Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria
17 febbraio 2019
In questo metodo, tessuti cardiaci embrionali sono chirurgicamente microdissected, dissociato, fluorescente etichettati e impiantati nei tessuti embrionali dell'ospite. Questo fornisce una piattaforma per lo studio dell'organizzazione inerente allo sviluppo livello individuale o tessuto ectopiche condizioni emodinamiche, e/o alterati paracrine/juxtacrine ambienti.
Questo protocollo ci aiuta a determinare come le alterazioni della biomeccanica locale, dell'architettura tissutale, degli ambienti paracrini e delle interazioni giustaprena influenzano il fenotipo cellulare. Questa tecnica ci permette di esplorare paradigmi classici ed embriologia sperimentale senza causare gli insulti tissutali su larga scala che normalmente sorgono nei tradizionali esperimenti di grafica. Per trovare la giusta pressione per l'iniezione, è utile iniziare da una pressione di iniezione inferiore e aumentare in modo incrementale fino a ottenere un flusso costante di cellule.
La visualizzazione di questa tecnica aiuta a raggiungere una comprensione diretta di come l'apparecchiatura di iniezione deve essere posizionata in relazione al tessuto bersaglio. A dimostrare la procedura saranno due membri del mio laboratorio, Trevor Henley e Kandace Thomas. 24 ore prima dell'impianto, tirare i capillari di vetro su un estrattore di micropipette secondo i protocolli standard e immergere i capillari in agente siliconizzante per rivestire le superfici esterne degli aghi.
Successivamente, caricare da 5 a 10 microlitri di agente siliconizzante in una punta di pipetta di microiniezione e posizionare la punta nell'estremità larga di un capillare di vetro tirato rivestito esternamente. Posizionare la punta della pipetta il più vicino possibile alla punta dell'ago di vetro ed espellere l'agente siliconizzante mentre si ritrae lentamente la pipetta di carico per ridurre al minimo le bolle d'aria all'interno dell'ago. Lasciare l'agente siliconizzante nell'ago di vetro per 10 minuti prima di utilizzare una nuova pipetta di carico per aspirare la soluzione.
Quindi asciugare gli aghi in un cappuccio di fumi durante la notte. Per la preparazione dell'embrione ospite, incubare uova di gallina fertili in orientamento orizzontale in un'incubatrice umidificata a 38 gradi Celsius e utilizzare pini angolati per fare una puntura di diametro superiore a un millimetro nella parte inferiore dell'estremità piatta di ogni uovo lungo l'equatore dell'uovo. Inserire un ago calibro 18 attaccato a una siringa da 10 millilitri nella puntura per rimuovere circa cinque millilitri di albume.
E applicare nastro trasparente sulla parte superiore del guscio d'uovo. Segnare la regione nastrata lungo la parte superiore dell'uovo con forcelle angolate e utilizzare forbici tenotomiche curve per tagliare una finestra di circa 2,5 centimetri nella sezione nastrata dell'uovo. Ispezionare e far scorrere l'embrione in base ai criteri stabiliti da Hamburger e Hamilton e utilizzare una siringa da un millimetro dotata di un ago calibro 32 per iniettare circa 200 microlitri di una diluizione da uno a cinque di inchiostro indiano in HBSS sotto l'embrione.
Quindi sigillare la puntura con nastro trasparente e aggiungere un millilitro di HBSS per goccia sul disco embrionale prima di sigillare il guscio finestrato con pellicola di paraffina per il posizionamento dell'uovo nell'incubatrice umidificata. Quando gli embrioni raggiungono la fase 19 di Hamburger e Hamilton, sciacquare i capillari di vetro rivestiti in silicone con acqua deionizzata e lasciare asciugare i capillari per tre o quattro ore a temperatura ambiente. Nel tempo medio, trasferire un embrione da un uovo in una piastra di Petri da 100 x 15 millimetri contenente HBSS sterile a temperatura ambiente e posizionare la piastra al microscopio stereo.
Usando le forcep, le forbici per la tenotomia e una micro spatola, isolare l'intero cuore embrionale dall'embrione e isolare gli atri dal cuore. Posizionare il tessuto atriale in un tubo sterile di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di HBSS sul ghiaccio. Quando tutto il tessuto donatore è stato raccolto, pellet i tessuti per centrifugazione in un microcentrifugo angolato fisso.
