Name: La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Scopri come visualizzare le variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti postnatali utilizzando linee murine transgeniche. Questo metodo consente di distinguere la divisione cellulare dall'aumento di ploidia con alta risoluzione spaziotemporale.

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Ringraziamo S. Grünberg (Bonn, Germania) e P. Freitag (Bonn, Germania) per la loro assistenza tecnica.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

C&#39;è una polemica sul fatto cardiomiociti sono in grado di rientrare nel ciclo cellulare e dividere dopo l&#39;infortunio e durante l&#39;omeostasi dei tessuti. I valori per il fatturato base dei cardiomiociti hanno ricevuto nell&#39;intervallo tra 1% e 80% 1 7. Anche dopo una lesione cardiaca, l&#39;induzione dell&#39;attività ciclo cellulare e la generazione di nuovi cardiomiociti è stata riportata nella zona di confine, con valori compresi tra 0,0083% <sup class="xre...

La corretta identificazione dei nuclei cardiomiociti e lo stato del ciclo cellulare è di cruciale importanza per la determinazione del fatturato muscolo cardiaco e la rigenerazione. Ciò è particolarmente vero per l&#39;uso di marcatori nucleari, come pHH3, Ki-67, o analoghi della timidina, per l&#39;identificazione dell&#39;attività ciclo cellulare. Poiché la capacità proliferativa dei cardiomiociti mammiferi adulti è molto piccolo 1, una falsa identificazione di un nucleo positivo per un marker di proliferazione di un nucleo cardiomiociti potrebbe fare una differenza cruciale nel risultato di un saggio di proliferazione. Inoltre, cardiomiociti sono inclini a variazioni del ciclo cellulare, come endoreduplicazione e mitosi acytokinetic, che determinano cellule poliploidi e multinucleate piuttosto che nella divisione cellulare. A tal fine, l&#39;interpretazione della colorazione anticorpi contro marcatori del ciclo cellulare comuni non è determinante in tutti i casi. Qui, vi presentiamo i metodi per il diritto-forwa<html> il riconoscimento Rd di cardiomiociti di topo e la loro nuclearità in cellule isolate nativi e sezioni di tessuto di spessore nelle fasi post-natali e adulti dall&#39;identificazione univoca dei loro nuclei. A tal fine, una linea di topi transgenici con espressione specifici cardiomiociti di una proteina di fusione che consiste di H2B istone umano e mCherry sotto il controllo del promotore Myh6 (Myh6-H2B-MCH) è stato usato 2. Incroci questa linea di topi con una linea di topi indicatore di proliferazione transgenico, in cui l&#39;espressione di una proteina di fusione eGFP-anillin è sotto il controllo del onnipresente promotore pollo actina con potenziatore CMV (CAG-eGFP-anillin), consente la determinazione dello stato del ciclo cellulare. Il anillin proteina ponteggio è specificamente indicato nella cellula-ciclo cellulare attivo 3, e il suo differenziale localizzazione subcellulare durante il ciclo cellulare permette per la progressione del ciclo cellulare live-tracciamento con una risoluzione di M-Phaseef &quot;&gt; 4. Pertanto, i topi transgenici doppia può essere utilizzato per discriminare tra cardiomiociti proliferanti e quelli che subiscono variazioni del ciclo cellulare. Questo dimostra particolarmente utile nello screening per sostanze proliferazione di indurre in vitro.

<table><tbody><tr><td>Piastra Petri 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; Filtro per cellule m</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butandione monoxime (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; cannula per iniezione, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>ago calibro 20</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-metil-butano</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide al 37%</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto a 3 vie</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Anticorpo secondario coniugato con fluor,</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr>, <tr><td>Alfa-Aktinin EA-53, IgG di topo</td>, <td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr>, <tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr>, <tr><td>Micropiastra per colture cellulari, 96 pozzetti, Mezza area</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>microscopio confocale Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>criostato CM 3050S</td><td>Siero</td> d'asino Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr> siero <tr><td>fetale di vitello</td><td>PromoCell,</td> soluzione di formaldeide Heidelberg <td></td><td></td></tr><tr><td>(4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina, tipo A</td><td>Sigma-Aldrich,</td> vetrini coprioggetti Steinheim <td>G2500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger tubo di prolunga</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Eparina-Natrio</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond vetrini per microscopio</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco' modificato s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Topo IgG Cy5 (asino)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>provetta per microcentrifuga</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini agitatore</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Mold</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>negativo controllo (RNA criptato)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione cardiaca neonatale</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>Elementi NIS AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Siero ridotto Medium</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio in alcool polivinilico con DABCO&reg;, antifading</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>contenitori per campioni</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 ioduro (642/661)</td><td>Molecolare sonde/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Agglutinina di germe di grano (WGA) Fluoresceina marcata</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo &alfa;-actinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

I cardiomiociti sono soggetti a variazioni del ciclo cellulare, come l'endoreduplicazione (cicli continui di sintesi del DNA senza cariocinesi e citochinesi) e la mitosi acicitocinetica (cariocinesi ma senza citochinesi). Tali variazioni atipiche del ciclo cellulare provocano cellule poliploidi e multinucleate piuttosto che la divisione cellulare. Pertanto, per determinare il turnover e la rigenerazione cardiaca, è di fondamentale importanza identificare correttamente i nuclei dei cardiomiociti, il numero di nuclei per cellula e il loro stato del ciclo cellulare. Ciò è particolarmente vero per l'uso di marcatori nucleari per identificare l'attività del ciclo cellulare, come gli analoghi della timidina Ki-67, PCNA o pHH3. Qui presentiamo i metodi per riconoscere i cardiomiociti e la loro nuclearità e per determinare la loro attività del ciclo cellulare. Utilizziamo due sistemi transgenici pubblicati: la linea di topi transgenici Myh6-H2B-mCh, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e la linea di topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare. Combinati insieme, questi due sistemi facilitano lo studio della rigenerazione cardiaca e della plasticità.

Al fine di analizzare gli effetti di siRNA / miRNA sull&#39;attività ciclo cellulare di cardiomiociti post-natale in vitro, cardiomiociti di topi Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doppio transgenici sono stati isolati in postnatale giorno 3 (P3) e transfettate con ciclo cellulare attività che inducono miR199 5, siRNA p27, e siRNA Fzr1. Rispetto al controllo negativo (Figura 1A), le immagini di miR199- (Figura 1B) e siRNA p2...

Per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti, presentiamo protocolli che utilizzano due linee di topi transgenici: Myh6-H2B-mCh topi transgenici, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è visualizzare l'attività del ciclo cellulare nei cardiomiociti postnatali e determinare la loro nuclearità. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione cardiaca, come ad esempio se un cardiomiocita si divide effettivamente o semplicemente aumenta il suo grado di ploidia o diventa multinucleato. I principali vantaggi di questa tecnica sono la possibilità di visualizzare la fase M del ciclo cellulare con elevata risoluzione spaziotemporale e l'identificazione dei nuclei dei cardiomiociti mediante fluorescenza.La procedura sarà dimostrata da Patricia Freitag, una tecnica del nostro laboratorio. Se si utilizzano coppie di accoppiamento non omozigoti, identificare innanzitutto i cuori transgenici mediante microscopia fluorescente per verificare l'espressione di EGFP analin e H2B-mCherry. I segnali nucleari di EGFP analyin possono essere rilevati più facilmente ai margini degli atri focalizzando attraverso i diversi strati del tessuto.Per isolare i cardiomiociti, posizionare il numero appropriato di cuori in provette da reazione da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di mix enzimatico da

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