Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare organoidi trasdotti stabilmente dall'epitelio intestinale primario di topo per l'analisi a valle degli organoidi intestinali. Ciò si ottiene effettuando prima il sezionamento di cellule T HEC 2 93 con vettori di imballaggio lentivirali e plasmidi lentivirali, codificando il gene di interesse per produrre particelle lentivirali ad alto titolo. Il secondo passo consiste nel pretrattare organoidi intestinali di topo in coltura con una serie di fattori di crescita per ottenere cripte iper proliferative cistiche.

Successivamente, trasdurre gli organoidi con il lentivirus ad alto titolo e incubare gli organoidi trasdotti in matrigel. Il passaggio finale consiste nell'incorporare organoidi trasdotti adulti in paraffina per l'analisi immunoistochimica a valle. In definitiva, la trasduzione dell'organoide lentivirale viene utilizzata per generare alterazioni genetiche in un modello in vitro dell'epitelio intestinale che è affidabile, riproducibile e veloce.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le linee cellulari tumorali, è che gli organoidi sono gerarchie di cellule staminali spostate non mutate. Nella polarizzazione cellulare del testo, può differenziarsi in tutti i diversi tipi di cellule dell'epitelio dell'intestino tenue. Inoltre, gli organoidi trasdotti possono essere utilizzati per studiare specifici elementi genetici, superando così l'uso di topi transgenici e gli aspetti del costo e della velocità.

La produzione di particelle lentivirali è un protocollo di cinque giorni che inizia con la scissione delle cellule T HEC 2 93 al 60-80% di fluenza di co in un pallone di 162 centimetri quadrati in terreno di coltura cellulare. Incubare le cellule per una notte in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Preparare la soluzione di trasfezione del DNA e la soluzione di trasfezione di polietilene ammina o PEI come descritto nel testo del protocollo.

Aggiungere la soluzione di trasfezione del DNA al vortice della soluzione PEI o capovolgere un certo numero di volte e incubare per cinque minuti. A temperatura ambiente. Versare due millilitri della soluzione di DNA TRANSFECTION più PEI sulle cellule T HEC 2 93 e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius dopo quattro ore.

Aggiornare il terreno di coltura. Per rimuovere il PEI, incubare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius il quarto giorno, raccogliere il surnatante in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere nuovo terreno di coltura alle cellule e rimettere il pallone nell'incubatore, centrifugare il surnatante raccolto a 500 Gs per cinque minuti.

Per rimuovere le cellule morte, utilizzare una grande siringa da 60 millilitri per spingere SUPERNAT attraverso un filtro da 0,45 micrometri. Conservare il supernat filtrato durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Raccogliere la centrifuga e filtrare il secondo lotto di surnatante come mostrato per il primo lotto.

Raggruppare i due lotti di surnatante in provette da ultra centrifuga. Centrifugare a 50.000 GS per 90 minuti. Al termine della centrifugazione, con molta attenzione, rimuovere le capsule contenenti le provette da ultra centrifuga e metterle in una cappa a flusso laminare.

Aprire la capsula che contiene la provetta dell'ultra centrifuga e decantare accuratamente il terreno con il pellet sul lato superiore della provetta. È importante ricordare da che parte del tubo si sarebbe formato l'appellativo, poiché i pellet virali possono essere difficili da visualizzare. Quindi, utilizzare una micropipetta per rimuovere l'ultimo pezzetto di terreno facendo attenzione a non agitare il pellet marrone opaco visibile sul lato del fondo della provetta dell'ultracentrifuga.

Risospendere questo pellet in 500 microlitri di terreno di coltura di organoidi integrato con inibitori della nicotinamide chinasi e resur cerebrale poli. La sospensione in questo mezzo è importante poiché il virus ad alto titolo verrà utilizzato direttamente per la trasduzione degli organoidi due giorni prima della trasduzione. Dividere un pozzetto completo di organoidi di 0,95 centimetri quadrati in un nuovo pozzetto di una piastra da 48 pozzetti.

Seguendo un protocollo precedentemente pubblicato. Obiettivo di ottenere circa 50 piccoli organoidi in coltura di organoidi. Terreno integrato con un inibitore della glicogeno sintasi chinasi e nicotinamide.

Per ottenere cripte iper proliferative cistiche. Incubare gli organoidi per due giorni il giorno della trasduzione, raccogliere gli organoidi con una micropipetta P 1000. Pipettare il gel matra e il terreno su e giù, interrompendo così la miscela.

