Name: Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri la trasduzione lentivirale di organoidi intestinali primari per studiare l'epitelio intestinale in vitro. Questo metodo consente modifiche genetiche stabili e analisi molecolari affidabili.

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J. Heijmans è supportato da uno stipendio della Fondazione olandese per il cancro (KFW). G.R. van den Brink è supportato da finanziamenti del Consiglio Europeo della Ricerca nell'ambito del Settimo Programma Quadro della Comunità Europea (FP7/2007-2013)/Accordo di sovvenzione del Consiglio Europeo della Ricerca numero 241344 e da una sovvenzione VIDI dell'Organizzazione Olandese per la Ricerca Scientifica (GvdB).

1. Preparazione di polietilenimmina (PEI) come Transfection Reagent <ol><li> Disciogliere circa 150 mg di PEI in 100 ml di H 2 O. </li><li> Regolare soluzione a pH 7.4 con l&#39;aggiunta di HCl fino soluzione diventa chiara e mescolare fino a completa dissoluzione. Questo può richiedere tra 10 e 60 min e aggiungere acqua ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. </li><li> Quando chiaro, filtrare la soluzione PEI attraverso sterile filtro da 0,22 micron e conservare in un -80 ° C freezer in aliquote di 5 ml. </li></ol> 2. Produzione di particelle lentivirali Giorno 1: <ol><li> HEK293T cellule Spalato al 60% -80% di confluenza in 162 cm 2 fiasco o grande Petri in linea cellulare terreno di coltura (DMEM supplementato con 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina e integratore di glutammina 2 mm). </li></ol> 2 ° giorno: <ol start="2"><li> Preparare la soluzione trasfezione di DNA contenente 45 mg di DNA totale plasmide sommandovettori lentivirali imballaggio (7 mg di pVSVg, 5 mcg di pRSV giri; 13 mcg di pMDL) e 20 microgrammi di plasmide lentivirali codificanti del gene di interesse o shRNA di interesse. Regolare ad un volume di 1 ml utilizzando DMEM. </li><li> Preparare la soluzione trasfezione PEI aggiungendo 90 ml di 1 mg / ml PEI a 930 ml di DMEM e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere la soluzione trasfezione DNA soluzione PEI. Vortex o invertire un numero di volte e incubare per 5 min a temperatura ambiente per ottenere una soluzione trasfezione di DNA. </li><li> Drip 2 ml della soluzione di trasfezione di DNA sulle cellule HEK293T e incubare per 4 ore in un incubatore umidificato coltura cellulare da 37 ° C. </li><li> Dopo 4 ore, aggiornare il terreno di coltura per rimuovere PEI. Non è necessario lavare cellule prima di aggiungere nuovo mezzo. NOTA: PEI è citotossici e di incubazione più di 4 ore può causare danni alle cellule HEK293T. </li></ol> 4 ° giorno: <ol start="7"><li> Sostituire supernatant con il nuovo terreno di coltura. Tenere surnatante (contenente virus); questo sarà usato nella fase 2.10. </li><li> Mettere surnatante in 15 ml pallone. Per rimuovere le cellule morte, centrifugare per 5 min a 500 x g. </li><li> Spingere surnatante tramite 0,45 micron filtro con una grossa siringa da 60 ml. Conservare notte a 4 ° C. </li></ol> 5 ° giorno: <ol start="10"><li> Raccogliere il secondo lotto di surnatante; centrifuga e filtro come in passaggi 2,8-2,9. </li><li> Pool il surnatante da passi 2.9 e 2.10 in tubi ultracentrifuga e centrifugare a 50.000 xg in un&#39;ultracentrifuga per 90 min. </li><li> Estrarre capsule contenenti attentamente le provette ultracentrifuga e messo in una cappa a flusso laminare, ricordando l&#39;orientamento del tubo all&#39;interno della centrifuga. </li><li> Aprire capsula tenendo il tubo un&#39;ultracentrifuga e medie decantare attentamente in modo tale che il pellet è sul lato superiore del tubo. Dal pellet virale può essere difficile da visualizzare, ricordare su qualilato del tubo un pellet sarà formata. Prendere una micropipetta e rimuovere ultimo bit di media