Per la digestione dei tessuti donatrici, sospendere di nuovo i pellet in un millilitro di EDTA prerifavorato allo 05% di tripparina per un'incubazione di 15 minuti in un blocco termico tremante a 300 rotazioni al minuto. Al termine dell'incubazione, pipettare più volte la soluzione di digestione per rompere il tessuto rimanente e pelletare il lisato cardiaco per centrifugazione. Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di soluzione neutralizzante di tripina per un'altra centrifugazione seguita da ri-sospensione in 400 microlitri di soluzione colorante fluorescente rossa.
Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius, pellettò le cellule per centrifugazione per uno o tre lavaggi in un millilitro di HBSS per lavaggio. Quindi sospendere di nuovo le cellule etichettate a una concentrazione di cinque volte dieci-quarta per microlitro in HBSS fresco. Per l'iniezione in vivo delle cellule donatrici, eseguire il backload della sospensione cellulare in una pipetta capillare in vetro secco trattato con silicone come dimostrato e montare la pipetta nell'apparato microiniettore a pressione.
Trasferire ogni embrione ospite da iniettare dall'incubatore umidificato in un portaovo al microscopio stereo sezionato fluorescente. E utilizzare forcep fini sterili per aprire la membrana vitellina. Fare un'incisione da 5 a un millimetro nel pericardio e posizionare il microiniettore in modo che la punta dell'ago di microiniezione penetri nel tessuto bersaglio.
Impostare il microiniettore per applicare impulsi singoli di 5 secondi di durata e che vanno da 100 a 400 ettopascal in pressione. E iniettare pressione nelle cellule. È fondamentale verificare un impianto cellulare di successo imagingando il segnale fluorescente prima di risigillare l'uovo.
L'embrione può anche essere fotografato per documentare questa procedura. Quando tutte le cellule sono state iniettate, ritrarre l'apparato del microiniettore e rimuovere l'uovo dal supporto. Quindi aggiungere un millilitro di HBSS caldo per quanto riguarda la goccia sull'embrione.
Sigillare l'uovo con nastro adesivo trasparente e riportare l'uovo nell'incubatrice umidificata per 24 ore dopo l'impianto. Qui, viene mostrato il cuore e il tessuto circostante di un cuore embrionale ospite dopo l'impianto del miocita atriale del donatore. In questo esperimento rappresentativo, le cellule donatrici sono state microiniettate nel proepicardio di un embrione ospite di uno stadio simile.
La sessatura ottica con un microscopio confocale ha rivelato che le uniche cellule positive del marcatore muscolare cardiaco all'interno del proepicardio erano le cellule positive rosse fluorescenti impiantate focalmente. Fare attenzione a non manipolare empatica troppo l'embrione ricevente poiché le rotture nel cuore e la vascucolatura locale causata dall'ago di iniezione possono comportare una ridotta vitalità. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una varietà di saggi a valle, tra cui l'immunoistochimica, l'ibridazione in situ e lo smistamento cellulare.
L'agente siliconizzante è estremamente infiammabile e acutamente tossico. Deve sempre essere maneggiato con cura e dispositivi di protezione individuale adeguati all'interno di una cappa aspirante.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per microdissezionare e impiantare tessuti cardiaci embrionali in embrioni ospiti, permettendo lo studio dell'organizzazione dello sviluppo in condizioni modificate. Fornisce informazioni su come la biomeccanica locale e l'architettura del tessuto influenzino il fenotipo cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Embriologia
- Sviluppo Cardiaco
- Ingegneria Tissutale
Sfondo
- Comprendere lo sviluppo del tessuto cardiaco è fondamentale per la medicina rigenerativa.
- I metodi tradizionali possono causare danni tessutali significativi.
- Questa tecnica minimizza i danni tissutali su larga scala.
- Permette di esplorare le interazioni paracrini e giunzionali.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti della biomeccanica locale sullo sviluppo del tessuto cardiaco.
- Analizzare l'influenza di ambienti paracrini alterati sul comportamento cellulare.
- Fornire una piattaforma per l'embriologia sperimentale.
Metodi Utilizzati
- Microdissezione dei tessuti cardiaci embrionali.
- Etichettatura fluorescente delle cellule donatrici.
- Microiniezione delle cellule etichettate in embrioni ospiti.
- Acquisizione di immagini per verificare l'attecchimento riuscito delle cellule.
Risultati principali
- Impianto riuscito di cellule cardiache marcate con fluorescenza.
