Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la massima capacità di generazione della forza isometrica delle singole fibre da campioni di muscoli scheletrici chimicamente permeabili. Ciò si ottiene esponendo prima le membrane delle fibre muscolari a un detergente chimico, rimuovendo così la barriera tra il contenuto extracellulare e intracellulare. Il secondo passo consiste nell'estrarre una singola fibra da un piccolo fascio di fibre e attaccarla all'apparato sperimentale.

Successivamente, i modelli di interferenza laser vengono utilizzati per impostare la lunghezza ottimale del sarcomero per la singola fibra. Infine, il calcio viene somministrato per ottenere la massima forza di contrazione isometrica. In definitiva, la tecnica a fibra singola perme fornisce una valutazione delle proprietà contrattili del muscolo scheletrico senza le complessità associate all'architettura dell'intero muscolo.

La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto i passaggi chiave per eseguire correttamente il protocollo possono essere difficili da apprendere. Inizia preparando le soluzioni di dissezione, conservazione e test come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, usa una pinza per preparare gli anelli di sutura da fili di sutura in nylon monofilamento zero USP 10

Utilizzando la tecnica del doppio nodo a rovescio, preparare quattro anelli per ogni fibra da testare. Una volta formato, posizionare il nodo al microscopio e ridurne le dimensioni a circa 750 micrometri di diametro. Utilizzando le marcature IPS GTI come guida.

Quindi tagliare la sutura in eccesso, lasciando solo l'ansa e piccole code da 500 micrometri su entrambi i lati. Trasferire una piccola massa di tessuto muscolare ottenuta tramite biopsia aperta o con ago in un piatto contenente una soluzione di dissezione refrigerata e aggiungere altra soluzione di dissezione per garantire che il tessuto rimanga sommerso. Ispezionare il campione al microscopio e manipolarlo per allineare l'asse longitudinale delle fibre verso la spalla destra dell'investigatore.

Quindi ancorare il campione al piatto fissandolo agli angoli con la pinza nella mano sinistra e le forbici per micro dissezione nella destra. Inizia sezionando delicatamente un fascio lungo i margini longitudinali tra le fibre. Rimuovere ed eliminare qualsiasi tessuto danneggiato dalla pinza o dai perni.

Come risultato del processo di dissezione, trasferire i fasci dalla soluzione di dissezione in una fiala da tre millilitri contenente 2,5 millilitri di soluzione di dissezione fresca refrigerata con l'aggiunta di un detergente non ionico. Incubare il campione su ghiaccio per 30 minuti agitando delicatamente di tanto in tanto e assicurarsi che i fasci rimangano immersi durante l'incubazione. Quindi trasferire i fasci in una fiala contenente una soluzione di dissezione fresca e agitare delicatamente e brevemente per rimuovere l'eventuale detersivo residuo.

Una volta risciacquati, trasferire i fasci in una fiala contenente una soluzione di conservazione refrigerata e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere la fiala dalla conservazione a quattro gradi Celsius e trasferire tutti i fasci in una tazza di medicinali o in un piatto da dissezione. In preparazione per la conservazione, trasferire i fasci in fiale criogeniche etichettate singolarmente, riempite con 200-400 microlitri di soluzione di conservazione fresca, e assicurarsi che il fascio non sia attaccato al lato del tubo o galleggi sulla superficie.

Quindi tappare la provetta e conservare il campione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Impostare un apparato sperimentale come quello mostrato qui e attribuito nel protocollo di testo allegato. Quindi riempire la prima camera sperimentale con soluzione rilassante, la seconda camera con soluzione pre-riattivante e la terza con soluzione attivante.

Regolare la temperatura nella camera fino a quando non è costante a 15 gradi Celsius con l'apparecchio nella soluzione rilassante. Infilare due degli anelli di sutura preparati sulle superfici di attacco in acciaio inossidabile che si estendono sia dal trasduttore di forza che dal controller di lunghezza. Quindi, scongelare un fascio di fibre di interesse con ghiaccio per circa 15 minuti, quindi trasferirlo in una piastra di Petri placcata in elastomero siliconico riempita con una soluzione rilassante fresca e refrigerata.

Fissare il fascio in posizione con i perni su entrambe le estremità e assicurarsi che sia immerso utilizzando la pinza. Afferra una fibra a un'estremità e inizia ad estrarla dolcemente lungo il suo asse longitudinale. Prestare attenzione quando si estraggono le fibre dal fascio poiché le aderenze tra le fibre e la matrice extracellulare possono provocare una tensione eccessiva, portando infine a danni indotti dallo stiramento.