facendo attenzione a non agitare il pellet marrone opaco che è visibile sul lato del fondo del tubo ultracentrifuga. </li><li> Risospendere questo pellet in 500 ml di terreno di coltura organoide integrati con nicotinamide 10 mm, 10 micron Chir99021, 10 micron Y27632 e 8 mg / ml polibrene. Risospensione in questo mezzo è importante poiché virus titolo elevato viene utilizzato per transduct direttamente organoidi. </li><li> Facoltativamente: congelare il virus in questo mezzo frazionato in due lotti di 250 microlitri a -80 ° C. </li></ol> 3. lentivirali trasduzione di organoidi Giorno 0: <ol><li> Dividere una completa 0,95 centimetri 2 e di organoidi due giorni prima trasduzione in un nuovo pozzo, al fine di ottenere circa 50 piccoli organoidi. Split organoidi secondo il protocollo precedentemente pubblicato 1 (Figura 3A, B). </li><li> Supplemento organoide mezzo di coltura con 10 micron Chir99021 e nicotinamide 10 mm per ottenere iper cistica cripte proliferative (Figura 3C). NOTA: cripte cistica svilupperanno meglio quando organoidi appena divisi sono coltivati ​​in presenza di Chir99021. </li></ol> 2 ° giorno: <ol start="3"><li> Organoidi Harvest pipettando su e giù per il matrigel e media, interrompendo in tal modo il composto con una micropipetta p1000. Posizionare la miscela in una provetta da 15 ml. </li><li> Disrupt ulteriormente utilizzando Pasteur pipetta in cui l&#39;apertura distale è stato diminuito da fusione. Organoidi centrifuga a pellet per 5 min a 100 x g. NOTA: A seconda della dimensione della centrifuga, utilizza una velocità di centrifuga diversa. È necessario trovare l&#39;esatta velocità in cui interrotte organoidi sono separati dalla miscela. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 ml di tripsina preriscaldata 1x (simile al 0,25% tripsina). Risospendere organoidi in tripsina e incubare3 min in un bagno di 37 ° C dell&#39;acqua. </li><li> Inattivare tripsina aggiungendo 3,5 ml di terreno di coltura linea cellulare (DMEM supplementato con 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina e glutammina). Centrifugare per 5 min a 500 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante di lasciare pellet in circa 20 ml di media. Trasferire i organoidi in questa ultima piccola quantità di mezzo in un pozzo in un piatto di 48 pozzi. </li><li> Aggiungi alto lentivirus titolo nel medio trasduzione come descritto al punto 2.14, risospendere e continuare con il passo 3.10. Quando incontra bassa efficacia di trasduzione, punto 3.9 possono essere aggiunti. NOTA: Per la trasduzione efficiente, tipicamente aggiungere un&#39;aliquota di 250 microlitri di alta lentivirus titolo ad un pozzetto di organoidi. Questo rappresenta il 50% di tutti i lentivirus raccolti da una singola produzione come descritto al punto 2 di questo protocollo. </li><li> Facoltativamente: per migliorare l&#39;efficacia trasduzione, effettuare spinoculation mettendo 48 pozzetti contenente organoidi in un pre-riscaldato centrifuga da 326; C e ruotare a 600 xg per 1 ora. </li><li> Mettere miscela organoide-virus in cultura incubatore e incubare per 1 ora a 37 ° C in un incubatore culturale per consentire trasduzione. </li><li> Facoltativamente: per migliorare ulteriormente l&#39;efficacia di trasduzione, incubare organoidi Per ulteriori 3 ore a 37 ° C in un incubatore cultura. </li><li> Aggiungere 1 ml di terreno di coltura organoide e risospendere la miscela organoide-virus, il trasferimento in una provetta e centrifugare in una microcentrifuga per 5 minuti a 850 xg per far sedimentare organoidi. