Name: Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Impara a misurare la forza isometrica massima generata da singole fibre muscolari scheletriche permeabilizzate. Questo metodo consente di valutare le proprietà contrattili in vitro senza le complessità dell'architettura muscolare completa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti fonti di finanziamento: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol><li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li>
<li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li>
<li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Shoulder+Elbow+Surg%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+contraction+of+rabbit+fast+and+slow+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers.</a> Biophys J. 53, 935-946 (1988).</li>
<li>Moisescu, D. G., Thieleczek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+strontium+concentration+changes+within+skinned+muscle+preparations+following+a+change+in+the+external+bathing+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution.</a> J Physiol. 275, 241-262 (1978).</li>
<li>Walker, S. M., Schrodt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I+Segment+lengths+and+thin+filament+periods+in+skeletal+muscle+fibers+of+the+Rhesus+monkey+and+the+human%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human.</a> Anat Rec. 178, 63-81 (1974).</li>
<li>Gollapudi, S. K., Lin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+sarcomere+force-length+relationship+in+type-1+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers.</a> J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).</li>
<li>Brenner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+stabilizing+the+striation+pattern+in+maximally+calcium-activated+skinned+rabbit+psoas+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers.</a> Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li>
<li>Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+deficits+and+breakage+rates+after+single+lengthening+contractions+of+single+fast+fibers+from+unconditioned+and+conditioned+muscles+of+young+and+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).</li>
<li>Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+human+muscle%3A+understanding+sarcopenia+at+the+single+muscle+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Rehabil+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level.</a> Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).</li>
<li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li>
<li>Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+muscle+fibers+after+short-term+resistance+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regulatory+Integrative+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training.</a> Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).</li>
<li>Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+spaceflight%2C+simulated+spaceflight+and+countermeasures+on+single+muscle+fiber+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravit+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology.</a> J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).</li>
<li>Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+long-term+muscle+paralysis+on+human+single+fiber+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics.</a> J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).</li>
<li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li>
<li>Russell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+fast+skeletal+muscle+troponin+as+a+potential+therapeutic+approach+for+treating+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases.</a> Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+function+and+rate+of+disease+progression+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).</li>
<li>Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+EDL+and+soleus+muscles+of+myostatin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice.</a> J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).</li>
<li>Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-induced+injury+to+single+permeabilized+muscle+fibers+from+mdx%2C+transgenic+mdx+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).</li>
<li>Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+high-resolution+separation+of+rodent+myosin+heavy+chain+isoforms+in+a+mini-gel+electrophoresis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system.</a> Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).</li>
<li>Hill, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+of+shortening+and+the+dynamic+constants+of+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The heat of shortening and the dynamic constants of muscle.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).</li>
<li>Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-velocity+properties+of+human+skeletal+muscle+fibres%3A+myosin+heavy+chain+isoform+and+temperature+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence.</a> J Physiol. 495, 573-586 (1996).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+velocity+of+unloaded+shortening+and+its+relation+to+sarcomere+length+and+isometric+force+in+vertebrate+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres.</a> J Physiol. 291, 143-159 (1979).</li>
<li>Brenner, B., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+force+generation+in+muscle%3A+Correlation+with+actomyosin+ATPase+activity+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution.</a> PNAS. 83, 3542-3546 (1986).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+maximum+velocity+of+shortening+in+skinned+skeletal+muscle+fibres+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).</li>
<li>Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+inhibitory+effects+of+orthovanadate+on+shortening+velocity+in+fast+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle.</a> Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).</li>
<li>Ashley, C. C., Moisescu, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changing+the+composition+of+the+bathing+solutions+upon+the+isometric+tension-pCa+relationship+in+bundles+of+crustacean+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils.</a> J Physiol. 270, 627-652 (1977).</li>