Mettere il composto in un tubo da 15 millilitri. Interrompere ulteriormente la miscela utilizzando una pipetta PE in cui l'apertura distale è stata ridotta fondendo in pellet gli organoidi centrifugando a 100 Gs per cinque minuti. Quindi rimuovere il surnatante a 500 microlitri di preriscaldare una x tripsina e risospendere gli organoidi in cova per tre minuti.

In un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, inattivare la tripsina aggiungendo 3,5 millilitri di centrifuga di terreno di coltura cellulare per cinque minuti. A 500 Gs.Rimuovere il super natan per lasciare il pellet in circa 20 microlitri di terreno. Trasferire gli organoidi in quest'ultima piccola quantità di terreno in un pozzetto.

Su una piastra da 48 pozzetti. Aggiungere agli organoidi il lentivirus ad alto titolo precedentemente preparato in mezzo di trasduzione e risospendere. Incubare la miscela di organoidi virali per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura per consentire la trasduzione dopo un'ora, aggiungere un millilitro di organoidi di coltura, mezzo alla miscela di organoidi virali, risospendere e trasferire la miscela in una microcentrifuga a 850 GS per cinque minuti.

Per pellettare gli organoidi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet. In 20 microlitri di gel matra ghiacciato, metti la gocciolina al centro di un pozzo. In una piastra da 48 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Affinché la gocciolina si solidifichi dopo 15 minuti. Aggiungere con cura 250 microlitri di coltura di organoidi. Terreno integrato con nicotinamide e inibitori delle chinasi.

Preriscalda un blocco di alluminio in un'incubatrice a 70 gradi Celsius per mantenere la paraffina liquida. Rimuovere il terreno da un singolo pozzetto con organoidi adulti lasciando intatti gli organoidi incorporati e aggiungere un millilitro di aldeide paraforme al 4% in PBS direttamente al pozzetto. Sostituire l'aldeide paraforme con un millilitro di PBS.

Risospendere gli organoidi fissati nel PBS e trasferirli in una fiala di vetro. Lasciate che gli organoidi affondino sul fondo per un minuto. Quindi, pipettare il PBS e sostituirlo con etanolo al 70% in cui sono disciolte un paio di goccioline di soluzione di eoina.

Per consentire la visualizzazione degli organoidi durante il processo di inclusione, lasciare gli organoidi in etanolo al 70% a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere l'etanolo al 70% pipettandolo accuratamente. Gli organoidi possono essere visualizzati ad occhio grazie al colore eoin rosato.

Sostituire la soluzione di inclusione con etanolo al 96% e lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti in questo modo. Successivamente, passare gli organoidi attraverso etanolo al 70%, etanolo al 90%, etanolo al 96%, etanolo, etanolo, 100% etanolo, xilene e xilene. Decantare l'ultimo lavaggio con xilene e versare la paraffina nella fiala di vetro.

Mettere immediatamente la fiala nel blocco di alluminio preriscaldato a 70 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, sostituire la paraffina con una nuova paraffina pulita con un preriscaldamento, PE o pipetta. Versare la paraffina e utilizzare un parassita preriscaldato o una pipetta con un'ampia apertura per pipettare gli organoidi nello stampo a blocchi di paraffina in uno strato di paraffina liquida.

Scaldare un ago da dissezione con un bruciatore bunsen e manipolare tutti gli organoidi il più possibile verso il centro dello stampo a blocchi di paraffina. Quando la localizzazione degli organoidi nello stampo è soddisfacente, raffreddare leggermente lo stampo per solidificare lo strato di paraffina. Termina il blocco versando altra paraffina sopra e aggiungi una cassetta di inclusione istologica standard.

In questo protocollo, gli organoidi dell'epitelio intestinale sono stati trasdotti con lentivirus. Gli organoidi normali crescono come strutture villose della cripta K con un numero di cripte che escono da un dominio villoso condiviso. Dopo il trattamento di questi organoidi con l'inibitore GSK 3 B, CHIR 9 9 0 21, la proliferazione aumenta e le cripte diventano cistiche dopo la trasduzione dell'organoide.

Utilizzando la sovraespressione lentivirale di EGFP, gli organoidi esprimono fasi fluorescenti di miglioramento della trasduzione di EGFP che possono essere eseguite quando l'efficacia della trasduzione è bassa, come l'inoculazione o l'incubazione virale prolungata non sono richieste, poiché queste fasi non aumenteranno la già elevata efficacia. Successivamente, questi organoidi vengono processati per le tecniche di RNA e l'immunoistochimica. Questa immagine rappresentativa è una sezione di un organoide intestinale di topo, colorato per BRDU dopo l'incubazione con BRDU per un'ora prima del fissaggio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasdurre organoidi dall'epitelio intestinale primario utilizzando particelle lentivirali o retrovirali.