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 20 ml di Matrigel ghiacciata. Poiché il materiale solidifica quando diventa caldo, utilizzare puntali che vengono refrigerati pipettando su e giù ghiacciata PBS per un numero di volte. </li><li> Mettere la goccia nel mezzo di un pozzetto in una piastra 48 pozzetti e incubare in coltura incubatore a 37 ° C per 15 minuti per solidificare. </li><li> Dopo 15 minuti, aggiungere con cautela 250 ml di terreno di coltura organoide integrato conNicotinamide 10 mM, 10 mM Chir99021 e 10 pM Y27632. Piccoli frammenti organoide perturbato formeranno in piccoli organoidi cistica entro 24 ore. </li></ol> 5 ° giorno: <ol start="16"><li> Aggiorna medio e integrare con un antibiotico selezione (per puromicina, utilizzare 4 mg / ml). </li></ol> 7 ° giorno: <ol start="17"><li> Sostituire mezzo per terreno di coltura organoide serie, integrato con la selezione antibiotica. NOTA: in erba sarà completa di 2-3 settimane dopo Chir99021 ritiro. Dopo la selezione, organoidi possono essere coltivate senza selezione antibiotica. </li></ol> 4. organoide RNA Preparazione quantitativa RT-PCR o Microarray <ol><li> Per la preparazione di RNA, utilizzare un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Rimuovere il supporto da organoidi e aggiungere 350 ml di tampone RLT, integrati con β-mercaptoetanolo dritto sulla cupola di Matrigel contenente organoidi. Risospendere le Material in RLT pipettando utilizzando p1000 micropipetta. </li><li> Eseguire inoltre RNA preparazione secondo il protocollo del produttore. </li><li> Facoltativamente: aumentare la resa di RNA mediante amplificazione utilizzando il sistema Ovation Pico WTA, richiede input iniziale di 50 mg di RNA totale secondo il protocollo del produttore. </li><li> Facoltativamente: per il controllo di qualità prima di RNA microarray, campioni eseguito su un bioanalizzatore 2100 con un totale di chip eucariote RNA nano, puntando per un numero di integrità dell&#39;RNA (RIN) di 8.5 o più (Figura 5) secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 5. TRATTAMENTO organoidi per paraffina e immunoistochimica <ol><li> Prima di iniziare organoide incorporamento pre-riscaldare un blocco di alluminio con fori 12 millimetri tubi di vetro di diametro montaggio in incubatore a 70 ° C per mantenere la paraffina liquida. </li><li> Prendete un singolo bene con organoidi pienamente sviluppati e rimuovere il supporto, lasciando intatte le organoidi incorporati. </li><li> Aggiungere 1 mldel 4% paraformaldeide in PBS dritto al bene e fissare a 4 ° C ovunque da 1 ora a notte. </li><li> Sostituire paraformaldeide con 1 ml di ghiaccio freddo PBS. Facoltativamente: mantenere organoidi fissi in PBS fino a 1 settimana a 4 ° C dopo questo passaggio. </li><li> Risospendere organoidi fissi in 1 ml di PBS e riporre in flacone di vetro. </li><li> Let organoidi depositano inferiore per 1 min, decantare PBS e sostituire con il 70% di etanolo in cui una coppia di goccioline di soluzione eosina vengono sciolti per consentire la visualizzazione del organoidi tutto il processo di incorporazione. </li><li> Lasciare organoidi in etanolo al 70% a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, rimuovere il 70% di etanolo con attenzione decantazione, essendo in grado di visualizzare i organoidi occhio a causa del leggero colore rosato eosina. Sostituire soluzione incasso con 96% di etanolo. </li><li> Ripetere passaggio 5.7, ogni volta sostituendo la soluzione incorporamento con la successiva. Passare organoidi attraverso le seguenti soluzioni successivamente: il 70% etanolo, 90% etanolo, 96% etanolo, 100% ethanol, 100% etanolo, xilene, xilene. </li><li> Decantare l&#39;ultimo lavaggio xilene e versare la paraffina nel tubo. Inserire il tubo immediatamente nel blocco di alluminio pre riscaldato a 70 ° C per 30 min e sostituire paraffina con paraffina nuova pulita. </li><li> Versare la paraffina off e pipette organoidi nello stampo blocco di paraffina con una pipetta Pasteur preriscaldata con grande apertura. Mantenere Pasteur pipetta calda usando un becco