Name: La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Scopri come visualizzare le variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti postnatali utilizzando linee murine transgeniche. Questo metodo consente di distinguere la divisione cellulare dall'aumento di ploidia con alta risoluzione spaziotemporale.

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Ringraziamo S. Grünberg (Bonn, Germania) e P. Freitag (Bonn, Germania) per la loro assistenza tecnica.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

C&#39;è una polemica sul fatto cardiomiociti sono in grado di rientrare nel ciclo cellulare e dividere dopo l&#39;infortunio e durante l&#39;omeostasi dei tessuti. I valori per il fatturato base dei cardiomiociti hanno ricevuto nell&#39;intervallo tra 1% e 80% 1 7. Anche dopo una lesione cardiaca, l&#39;induzione dell&#39;attività ciclo cellulare e la generazione di nuovi cardiomiociti è stata riportata nella zona di confine, con valori compresi tra 0,0083% <sup class="xre...

La corretta identificazione dei nuclei cardiomiociti e lo stato del ciclo cellulare è di cruciale importanza per la determinazione del fatturato muscolo cardiaco e la rigenerazione. Ciò è particolarmente vero per l&#39;uso di marcatori nucleari, come pHH3, Ki-67, o analoghi della timidina, per l&#39;identificazione dell&#39;attività ciclo cellulare. Poiché la capacità proliferativa dei cardiomiociti mammiferi adulti è molto piccolo 1, una falsa identificazione di un nucleo positivo per un marker di proliferazione di un nucleo cardiomiociti potrebbe fare una differenza cruciale nel risultato di un saggio di proliferazione. Inoltre, cardiomiociti sono inclini a variazioni del ciclo cellulare, come endoreduplicazione e mitosi acytokinetic, che determinano cellule poliploidi e multinucleate piuttosto che nella divisione cellulare. A tal fine, l&#39;interpretazione della colorazione anticorpi contro marcatori del ciclo cellulare comuni non è determinante in tutti i casi. Qui, vi presentiamo i metodi per il diritto-forwa<html> il riconoscimento Rd di cardiomiociti di topo e la loro nuclearità in cellule isolate nativi e sezioni di tessuto di spessore nelle fasi post-natali e adulti dall&#39;identificazione univoca dei loro nuclei. A tal fine, una linea di topi transgenici con espressione specifici cardiomiociti di una proteina di fusione che consiste di H2B istone umano e mCherry sotto il controllo del promotore Myh6 (Myh6-H2B-MCH) è stato usato 2. Incroci questa linea di topi con una linea di topi indicatore di proliferazione transgenico, in cui l&#39;espressione di una proteina di fusione eGFP-anillin è sotto il controllo del onnipresente promotore pollo actina con potenziatore CMV (CAG-eGFP-anillin), consente la determinazione dello stato del ciclo cellulare. Il anillin proteina ponteggio è specificamente indicato nella cellula-ciclo cellulare attivo 3, e il suo differenziale localizzazione subcellulare durante il ciclo cellulare permette per la progressione del ciclo cellulare live-tracciamento con una risoluzione di M-Phaseef &quot;&gt; 4. Pertanto, i topi transgenici doppia può essere utilizzato per discriminare tra cardiomiociti proliferanti e quelli che subiscono variazioni del ciclo cellulare. Questo dimostra particolarmente utile nello screening per sostanze proliferazione di indurre in vitro.

<table><tbody><tr><td>Piastra Petri 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; Filtro per cellule m</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butandione monoxime (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; cannula per iniezione, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>ago calibro 20</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-metil-butano</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide al 37%</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto a 3 vie</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Anticorpo secondario coniugato con fluor,</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr>, <tr><td>Alfa-Aktinin EA-53, IgG di topo</td>, <td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr>, <tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr>, <tr><td>Micropiastra per colture cellulari, 96 pozzetti, Mezza area</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>microscopio confocale Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>criostato CM 3050S</td><td>Siero</td> d'asino Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr> siero <tr><td>fetale di vitello</td><td>PromoCell,</td> soluzione di formaldeide Heidelberg <td></td><td></td></tr><tr><td>(4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina, tipo A</td><td>Sigma-Aldrich,</td> vetrini coprioggetti Steinheim <td>G2500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger tubo di prolunga</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Eparina-Natrio</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond vetrini per microscopio</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco' modificato s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Topo IgG Cy5 (asino)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>provetta per microcentrifuga</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini agitatore</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Mold</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>negativo controllo (RNA criptato)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione cardiaca neonatale</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>Elementi NIS AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Siero ridotto Medium</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio in alcool polivinilico con DABCO&reg;, antifading</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>contenitori per campioni</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 ioduro (642/661)</td><td>Molecolare sonde/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Agglutinina di germe di grano (WGA) Fluoresceina marcata</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo &alfa;-actinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