- Visualizzazione delle interazioni cellulari all'interno del tessuto ospite.
- Dimostrazione dell'efficacia della tecnica nello studio dello sviluppo cardiaco.
- Informazioni sul ruolo delle condizioni locali sul fenotipo cellulare.
Conclusioni
- Questo metodo consente uno studio dettagliato dello sviluppo del tessuto cardiaco.
- Fornisce un'alternativa meno invasiva rispetto ai metodi tradizionali.
- Studi futuri potranno approfondire gli effetti di diversi fattori ambientali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo sistema basato sulla microiniezione consente una manipolazione spaziale precisa dei cardiomiociti embrionali all'interno di un modello aviario integro, offrendo un approccio scalabile per analizzare l'influenza del microambiente sul destino cellulare. Minimizzando il danno ai tessuti pur mantenendo il contesto fisiologico, il metodo supporta una valutazione meccanicistica del rischio nelle prime fasi della validazione degli obiettivi terapeutici per strategie rigenerative cardiache. La sua adattabilità a diversi tessuti donatori e ambienti ospiti migliora la continuità traslazionale dalla scoperta alla modellizzazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei segnali cellulo-autonomi rispetto a quelli estrinseci nella maturazione dei cardiomiociti a risoluzione singola cellula.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per isolare le variabili emodinamiche, paracrini e giustacrine che influenzano il fenotipo.
- Valore strategico: Supporta la validazione mirata degli obiettivi chiarificando le dipendenze del microambiente nell'impegno della linea cardiaca.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantificabili e risolte spazialmente delle transizioni del destino dei cardiomiociti mediante tracciamento e imaging fluorescente.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione delle cellule donatrici e i parametri di microiniezione per un'impianto ectopico consistente.
- Valore strategico: Facilita la predisposizione del saggio per studi di perturbazione con composti chimici o modificazioni genetiche in un microambiente cardiaco in sviluppo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella segnali microambientali cardiaci rilevanti per l'uomo in un sistema di embrione vertebrato.
- Valore operativo: Consente l'analisi longitudinale dell'integrazione, sopravvivenza e maturazione funzionale delle cellule impiantate.
- Valore strategico: Guida un avanzamento proporzionato ai rischi prevedendo come la biomeccanica locale e l'architettura del tessuto influenzino l'efficacia dell'attecchimento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo un sistema controllato per verificare come le perturbazioni del microambiente influenzino la differenziazione e la funzione dei cardiomiociti prima dell'ottimizzazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli cardiaci isolando variabili come l'architettura del tessuto e il carico biomeccanico.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantificabili per valutare gli effetti dei composti sul comportamento ectopico dei cardiomiociti.
- Analisi: Permette il confronto statistico dell'efficienza di impianto e dell'espressione dei marcatori tra diverse condizioni mediante imaging confocale.
- Ricerca traslazionale: Collega i meccanismi dello sviluppo a modelli preclinici validando le dipendenze dal microambiente in un sistema fisiologicamente rilevante.
- Riutilizzo aziendale: Piattaforma adattabile per lo studio di diversi tipi cellulari e tessuti al di là delle linee cardiache, che massimizza l'utilizzo delle risorse.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sullo sviluppo cardiaco consentendo una modulazione precisa del microambiente.
- Valore operativo: Offre un'esecuzione a basso costo e ad alta velocità con un equipaggiamento specializzato minimo, favorendo un'implementazione su larga scala.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale fornendo un'elevata affidabilità predittiva precoce sulla sensibilità al microambiente bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione stratificata per rischio dei candidati alla rigenerazione cardiaca in base alla risposta al microambiente.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia, manipolazione di embrioni e microscopia fluorescente.
- È dipendente da microinjectori calibrati, capillari trattati al silicone e protocolli sterili a base di HBSS.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per lo stadio embrionale, la pressione di iniezione e l'incubazione post-impianto.
- L'adattamento a modelli non aviari può richiedere un'ottimizzazione dei parametri di dissociazione tissutale e di iniezione.
- È limitato dalla sensibilità della vitalità embrionale al trauma meccanico causato dalla manipolazione con l'ago.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Micro-Injection Pipette Preparation
1:53
Host Embryo Preparation
3:34
Donor Tissue Isolation
4:44
Donor Tissue Digestion
5:50
In Vivo Injection
7:37
Results: Representative Donor Myocyte-Implanted Embryonic Recipient Heart Imaging
8:14
Conclusion