Bunsen. Mettere tutti organoidi nello stampo blocco di paraffina in un piccolo strato di paraffina liquida. </li><li> Per quanto possibile, cercare di manipolare tutti organoidi verso il centro dello stampo blocco di paraffina utilizzando un ago dissezione riscaldato. Mantenere dissezione ago calda usando becco Bunsen. </li><li> Quando localizzazione organoidi nello stampo è soddisfacente, conchiglia leggermente a solidificare lo strato di paraffina. </li><li> Termina il blocco versando più di paraffina sulla parte superiore e aggiungere una cassetta embedding istologico standard. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo video corrente descrive trasduzione lentivirale di organoidi da epitelio intestinale primaria e l&#39;analisi a valle di queste organoidi utilizzando tecniche RNA quantitative e immunoistochimica. Trasduzione lentivirali è spesso eseguita in cellule aderenti o galleggianti in piastre di coltura. Poiché la struttura tridimensionale di organoidi li rende difficile da penetrare da particelle virali, sono utilizzati diversi metodi per aumentare l&#39;efficacia. Pretrattamento di or...

L&#39;epitelio intestinale è uno dei tessuti corporei più rapida proliferazione, che ha causato di attrarre grande interesse dalla ricerca sulle cellule tumorali e staminali. Nel 2009 una tecnica è stata pubblicata per generare culture durevoli di piccole cripte intestinali in matrigel, conservando una struttura dimensionale 3 1. Tali strutture, denominate organoidi intestinali, possono essere coltivate utilizzando tecniche standard, con circostante medio integrato con una serie di fattori di crescita definiti, compreso il BMP-segnalazione inibitore pathway zucca (Nog), il Wnt-via di segnalazione enhancer rspondin 1 (Rspo1) e fattore di crescita epidermico (EGF) tutto ha trovato per migliorare la proliferazione intestinale 2-4. Organoidi superano linee tradizionali di cellule di cancro negli aspetti che sono non-mutato, hanno mantenuto la gerarchia di cellule staminali, mostrano la polarizzazione cellulare intatta e la differenziazione mostra in tutte le linee cellulari presenti nel piccolo int nascenteepitelio estinal. Dal momento che possono essere trasdotte per trasportare transgeni o RNA interference costruisce 5, vengono utilizzati per studiare elementi genetici specifici, compensa esperimenti con topi transgenici in aspetti di costo e di velocità. Espressione transgenica in organoidi può essere eseguita utilizzando retrovirale murino o vettori lentivirali 6,7. A causa delle limitazioni di retrovirus murini, in grado di trasduzione cellule mitotiche esclusivamente 8, trasduzione lentivirali viene più frequentemente utilizzata per le celle che sono difficili da infettare, come organoidi. Viralmente trasdotte e esprimono stabilmente organoidi transgenici possono essere usati per una moltitudine di analisi a valle, tra cui RNA quantitativo analisi ed immunoistochimica. Nel loro insieme, la cultura di organoidi da cellule epiteliali intestinali primarie si è evoluto in una tecnica di routine che è facile da implementare, senza requisiti specifici di laboratorio, ed è diventato il romanzo standard cecultura ll nella ricerca sul epitelio intestinale. Tecniche di trasduzione virale e successiva analisi a valle in organoidi sono noiosi da eseguire e per aiutare gli esperimenti organoide abbiamo generato questo protocollo video, che mostra i metodi per lentivirali trasduzione del organoidi coltivate. Mostriamo inoltre come la corretta elaborazione del organoidi può aumentare la resa e quindi migliorare le prestazioni di analisi a valle con tecniche di RNA o immunoistochimica. Nel protocollo, organoidi che sono derivati ​​da piccole cripte intestinali sono stati usati esclusivamente, sebbene le tecniche descritte possono essere applicate a organoidi colon pure.

