La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare l'attività del ciclo cellulare nei cardiomiociti postnatali e di determinare la loro nuclearità. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione cardiaca, ad esempio un cardiomiocita si divide davvero o aumenta semplicemente la sua ploidia o diventa multinucleato? I principali vantaggi di questa tecnica sono che la fase M del ciclo cellulare può essere visualizzata in alta risoluzione spazio-temporale e che i nuclei dei cardiomiociti possono essere identificati mediante fluorescenza.

A dimostrare la procedura sarà Patricia Freitag, un tecnico del nostro laboratorio. Se si utilizzano coppie riproduttive non omozigoti, identificare prima i cuori transgenici tramite microscopia fluorescente per verificare la loro espressione di analina EGFP e H2B-mCherry. I segnali nucleari dell'EGFP analizzata possono essere rilevati più facilmente ai bordi degli atri concentrandosi attraverso i suoi strati di tessuto.

Per isolare i cardiomiociti, posizionare il numero appropriato di cuori in provette di reazione da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di miscela enzimatica da un kit di dissociazione cardiaca neonatale e tagliare i cuori in piccoli pezzi con le forbici. Quindi, trasferire la soluzione in provette di reazione da 15 millilitri. Posizionare la provetta in posizione quasi orizzontale a 37 gradi Celsius per 15 minuti, mescolando il tessuto da cinque a 10 volte con una pipetta da cinque millilitri alla fine dell'incubazione.

Al termine della terza digestione, interrompere la reazione con 7,5 millilitri di terreno due e filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 70 micron. Sciacquare il filtro cellulare con tre millilitri di terreno due, raggruppando il lavaggio con le cellule raccolte e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno per il conteggio.

Quindi, seminare una volta dieci volte alla quarta cellula per pozzetto in 120 microlitri di terreno uno in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti e centrifugare le cellule prima della loro coltura notturna in un incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, la maggior parte dei cardiomiociti dovrebbe battere. Prima di iniziare la trasfezione, pulire il banco e tutti i materiali di trasfezione con una soluzione di decontaminazione RNAsi per rimuovere l'RNAsi.

Quando tutti i materiali sono pronti, aggiungere 20 microlitri di miscela di siRNA appena preparata a ciascun pozzetto e rimettere le cellule nell'incubatore per 48 ore. Dopo due giorni, sostituire il surnatante in ogni pozzetto con 120 microlitri di terreno e rimettere le cellule nell'incubatore per almeno altre 24 ore. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule una volta con PBS, quindi fissarle in soluzione di formaldeide al 4% per 20 minuti.

Per analizzare le cellule mediante videomicroscopia confocale, trasferire la piastra sul tavolino del microscopio confocale e avviare il software di imaging. Apri le impostazioni di A1plus e seleziona le caselle dei canali uno, due, tre e quattro. Nel menu a discesa, impostare il canale uno su DAPI, il canale due su eGFP, il canale tre su RFP e il canale quattro su Cy5.

Fare clic sulla tensione del canale e utilizzare le barre di scorrimento per impostare la tensione su 80 per ciascun canale. Utilizzare le barre di scorrimento per impostare l'offset su zero e fare clic sul pulsante Home per impostare il foro stenopeico nella posizione iniziale. Impostare la dimensione di scansione su 1024 x 1024 pixel nel menu a discesa.

Fare clic su Ottimizza per aprire la finestra di configurazione delle dimensioni XYZ e selezionare la casella voxel perfetta sotto il passaggio Z suggerito.Selezionare l'obiettivo 20x e regolare le intensità del laser fino a quando l'immagine non è né sottoesposta né sovraesposta. Quando tutti i parametri sono stati impostati, aprire il menu di acquisizione. Seleziona Scansiona immagine grande, quindi scegli la posizione corrente nell'angolo in alto a sinistra sotto l'area.

Quindi imposta il numero di campi in X e Y su tre per tre e fai clic su scansione. Per definire il numero di nuclei di cardiomiociti, fare clic su misura, misurazione manuale e conteggi. Selezionare i nuclei con segnali H2B-mCherry, contrassegnandoli e contandoli.

Quindi, selezionare le cellule positive all'alfa-actinina per determinare il numero di cardiomiociti. Per contare i cardiomiociti in fase G1, S, G2 con segnali analini nucleari EGFP, selezionare la misurazione, la misurazione manuale e i conteggi. Contrassegnare l'analina EGFP e i nuclei che esprimono H2B-mCherry con un clic e contare manualmente i cardiomiociti con i segnali dell'analina EGFP specifici per la mitosi, come gli anelli contrattili e la parte centrale del corpo.

Quindi, fare clic su misura, misurazione manuale e conteggi e fare clic sui cardiomiociti con segnali analin EGFP specifici per mitosi, segnali citoplasmatici, anelli contrattili e corpi intermedi. Rispetto ai controlli negativi, i cardiomiociti trasfettati con miRNA e siRNA dimostrano un'induzione dell'attività del ciclo cellulare. I cardiomiociti che eseguono l'endoreduplicazione mostrano un'espressione esclusivamente nucleare di EGFP analina, mentre i cardiomiociti sottoposti a divisione cellulare mostrano un'espressione di EGFP analina in localizzazioni tipiche della fase M.

Dopo la digestione enzimatica del tessuto cardiaco nell'apparato di Langendorff, gli atri e i ventricoli possono essere separati meccanicamente e analizzati in modo indipendente, consentendo la visualizzazione di cardiomiociti ventricolari transgenici H2B-mCherry con un elevato numero di cardiomiociti binucleati H2B-mCherry positivi. Al contrario, la maggior parte dei cardiomiociti atriali sono mononucleati. La digestione enzimatica non si traduce in una popolazione di singole cellule al 100% che rivela un pattern di cross-striation mediante colorazione con alfa-actinina, facilitando ulteriormente la discriminazione tra cardiomiociti binucleati come pattern continuo di cross-striation e doppietti cellulari.

Per analizzare l'indice di binucleazione dei cardiomiociti in fette spesse, è necessario scorrere manualmente la pila poiché i nuclei non si trovano necessariamente all'interno di un piano Z, con la colorazione con agglutinine del germe di grano che consente la rilevazione della cellula borders. 3D le ricostruzioni di fette fisse di cuori di topo transgenico adulto consentono la rilevazione e il conteggio automatico degli uncini, nuclei colorati e H2B-mCherry positivi per determinare la proporzione di nuclei di cardiomiociti in condizioni fisiologiche all'interno del tessuto. Una volta padroneggiata, la dissociazione cardiaca può essere completata in due o tre ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare continuamente per mantenere la vitalità delle cellule durante l'esperimento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire lo screening di microRNA o altre piccole sostanze per i loro effetti induttori di proliferazione nei cardiomiociti postnatali.