<li>Godt, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+tension+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.+Dependence+on+magnesium+adenosine+triphosphate+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li>
<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Physiologie+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+physiological+ADP+concentrations+on+contraction+of+single+skinned+fibers+from+rabbit+fast+and+slow+muscles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles).</a> Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).</li>
<li>Godt, R. E., Maughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swelling+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Swelling of skinned muscle fibers of the frog.</a> Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).</li>
<li>Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+lattice+spacing+change+on+cross-bridge+kinetics+in+chemically+skinned+rabbit+psoas+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers.</a> Biophys J. 64, 187-196 (1993).</li>
<li>Millman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filament+lattice+of+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The filament lattice of striated muscle.</a> Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+mouse+single+muscle+fibers%2C+a+comparison+with+amphibian+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers.</a> J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).</li>
<li>Phillips, S. K., Woledge, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+isometric+force%2C+maximum+power+and+isometric+heat+rate+as+a+function+of+sarcomere+length+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle.</a> Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).</li>
<li>Stephenson, D. G., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li>
</ol>

La produzione e l'accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Aurora Scientific

Le valutazioni delle proprietà contrattili di fibre muscolari scheletriche singole permeabilizzate sono usati per studiare la funzione muscolare in un&#39;ampia varietà di contesti. Alcuni esempi sono gli studi che hanno valutato gli effetti dell&#39;invecchiamento 12, esercitare 10,13,14, 15 voli spaziali, lesioni 2,3,16, trattamenti farmacologici 17,18, malattie 19 e di manipolazione genetica 20,21 sulla struttura e la funzione delle fibre. A causa della capacità di valutare direttamente le prestazioni contrattile miofibrille nella loro configurazione nativa, questa tecnica fornisce una piattaforma interessante da cui formare una comprensione della funzione miofibrillare assente di effetti potenzialmente confondenti che sono presenti quando la trasmissione del segnale neuromuscolare e rilascio di calcio di eccitazione indotta sono inclusi nel sistema studiato. Inoltre, collaudo funzionale di singole fibre può essere utilizzato per integrare proteine ​​contrattili risultati di identificazione come quelliottenuta attraverso immunoistochimica o elettroforesi su gel + Western Blot 22. Una delle funzioni primarie del muscolo scheletrico è quello di generare forza. Conseguentemente sF o, una misura della capacità di forza generatrice intrinseca di un sistema di contrazione, è di grande interesse per fisiologi muscolari. Stime attendibili di sF o richiedono misure accurate di entrambi fibra CSA e F o. Poiché le fibre sono, in generale, non circolare in sezione trasversale, né uniformi in CSA lungo la loro lunghezza, molta cura deve essere presa nella stima CSA. A tal fine, le misurazioni vengono effettuate a diverse posizioni lungo la lunghezza della fibra e, in ogni posizione, da due prospettive separate di 90 °. Misure affidabili di F o richiedono attenzione ai diversi dettagli, tra cui la contabilità per forza passiva, regolando la lunghezza sarcomero per massimizzare sovrapposizione di filamenti spessi e sottili, impiegando una soluzione attivante con una concentrazione di calcio trisultati cappello di attivazione massima, mantenendo la temperatura desiderata sperimentale, e mantenere condizioni ottimali (temperatura e durata) delle fibre precedenti il ​​giorno dell&#39;esperimento. Mentre la procedura descritta descrivono la procedura di valutazione massima forza isometrica, è spesso desiderabile per valutare altri importanti caratteristiche funzionali delle fibre muscolari scheletriche. Ciò può essere ottenuto estendendo il protocollo sperimentale per includere ulteriori manipolazioni meccaniche della fibra. Ad esempio, la misurazione della velocità con cui la fibra accorcia contro una serie di carichi diversi permette di determinare il rapporto forza-velocità, da cui i rapporti forza potenza e velocità-potenza possono essere calcolati 10,23,24. Inoltre, la velocità di accorciamento a vuoto può essere determinato utilizzando il &quot;test slack&quot; 25, che consistono di applicare una serie di passaggi di accorciamento-allentamento indurre e misng il tempo richiesto dalla fibra per eliminare l&#39;allentamento. Un altro parametro cinetica che viene spesso segnalato è k tr, la costante di velocità per la forza di riqualificazione a seguito di una perturbazione meccanica che distacca temporaneamente tutti crossbridges 26. Infine, il rapporto tra la concentrazione di calcio e la generazione forza attiva (la &quot;relazione forza-APC&quot;) è spesso di interesse 18 e può essere determinata esponendo la fibra ad una serie di soluzioni con concentrazioni di calcio che vanno da sotto la soglia di attivazione del contractile Sistema a quelli sufficienti per suscitare massima attivazione e quindi la massima forza (F o). Anche se gran parte del materiale di cui è necessaria per valutare la contrattilità singola fibra, altre apparecchiature non è assolutamente necessario. Il regolatore di lunghezza, per esempio, è essenziale per qualsiasi protocollo sperimentale che richiede allungamento rapida e precisa o accorciamento della fibra,ma non è assolutamente necessaria per valutare la forza isometrica massima (anche se un livello zero forza nel record forza deve ancora