<table><tbody><tr><td>Polietilene immina</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil cisteina</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>mouse Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>polibrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-mercaptoetanolo</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA system</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>fiala di vetro conica 12&nbsp; mm x 75&nbsp; mm 5&nbsp; ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eosina giallastra</td><td>VWR</td><td>1,159,350,025</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Le strutture cripto-villi intestinali, denominate organoidi, possono essere mantenute in coltura sostenuta tridimensionalmente se integrate con i fattori di crescita appropriati. Poiché gli organoidi sono molto simili al tessuto originale in termini di differenziazione delle cellule staminali omeostatiche, polarità cellulare e presenza di tutti i tipi di cellule terminalmente differenziate note all'epitelio intestinale adulto, essi costituiscono una risorsa essenziale nella ricerca sperimentale sull'epitelio. La possibilità di esprimere transgeni o RNA interferenti utilizzando vettori lentivirali o retrovirali in organoidi ha aumentato le opportunità per l'analisi funzionale dell'epitelio intestinale e delle cellule staminali intestinali, superando i tradizionali transgenici di topo in termini di velocità e costi. Nell'attuale protocollo video mostriamo come utilizzare la trasduzione di organoidi intestinali tenue con vettori lentivirali, illustrata dall'uso di transgeni inducibili dalla doxicilina o di RNA a forcina corta inducibile da IPTG per la sovraespressione o il knockdown genico. Inoltre, considerando che la coltura di organoidi produce una conta cellulare minima che può anche essere ridotta da un trattamento sperimentale, spieghiamo come trattare gli organoidi per l'analisi a valle finalizzata a RT-PCR quantitativa, RNA-microarray e immunoistochimica. Le tecniche che consentono l'espressione transgenica e il knock down genico negli organoidi intestinali contribuiscono al potenziale di ricerca di queste strutture epiteliali intestinali, stabilendo la coltura di organoidi come un nuovo standard nelle colture cellulari.

Organoide trasduzione lentivirali La tecnica di trasduzione organoide utilizzando particelle lentivirali dipende corretta gestione dei organoidi prima e durante la trasduzione. Organoidi (Figura 3A) sono state coltivate e furono interrotto in cripte singoli (Figura 3B). Come riportato in precedenza, queste singole cripte, quando coltivate in presenza dell&#39;inibitore GSK3 Chir99021 divennero cripte cistiche 9 (Figura 3C).</stron...

In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è generare organoidi strettamente trasdotti a partire dall'epitelio intestinale primario di topo, per successivi analisi sugli organoidi intestinali. Questo viene ottenuto innanzitutto tramite la trasfezione delle cellule HEC 2 93 T con vettori di impacchettamento lentivirali e un plasmide lentivirale, che codifica per il gene d'interesse, al fine di produrre particelle lentivirali ad alto titolo. Il secondo passaggio consiste nel pretrattare gli organoidi intestinali di topo coltivati con una serie di fattori di crescita per ottenere cripte cistiche iperproliferative.Successivamente, trasdurre gli organoidi con lentivirus ad alto titolo e incubare gli organoidi trasdotti in matrigel. L'ultimo passaggio consiste nell'includere gli organoidi trasdotti completamente sviluppati in paraffina per l'analisi immunohistochimica successiva. In definitiva, la trasduzione degli organoidi con lentivirus viene utilizzata per generare alterazioni genetiche in un modello in vitro dell'epitelio intestinale che è affidabile, riproducibile e rapido.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le linee cellulari tumorali, è che gli organoidi rappresentano una gerarchia di cellule staminali non mutate e mantenute. A livello cellulare, la polarizzazione consente loro di differenziarsi in tutti i diversi tipi cellulari dell'epitelio intestinale tenue. Inoltre, gli organoidi transdotti possono essere utilizzati per studiare elementi genetici specifici, superando così l'uso di topi transgenici per quanto riguarda costi e velocità.La produzione di particelle lentivirali è un protocollo di cinque giorni che inizia con la suddivisione delle cellule HEC 2 93 T fino a una confluenza del 60-80% in un fiasco da 162 centimetri quadrati in mezzo di coltura cellulare. