La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

L'obiettivo generale di questo procedimento è visualizzare l'attività del ciclo cellulare nei cardiomiociti postnatali e determinare la loro nuclearità. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione cardiaca, come ad esempio se un cardiomiocita si divide effettivamente o semplicemente aumenta il suo grado di ploidia o diventa multinucleato. I principali vantaggi di questa tecnica sono la possibilità di visualizzare la fase M del ciclo cellulare con elevata risoluzione spaziotemporale e l'identificazione dei nuclei dei cardiomiociti mediante fluorescenza.

La procedura sarà dimostrata da Patricia Freitag, una tecnica del nostro laboratorio. Se si utilizzano coppie di accoppiamento non omozigoti, identificare innanzitutto i cuori transgenici mediante microscopia fluorescente per verificare l'espressione di EGFP analin e H2B-mCherry. I segnali nucleari di EGFP analyin possono essere rilevati più facilmente ai margini degli atri focalizzando attraverso i diversi strati del tessuto.

Per isolare i cardiomiociti, posizionare il numero appropriato di cuori in provette da reazione da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di mix enzimatico da un kit di dissociazione del cuore neonatale e tagliare i cuori in piccoli pezzi con forbici. Successivamente, trasferire la soluzione in provette da reazione da 15 millilitri. Posizionare la provetta in posizione quasi orizzontale a 37 gradi celsius per 15 minuti, mescolando il tessuto da cinque a dieci volte con una pipetta da cinque millilitri alla fine dell'incubazione.

Al termine della terza digestione, arrestare la reazione con 7,5 millilitri di mezzo due e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Risciacquare il filtro cellulare con tre millilitri di mezzo due, unendo il risciacquo alle cellule raccolte, e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Ri-sospendere il pellet in 500 microlitri di mezzo uno per il conteggio.

Quindi, seminare una volta dieci alla quarta cellule per pozzetto in 120 microlitri di mezzo uno in una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e centrifugare le cellule prima della loro coltura notturna in un incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, la maggior parte dei cardiomiociti dovrebbe essere in contrazione. Prima di iniziare la trasfezione, pulire il banco di lavoro e tutti i materiali per la trasfezione con soluzione decontaminante per RNAsi per rimuovere qualsiasi RNAsi.

Una volta pronti tutti i materiali, aggiungere 20 microlitri di mix di siRNA appena preparato in ogni pozzetto e rimettere le cellule nell'incubatore per 48 ore. Dopo due giorni, sostituire il sopranatante in ogni pozzetto con 120 microlitri di mezzo uno e rimettere le cellule nell'incubatore per almeno altre 24 ore. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule una volta con PBS, seguito da fissazione in soluzione di formaldeide al 4% per 20 minuti.

Per analizzare le cellule mediante microscopia confocale in tempo reale, trasferire la piastra sul palchetto del microscopio confocale e avviare il software di acquisizione. Aprire le impostazioni di A1plus e selezionare le caselle del canale uno, due, tre e quattro. Nel menu a discesa, impostare il canale uno su DAPI, il canale due su eGFP, il canale tre su RFP e il canale quattro su Cy5.

Fare clic sul voltaggio del canale e utilizzare le barre di scorrimento per impostare il voltaggio a 80 per ogni canale. Utilizzare le barre di scorrimento per impostare l'offset a zero e fare clic sul pulsante home per posizionare il pinhole nella posizione iniziale. Impostare la dimensione di scansione a 1024 per 1024 pixel nel menu a discesa.

Fare clic su ottimizza per aprire la finestra di configurazione delle dimensioni di XYZ e selezionare la casella del voxel perfetto nella sezione Z suggerita. Selezionare l'obiettivo 20x e regolare le intensità del laser finché l'immagine non risulta né sottoesposta né sovraesposta. Una volta impostati tutti i parametri, aprire il menu di acquisizione. Selezionare scansiona immagine grande, quindi scegliere che la posizione corrente si trova nell'angolo in alto a sinistra sotto area.

Quindi impostare il numero di campi in X e Y su tre per tre e fare clic su scansione. Per definire il numero di nuclei dei cardiomiociti, fare clic su misura, misurazione manuale e conteggi. Selezionare i nuclei con segnali H2B-mCherry, contrassegnandoli e contandoli.

Quindi, selezionare le cellule positive per l'alfa-actinina per determinare il numero di cardiomiociti. Per contare i cardiomiociti nelle fasi G1, S e G2 con segnali nucleari di EGFP analina, selezionare "misura", "misurazione manuale" e "conta". Delimitare i nuclei che esprimono EGFP analina e H2B-mCherry mediante clic e contare manualmente i cardiomiociti con segnali specifici della mitosi di EGFP analina, come anelli contrattili e corpi mediani.

Quindi, fare clic su misura, misurazione manuale e conteggi, e selezionare i cardiomiociti con segnali di EGFP-analina specifici della mitosi, segnali citoplasmatici, anelli contrattili e corpi mediani. Rispetto ai controlli negativi, i cardiomiociti trasfettati con miRNA e siRNA mostrano un'induzione dell'attività del ciclo cellulare. I cardiomiociti che eseguono endoreduplicazione mostrano un'espressione esclusivamente nucleare di EGFP-analina, mentre i cardiomiociti che subiscono divisione cellulare mostrano un'espressione di EGFP-analina in localizzazioni tipiche della fase M.

Dopo la digestione enzimatica del tessuto cardiaco nell'apparato di Langendorff, atri e ventricoli possono essere separati meccanicamente e analizzati in modo indipendente, permettendo la visualizzazione dei cardiomiociti ventricolari transgenici H2B-mCherry con un elevato numero di cardiomiociti binucleati positivi per H2B-mCherry. Al contrario, la maggior parte dei cardiomiociti atriali sono mononucleati. La digestione enzimatica non produce una popolazione cellulare singola al 100%, ma rivela un pattern di striature trasversali mediante la colorazione per l'alfa-actinina, facilitando ulteriormente la discriminazione tra cardiomiociti binucleati, che mostrano un pattern continuo di striature trasversali, e doppietti cellulari.

Per analizzare l'indice di bi-nucleazione dei cardiomiociti in sezioni spesse, è necessario scorrere manualmente l'intera serie di immagini poiché i nuclei non si trovano necessariamente entro un singolo piano Z, con la colorazione con agglutinina di germe di grano che permette la rilevazione dei bordi cellulari. Le ricostruzioni tridimensionali di sezioni fisse di cuori di topi transgenici adulti consentono la rilevazione e il conteggio automatico degli uncini, dei nuclei colorati e positivi per H2B-mCherry, al fine di determinare la proporzione di nuclei dei cardiomiociti in condizioni fisiologiche all'interno del tessuto. Una volta acquisita padronanza, la dissociazione cardiaca può essere completata in due o tre ore se eseguita correttamente.

Nel corso di questa procedura, è fondamentale ricordare di lavorare in modo continuativo per mantenere la vitalità delle cellule per tutta la durata dell'esperimento. Seguendo questo protocollo, è possibile analizzare microRNA o altre sostanze piccole per valutarne gli effetti induttori della proliferazione nei cardiomiociti postnatali.