco di alluminio preriscaldato a 70 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, sostituire la paraffina con una nuova paraffina pulita con un preriscaldamento, PE o pipetta. Versare la paraffina e utilizzare un parassita preriscaldato o una pipetta con un'ampia apertura per pipettare gli organoidi nello stampo a blocchi di paraffina in uno strato di paraffina liquida.
Scaldare un ago da dissezione con un bruciatore bunsen e manipolare tutti gli organoidi il più possibile verso il centro dello stampo a blocchi di paraffina. Quando la localizzazione degli organoidi nello stampo è soddisfacente, raffreddare leggermente lo stampo per solidificare lo strato di paraffina. Termina il blocco versando altra paraffina sopra e aggiungi una cassetta di inclusione istologica standard.
In questo protocollo, gli organoidi dell'epitelio intestinale sono stati trasdotti con lentivirus. Gli organoidi normali crescono come strutture villose della cripta K con un numero di cripte che escono da un dominio villoso condiviso. Dopo il trattamento di questi organoidi con l'inibitore GSK 3 B, CHIR 9 9 0 21, la proliferazione aumenta e le cripte diventano cistiche dopo la trasduzione dell'organoide.
Utilizzando la sovraespressione lentivirale di EGFP, gli organoidi esprimono fasi fluorescenti di miglioramento della trasduzione di EGFP che possono essere eseguite quando l'efficacia della trasduzione è bassa, come l'inoculazione o l'incubazione virale prolungata non sono richieste, poiché queste fasi non aumenteranno la già elevata efficacia. Successivamente, questi organoidi vengono processati per le tecniche di RNA e l'immunoistochimica. Questa immagine rappresentativa è una sezione di un organoide intestinale di topo, colorato per BRDU dopo l'incubazione con BRDU per un'ora prima del fissaggio.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasdurre organoidi dall'epitelio intestinale primario utilizzando particelle lentivirali o retrovirali.
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Panoramica
Questo protocollo video fornisce una spiegazione dettagliata della trasduzione lentivirale in organoidi derivati dall'epitelio intestinale primario. Illustra le fasi di lavorazione e l'analisi successiva di queste colture mediante RT-PCR quantitativa, microarray di RNA e immunohistochimica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ingegneria genetica
Sfondo
- La trasduzione lentivirale è un metodo utilizzato per introdurre materiale genetico nelle cellule.
- Gli organoidi sono strutture tridimensionali che imitano l'architettura e la funzionalità degli organi.
- Gli organoidi derivati dall'epitelio intestinale primario sono preziosi per lo studio della biologia intestinale.
- Le tecniche di analisi a valle sono essenziali per convalidare le modifiche genetiche.
Scopo dello studio
- Generare organoidi stabili trasdotti per la ricerca sull'epitelio intestinale.
- Permettere alterazioni genetiche in un modello in vitro.
- Facilitare studi affidabili e riproducibili della biologia intestinale.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione delle cellule HEC 2 93 T con vettori di impacchettamento lentivirali.
- Produzione di particelle lentivirali ad alto titolo.
- Pretattamento degli organoidi con fattori di crescita.
- Trasduzione degli organoidi con lentivirus e incubazione in matrigel.
- Inclusione degli organoidi in paraffina per immunohistochimica.
Risultati principali
- Generazione con successo di organoidi intestinali geneticamente modificati.
- Convalida dell'efficienza di trasduzione mediante RT-PCR quantitativa.
- Analisi dell'espressione genica mediante microarray a RNA.
- Caratterizzazione immunoistochimica delle strutture degli organoidi.
Conclusioni
- La trasduzione lentivirale è un metodo efficace per modificare gli organoidi intestinali.
- Questo approccio fornisce un modello affidabile per lo studio della biologia dell'epitelio intestinale.
- I metodi descritti possono essere applicati a vari studi genetici negli organoidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La trasduzione lentivirale di organoidi intestinali consente una genomica funzionale rapida ed economica in un modello in vitro fisiologicamente rilevante, riducendo la dipendenza dai modelli murini transgenici. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico permettendo una manipolazione genetica precisa in un sistema che mantiene la gerarchia delle cellule staminali intestinali, la polarità e i tipi cellulari differenziati. Il protocollo fornisce un flusso di lavoro scalabile per generare alterazioni genetiche stabili adatte ad analisi quantitative successive, accelerando la scoperta in biologia gastrointestinale e nei settori terapeutici correlati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'espressione inducibile di transgeni o l'abbattimento mediato da shRNA in organoidi intestinali.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio modellando perturbazioni genetiche in un'architettura epiteliale simile a quella naturale.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nei risultati della modulazione del bersaglio preservando la differenziazione omeostatica e la polarità cellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce popolazioni di organoidi transdotti adatti per analisi quantitative di RT-PCR, microarray di RNA e immunohistochimica.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione degli organoidi mediante pretrattamento con fattori di crescita per generare cripte cistiche iperproliferative idonee a una transduzione costante.
- Prontezza del saggio: Consente piattaforme affidabili per screening di composti o genetici mediante reporter fluorescenti o immunohistochimici come EGFP.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Mantiene la biologia dell'epitelio intestinale rilevante per le malattie, supportando l'estrapolazione a modelli in vivo.
- Utilità preclinica: Permette analisi allineate ai biomarcatori mediante processi successivi per il rilevamento di proteine e acidi nucleici.
- Progressione con valutazione del rischio: Consente cicli iterativi di modificazione genetica per ridurre i rischi associati ai bersagli prima della validazione in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, consentendo studi di perturbazione genetica che orientano la selezione del bersaglio e l'ottimizzazione del composto promettente, con risultati che alimentano la validazione preclinica attraverso analisi molecolari e istologiche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi mediante sovraespressione indotta o silenziamento di geni di interesse in un sistema epiteliale polarizzato.
- Screening: Fornisce un'efficienza di trasduzione adatta a letture su larga scala mediante qPCR, microarray o IHC, senza richiedere marcatori di selezione.
- Analisi: Genera dati quantitativi sull'espressione di acidi nucleici e proteine per confrontare condizioni genetiche e valutare l'impatto fenotipico.
- Ricerca traslazionale: Collega le modifiche genetiche a letture funzionali in un contesto simile al tessuto, favorendo la correlazione con biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la modulazione mediata da lentivirus su più bersagli nei modelli di malattie intestinali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora l'affidabilità predittiva modellando gli effetti genetici in un sistema epiteliale fisiologicamente accurato e non trasformato.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso procedure standardizzate di produzione lentivirale e di pretrattamento degli organoidi.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale accelerando i tempi di validazione del target rispetto agli approcci transgenici.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio dei target basata su risultati funzionali in un surrogato tissutale rilevante per l'uomo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella produzione di vettori lentivirali, nella coltura di organoidi e nelle procedure istologiche.
- Presuppone l'accesso a infrastrutture per l'ultracentrifugazione, la microscopia a fluorescenza e l'inclusione in paraffina.
- Necessita di una standardizzazione tra team diversi, tra unità di virologia, coltura cellulare e istologia, per ottenere risultati coerenti.
- Richiede considerazioni adattative qualora si voglia estendere il metodo a organoidi colici o a sistemi derivati da modelli di malattia.
- È limitato dal rendimento degli organoidi e dalla sensibilità ai passaggi di dissociazione enzimatica durante la lavorazione.