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 gradi Celsius nel giorno successivo. Preparare la soluzione di trasfezione del DNA e la soluzione di trasfezione con polietileneammina o PEI come descritto nel testo del protocollo.Aggiungere la soluzione di trasfezione del DNA alla soluzione di PEI e vortexare o invertire più volte, quindi incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere per gocciolamento due millilitri della soluzione di trasfezione del DNA più PEI sulle cellule HEC 293T e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius dopo quattro ore.Aggiornare il mezzo di coltura. Per rimuovere il PEI, incubare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius al quarto giorno, raccogliere il soprannatante in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere nuovo mezzo di coltura alle cellule e reinserire la fialca nell'incubatore. Centrifugare il soprannatante raccolto a 500 G per cinque minuti.Per rimuovere le cellule morte, utilizzare quindi una grossa siringa da 60 millilitri per far passare il SUPERNAT attraverso un filtro da 0,45 micrometri. Conservare il supernatante filtrato durante la notte a quattro gradi Celsius e raccogliere il secondo lotto di supernatante il giorno seguente, centrifugandolo e filtrandolo come mostrato per il primo lotto.Riunire i due lotti di supernatante in provette per ultracentrifuga. Centrifugare a 50.000 ×g per 90 minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere con molta attenzione le capsule contenenti le provette per ultracentrifuga e posizionarle all'interno di una cappa a flusso laminare.Aprire la capsula contenente il tubo dell'ultracentrifuga e versare con attenzione il mezzo, mantenendo il pellet sul lato superiore del tubo. È importante ricordare da quale lato del tubo si sarebbe formato il pellet, poiché potrebbe essere difficile da visualizzare. Successivamente, utilizzare una micropipetta per rimuovere l'ultima quantità di mezzo, avendo cura di non disturbare il pellet marrone opaco visibile sul lato inferiore del tubo dell'ultracentrifuga.Sospendere nuovamente questo pellet in 500 microlitri di mezzo di coltura per organoidi integrato con inibitori della nicotinamide chinasi e poli-brain resus. La sospensione in questo mezzo è importante poiché verrà utilizzato direttamente un virus ad alto titolo per la trasduzione degli organoidi due giorni prima della trasduzione. Suddividere un intero pozzetto di 0,95 centimetri quadrati di organoidi in un nuovo pozzetto di una piastra a 48 pozzetti.Seguendo un protocollo precedentemente pubblicato. Obiettivo: ottenere circa 50 organoidi di piccole dimensioni nella coltura di organoidi. Mezzo integrato con un inibitore della glicogeno sintasi chinasi e nicotinamide.Per ottenere cripte cistiche iperproliferative. Incubare gli organoidi per due giorni nel giorno della raccolta dopo la trasduzione, utilizzando una micropipetta P1000. Pipettare su e giù il Matrigel e il mezzo, interrompendo così la miscela.Posizionare la miscela in un tubo da 15 millilitri. Disgregare ulteriormente la miscela utilizzando una pipetta PES in cui l'apertura distale è stata ridotta per fusione. Pellettizzare gli organoidi centrifugando a 100 G per cinque minuti. Quindi rimuovere il soprannatante e aggiungere 500 microlitri di tripsina preriscaldata 1x; risospendere gli organoidi e incubare per tre minuti.In un bagno a 37 gradi Celsius, inattivare la tripsina aggiungendo 3,5 millilitri di mezzo di coltura della linea cellulare e centrifugare per cinque minuti a 500 G. Rimuovere il soprannatante lasciando il pellet in circa 20 microlitri di mezzo. Trasferire gli organoidi in questa ultima piccola quantità di mezzo in una pozzetta.In una piastra a 48 pozzetti, aggiungere il lentivirus ad alto titolo precedentemente preparato nel mezzo di trasduzione agli organoidi e risospendere. Incubare la miscela