I cardiomiociti sono soggetti a variazioni del ciclo cellulare, come l'endoreduplicazione (cicli continui di sintesi del DNA senza cariocinesi e citochinesi) e la mitosi acicitocinetica (cariocinesi ma senza citochinesi). Tali variazioni atipiche del ciclo cellulare provocano cellule poliploidi e multinucleate piuttosto che la divisione cellulare. Pertanto, per determinare il turnover e la rigenerazione cardiaca, è di fondamentale importanza identificare correttamente i nuclei dei cardiomiociti, il numero di nuclei per cellula e il loro stato del ciclo cellulare. Ciò è particolarmente vero per l'uso di marcatori nucleari per identificare l'attività del ciclo cellulare, come gli analoghi della timidina Ki-67, PCNA o pHH3. Qui presentiamo i metodi per riconoscere i cardiomiociti e la loro nuclearità e per determinare la loro attività del ciclo cellulare. Utilizziamo due sistemi transgenici pubblicati: la linea di topi transgenici Myh6-H2B-mCh, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e la linea di topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare. Combinati insieme, questi due sistemi facilitano lo studio della rigenerazione cardiaca e della plasticità.

Al fine di analizzare gli effetti di siRNA / miRNA sull&#39;attività ciclo cellulare di cardiomiociti post-natale in vitro, cardiomiociti di topi Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doppio transgenici sono stati isolati in postnatale giorno 3 (P3) e transfettate con ciclo cellulare attività che inducono miR199 5, siRNA p27, e siRNA Fzr1. Rispetto al controllo negativo (Figura 1A), le immagini di miR199- (Figura 1B) e siRNA p2...