Una volta estratta, introdurre la fibra in un puntale di pipetta modificato insieme a una piccola quantità di soluzione rilassante e trasferirla nella camera sperimentale che contiene la soluzione rilassante guidando delicatamente con la pinza. Rimuovere la fibra dal puntale della pipetta e ancorarla al controller di lunghezza. Utilizzando il primo anello di sutura, manipolare l'altra estremità della fibra verso il trasduttore di forza e fissare la fibra utilizzando la stessa procedura.

Rimuovere l'eventuale sutura in eccesso utilizzando le forbici da micro dissezione. Quindi, infilare il secondo anello sul primo e ancorare la fibra in un punto entro 0,2 millimetri dall'estremità della superficie di attacco del controller di lunghezza. Ripetere con il secondo anello all'estremità del trasduttore di forza della fibra.

Regolare la posizione del regolatore di lunghezza in direzione dell'asse Y in modo da allineare la fibra parallelamente alle pareti laterali della camera sperimentale. Quindi esaminare la fibra utilizzando la vista laterale del prisma e regolare la posizione del controller di lunghezza nella direzione dell'asse Z fino a quando la fibra non è parallela al pavimento della camera. Se la fibra è danneggiata in qualsiasi modo, la fibra deve essere scartata e attaccata una nuova fibra.

Accendere il laser e regolare la posizione del tavolino in modo che il laser passi attraverso il centro della fibra. Quindi impostare la lunghezza del sarcomero aumentando o diminuendo la tensione sulla fibra utilizzando il driver micrometrico dell'asse X del controller di lunghezza fino a quando non si osserva la spaziatura desiderata della luce diffratta sullo schermo del bersaglio. Dopo aver impostato la lunghezza ottimale del sarcomero, misurare la distanza tra le due suture più interne.

Posizionare la camera in modo che il mirino verticale dell'oculare sia allineato sul bordo più interno di una sutura interna e zero. La lettura digitale sull'azionamento micrometrico traslare il tavolino lungo l'asse x rispetto al microscopio fino a quando il mirino verticale dell'oculare non è allineato con la sutura più interna. Il display digitale indicherà la lunghezza della fibra, manterrà la fibra alla lunghezza misurata e utilizzerà la fotocamera montata sul microscopio per acquisire un'immagine ad alto ingrandimento della parte centrale della fibra sia dall'alto che lateralmente.

Utilizzare queste immagini per calcolare l'area della sezione trasversale della fibra. Utilizzare il software di controllo della camera per spostare la fibra nella camera contenente la soluzione di pre-riattivazione e incubare lì per tre minuti. Mentre la fibra è soluzione inattivante, misurare la sua tensione passiva, quindi spostare la fibra nella camera contenente la soluzione attivante e consentire lo sviluppo della massima forza isometrica, come evidenziato da un plateau di forza che è preceduto da un rapido aumento.

Quindi, utilizzare il controller di lunghezza per applicare una riduzione rapida e breve della distanza tra i punti di attacco della fibra, seguita da un rapido ritorno alla lunghezza originale per identificare l'uscita del trasduttore di forza che corrisponde a zero. La forza mostrata qui sono sia le viste superiore che quella laterale di una fibra di forma ellittica da queste viste. L'area della sezione trasversale è stata determinata misurando i diametri in cinque punti lungo la lunghezza della fibra e quindi calcolando la media delle cinque aree risultanti.

Le tracce di forza delle fibre muscolari umane, lente e veloci illustrano che le fibre veloci generano forza a una velocità maggiore rispetto alle fibre lente utilizzando la tecnica mostrata in questo video. Le caratteristiche tipiche delle fibre muscolari umane di topo e ratto sono state misurate e sono presentate qui. L'intervallo indicato indica il 25° e il 75° quartile e la N è il numero di fibre testate.

Si noti l'ampia variazione di forza specifica tra le diverse specie. Le procedure qui descritte portano alla valutazione della massima capacità di generazione della forza intrinseca di una singola fibra muscolare scheletrica aggiungendo ulteriori interventi, aspetti importanti della fisiologia del muscolo scheletrico, tra cui, tra gli altri, la forza di lunghezza, la velocità della forza e la forza. Le relazioni con il calcio possono essere rivelate.