organoide-virus per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore da coltura per consentire la trasduzione; dopo un'ora, aggiungere un millilitro di mezzo di coltura per organoidi alla miscela organoide-virus, risospendere e trasferire la miscela in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare a 850 ×g per cinque minuti.Per pellettizzare gli organoidi, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet. In 20 microlitri di gel di matrice freddo, posizionare la goccia al centro di una pozzetta di una piastra a 48 pozzette e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Perché la goccia si solidifichi dopo 15 minuti. Aggiungere con attenzione 250 microlitri di coltura di organoidi. Mezzo integrato con nicotinamide e inibitori della chinasi.Riscaldare in anticipo un blocco di alluminio in un incubatore a 70 gradi Celsius per mantenere il paraffina liquida. Rimuovere il mezzo da un singolo pozzetto contenente organoidi completamente sviluppati, lasciando gli organoidi incorporati intatti, e aggiungere un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS direttamente nel pozzetto. Sostituire la paraformaldeide con un millilitro di PBS.Risospendere gli organoidi fissati nel PBS e trasferirli in un vial di vetro. Lasciare sedimentare gli organoidi sul fondo per un minuto. Successivamente, aspirare il PBS e sostituirlo con etanolo al 70%, in cui sono state disciolte alcune gocce di soluzione di eosina.Per consentire la visualizzazione degli organoidi durante tutto il processo di inclusione, lasciare gli organoidi in etanolo al 70% a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere l'etanolo al 70% pipettando con attenzione. Gli organoidi possono essere visualizzati ad occhio nudo grazie al colore rosa chiaro dell'eosina.Sostituire la soluzione di inclusione con etanolo al 96% e lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti in questo modo. Successivamente, passare gli organoidi attraverso etanolo al 70%, etanolo al 90%, etanolo al 96%, etanolo al 100%, etanolo al 100%, xilene e xilene. Decantare l'ultimo lavaggio con xilene e versare la paraffina nel vial di vetro.Mettere immediatamente il vial nel blocco di alluminio preriscaldato a 70 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, sostituire il paraffina con paraffina pulita e preriscaldata, utilizzando un PE o una pipetta preriscaldata. Versare via la paraffina e utilizzare una spatola o pipetta preriscaldata con un'apertura larga per trasferire gli organoidi nello stampo per blocchi di paraffina, immergendoli in uno strato di paraffina liquida.Riscaldare un ago da dissezione con un becco di Bunsen e posizionare tutti gli organoidi il più possibile al centro dello stampo per inclusione in paraffina. Quando la localizzazione degli organoidi nello stampo è soddisfacente, raffreddare leggermente lo stampo per solidificare lo strato di paraffina. Completare la preparazione del blocco versando ulteriore paraffina sulla superficie e aggiungere una cassetta standard per inclusione istologica.In questo protocollo, gli organoidi dell'epitelio intestinale sono stati trasdotti con lentivirus. Gli organoidi normali crescono come strutture cripto-villositarie con un numero di cripte che si sviluppano a partire da un dominio villare condiviso. Dopo il trattamento di questi organoidi con l'inibitore GSK-3β CHIR 99021, la proliferazione aumenta e le cripte diventano cistiche a seguito della trasduzione degli organoidi.Utilizzando un'overespressione lentivirale di EGFP, gli organoidi esprimono una fluorescenza EGFP, pertanto passaggi di potenziamento della trasduzione, come l'inoculazione o un'incubazione virale prolungata, non sono necessari poiché non aumenterebbero l'efficacia già elevata. Successivamente, questi organoidi vengono sottoposti a tecniche di RNA e a immunohistochimica. Questa immagine rappresentativa mostra una sezione di un organoide intestinale di topo, colorata per BRDU dopo un'incubazione con BRDU di un'ora prima della fissazione.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasdurre organoidi dall'epitelio intestinale primario utilizzando particelle lentivirali o retrovirali.

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