Per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti, presentiamo protocolli che utilizzano due linee di topi transgenici: Myh6-H2B-mCh topi transgenici, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è visualizzare l'attività del ciclo cellulare nei cardiomiociti postnatali e determinare la loro nuclearità. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione cardiaca, come ad esempio se un cardiomiocita si divide effettivamente o semplicemente aumenta il suo grado di ploidia o diventa multinucleato. I principali vantaggi di questa tecnica sono la possibilità di visualizzare la fase M del ciclo cellulare con elevata risoluzione spaziotemporale e l'identificazione dei nuclei dei cardiomiociti mediante fluorescenza.La procedura sarà dimostrata da Patricia Freitag, una tecnica del nostro laboratorio. Se si utilizzano coppie di accoppiamento non omozigoti, identificare innanzitutto i cuori transgenici mediante microscopia fluorescente per verificare l'espressione di EGFP analin e H2B-mCherry. I segnali nucleari di EGFP analyin possono essere rilevati più facilmente ai margini degli atri focalizzando attraverso i diversi strati del tessuto.Per isolare i cardiomiociti, posizionare il numero appropriato di cuori in provette da reazione da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di mix enzimatico da un kit di dissociazione del cuore neonatale e tagliare i cuori in piccoli pezzi con forbici. Successivamente, trasferire la soluzione in provette da reazione da 15 millilitri. Posizionare la provetta in posizione quasi orizzontale a 37 gradi celsius per 15 minuti, mescolando il tessuto da cinque a dieci volte con una pipetta da cinque millilitri alla fine dell'incubazione.Al termine della terza digestione, arrestare la reazione con 7,5 millilitri di mezzo due e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Risciacquare il filtro cellulare con tre millilitri di mezzo due, unendo il risciacquo alle cellule raccolte, e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Ri-sospendere il pellet in 500 microlitri di mezzo uno per il conteggio.Quindi, seminare una volta dieci alla quarta cellule per pozzetto in 120 microlitri di mezzo uno in una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e centrifugare le cellule prima della loro coltura notturna in un incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, la maggior parte dei cardiomiociti dovrebbe essere in contrazione. Prima di iniziare la trasfezione, pulire il banco di lavoro e tutti i materiali per la trasfezione con soluzione decontaminante per RNAsi per rimuovere qualsiasi RNAsi.Una volta pronti tutti i materiali, aggiungere 20 microlitri di mix di siRNA appena preparato in ogni pozzetto e rimettere le cellule nell'incubatore per 48 ore. Dopo due giorni, sostituire il sopranatante in ogni pozzetto con 120 microlitri di mezzo uno e rimettere le cellule nell'incubatore per almeno altre 24 ore. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule una volta con PBS, seguito da fissazione in soluzione di formaldeide al 4% per 20 minuti.Per analizzare le cellule mediante microscopia confocale in tempo reale, trasferire la piastra sul palchetto del microscopio confocale e avviare il software di acquisizione. Aprire le impostazioni di A1plus e selezionare le caselle del canale uno, due, tre e quattro. Nel menu a discesa, impostare il canale uno su DAPI, il canale due su eGFP, il canale tre su RFP e il canale quattro su Cy5.Fare clic sul voltaggio del canale e utilizzare le barre di scorrimento per impostare il voltaggio a 80 per ogni canale. Utilizzare le barre di scorrimento per impostare l'offset a zero e fare clic sul pulsante home per posizionare il pinhole nella posizione iniziale. Impostare la dimensione di scansione a 1024 per 1024 pixel nel menu a discesa.Fare clic su ottimizza per aprire la finestra di configurazione delle dimensioni di XYZ e selezionare la casella del voxel perfetto nella sezione Z suggerita. Selezionare l'obiettivo 20x e regolare le intensità del laser finché l'immagine non risulta né sottoesposta né sovraesposta. Una volta impostati tutti i parametri, aprire il menu di acquisizione. Selezionare scansiona immagine grande, quindi scegliere che la posizione corrente si trova nell'angolo in alto a sinistra sotto area.Quindi impostare il numero di campi in X e Y su tre per tre e fare clic su scansione. Per definire il numero di nuclei dei cardiomiociti, fare clic su misura, misurazione manuale e conteggi. Selezionare i nuclei con segnali H2B-mCherry, contrassegnandoli e contandoli.Quindi, selezionare le cellule positive per l'alfa-actinina per determinare il numero di cardiomiociti. Per contare i cardiomiociti nelle fasi G1, S e G2 con segnali nucleari di EGFP analina, selezionare "misura", "misurazione manuale" e "conta". Delimitare i nuclei che esprimono EGFP analina e H2B-mCherry mediante clic e contare manualmente i cardiomiociti con segnali specifici della mitosi di EGFP analina, come anelli contrattili e corpi mediani.Quindi, fare clic su misura, misurazione manuale e conteggi, e selezionare i cardiomiociti con segnali di EGFP-analina specifici della mitosi, segnali citoplasmatici, anelli contrattili e corpi mediani. Rispetto ai controlli negativi, i cardiomiociti trasfettati con miRNA e siRNA mostrano un'induzione dell'attività del ciclo cellulare. I cardiomiociti che eseguono endoreduplicazione mostrano un'espressione esclusivamente nucleare di EGFP-analina, mentre i cardiomiociti che subiscono divisione cellulare mostrano un'espressione di EGFP-analina in localizzazioni tipiche della fase M.Dopo la digestione enzimatica del tessuto cardiaco nell'apparato di Langendorff, atri e ventricoli possono essere separati meccanicamente e analizzati in modo indipendente, permettendo la visualizzazione dei cardiomiociti ventricolari transgenici H2B-mCherry con un elevato numero di cardiomiociti binucleati positivi per H2B-mCherry. Al contrario, la maggior parte dei cardiomiociti atriali sono mononucleati. La digestione enzimatica non produce una popolazione cellulare singola al 100%, ma rivela un pattern di striature trasversali mediante la colorazione per l'alfa-actinina, facilitando ulteriormente la discriminazione tra cardiomiociti binucleati, che mostrano un pattern continuo di striature trasversali, e doppietti cellulari.Per analizzare l'indice di bi-nucleazione dei cardiomiociti in sezioni spesse, è necessario scorrere manualmente l'intera serie di immagini poiché i nuclei non si trovano necessariamente entro un singolo piano Z, con la colorazione con agglutinina di germe di grano che permette la rilevazione dei bordi cellulari. Le ricostruzioni tridimensionali di sezioni fisse di cuori di topi transgenici adulti consentono la rilevazione e il conteggio automatico degli uncini, dei nuclei colorati e positivi per H2B-mCherry, al fine di determinare la proporzione di nuclei dei cardiomiociti in condizioni fisiologiche all'interno del tessuto. Una volta acquisita padronanza, la dissociazione cardiaca può essere completata in due o tre ore se eseguita correttamente.Nel corso di questa procedura, è fondamentale ricordare di lavorare in modo continuativo per mantenere la vitalità delle cellule per tutta la durata dell'esperimento. Seguendo questo protocollo, è possibile analizzare microRNA o altre sostanze piccole per valutarne gli effetti induttori della proliferazione nei cardiomiociti postnatali.

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I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CM) offrono un'alternativa all'uso di animali per lo screening preclinico della cardiotossicità. Una limitazione all'adozione diffusa di hiPSC-CMs nello screening preclinico della tossicità è il fenotipo immaturo e fetale delle cellule. Qui sono presentati protocolli per la maturazione robusta e rapida delle hiPSC-CM.

Screening della cardiotossicità ad alto rendimento utilizzando monostrati di cardiomiociti pluripotenti indotti da cellule staminali umane mature

Scopri come visualizzare le variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti postnatali utilizzando linee murine transgeniche. Questo metodo consente di distinguere la divisione cellulare dall'aumento di ploidia con alta risoluzione spaziotemporale.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

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