essere identificato da alcuni mezzi). I prismi che permettono l&#39;osservazione della fibra dal lato, mentre utile per valutare sezione trasversale, non sono assolutamente necessarie durante il posizionamento della fibra all&#39;interno della camera sperimentale. Inoltre, mezzi alternativi per esporre la fibra alle varie soluzioni sperimentali potrebbe essere impiegato, compresi l&#39;ideazione di un sistema di azionamento manuale di camere o un&#39;unica camera che permette un rapido riempimento e svuotamento delle soluzioni. Infine, mentre le temperature sperimentali sub-fisiologiche come 15 ° C sono comunemente utilizzati per migliorare la riproducibilità delle misurazioni meccaniche 1,2,3,5,8,12,17,27, è possibile generare dati validi ad altre temperature 23 , 28 purché gli effetti della temperatura sulla proprietà della soluzione (concentrazione di calcio, pH, etc.) sono presi in considerazione. </p&gt; Le composizioni delle soluzioni di prova sono tra gli aspetti più critici delle tecniche fibre permeabilizzate qui descritte. Considerazioni riguardanti composizione della soluzione sono complesse e al di là della portata di questo articolo. Le soluzioni descritte al punto 5 della sezione di protocollo sono stati progettati con particolare attenzione alla rapida attivazione delle fibre permeabilizzate sul suo trasferimento da pre-attivazione per attivare soluzioni, pur mantenendo una forza costante ionica, la composizione cationica, e osmolarità 6,29. Altri approcci alla composizione della soluzione sono stati impiegati con notevole successo da parte di altri gruppi di ricerca e di solito fare uso di costanti di legame pubblicati e strumenti computazionali 27,30,31. Le concentrazioni di ioni calcio nelle varie soluzioni attivanti è particolarmente importante negli studi che coinvolgono l&#39;attivazione submassimale come valutazioni forza-PCA. Per gli esperimenti in cui le fibre sono completamente attivati, come quelli descrivered qui, la concentrazione di calcio nella soluzione attivante supera tipicamente da un margine comodo quella necessaria per ottenere la massima forza, rendendo la sua precisa conoscenza meno critica. L&#39;aggiunta di creatina fosfato è importante per la bufferizzazione fluttuazioni ATP e ADP intramyofibrillar che altrimenti essere associati con attività contrattile. La creatina chinasi è necessaria per catalizzare il trasferimento di fosfato da creatina fosfato a ADP. In condizioni sperimentali che determinano elevati tassi di turnover ATP, compresi lavorare ad alte temperature o di misura accorciamento ad alta velocità in fibre veloci 32, creatina chinasi deve essere aggiunto alla soluzione per integrare la creatina chinasi endogena che rimane legata alla fibra. Per le condizioni sperimentali meno impegnative, il sistema di rigenerazione ATP è meno critica 27. Limitazioni della tecnica singola fibra permeabilizzate sono i seguenti. I dati generati da queste prove definiscono laproprietà contrattili dell&#39;unità miofibrillare specifico che è stato attaccato alla apparato sperimentale. Di conseguenza, questo cattura solo una piccola parte dell&#39;intera fibre multinucleate da cui è stato ottenuto il segmento che, a sua volta, rappresenta una piccola frazione del numero totale di fibre all&#39;interno del muscolo. Gli investigatori dovrebbero pertanto considerare attentamente il campionamento necessaria per supportare tutte le conclusioni tratte dagli esperimenti. Inoltre, la valutazione dell&#39;impatto di un intervento allenamento sulla funzione fibra presume che le fibre valutati sono stati effettivamente assunti durante l&#39;allenamento. Sebbene il protocollo cerca di imitare il naturale ambiente intracellulare della fibra, il processo permeabilizzazione sarcolemma è aspecifica e necessariamente permette costituenti intracellulari solubili a diffondersi liberamente nelle soluzioni balneari. Un&#39;ulteriore conseguenza della permeabilità della membrana è un cambiamento nell&#39;equilibrio osmotico evidenziato da un rigonfiamento in volume delle fibre 33. Ilfibra gonfiore aumenta la distanza tra actina e miosina conseguente ridotta sensibilità al calcio del sistema myofilament 34,35, ma può essere invertito con l&#39;introduzione di grandi composti osmoticamente attivi 34. Una limitazione finale da considerare è la conseguenza della tecnica utilizzata per collegare fibre all&#39;apparato sperimentale. Ciò richiede invariabilmente distorcere il rapporto spaziale all&#39;interno del sistema filamento in e in prossimità dei punti di attacco, con frequentando deficit funzionali. In particolare, le regioni della fibra alla e adiacente ai punti di aggancio sono funzionalmente compromesse e contribuendo così serie artefatta elasticità al sistema di misura. In sintesi, abbiamo descritto un mezzo per valutare la capacità di generare forza delle fibre muscolari scheletriche permeabilizzate chimicamente in vitro. Anche se il focus di questo articolo è stato sulla valutazione di massima forza isometrica generating capacità delle fibre muscolari scheletriche umane, l&#39;approccio sperimentale può essere modificato ed esteso per determinare una serie di parametri e relazioni cinetici in una vasta gamma di specie di mammiferi, o in altro modo.

La funzione primaria del muscolo scheletrico è di generare forza. Forza muscolare è suscitato in vivo attraverso una complessa sequenza di eventi che comprende i potenziali nervose motorie azione, la trasmissione neuromuscolare, potenziali d&#39;azione delle fibre muscolari, il rilascio di calcio intracellulare, e l&#39;attivazione del sistema di proteine ​​regolatrici e contrattili. Poiché la generazione di forza è il risultato finale di questa sequenza, un deficit in forza potrebbe essere causato da guasto di una o più delle singole fasi. Una caratteristica fondamentale della preparazione di fibre permeabilizzate è che elimina la maggior parte dei passaggi necessari per la generazione di forza in vivo, con solo le funzioni di regolamentazione e contrattili associati con l&#39;apparato miofibrillare residuo. L&#39;investigatore si assume il controllo della consegna di attivare calcio e di energia (ATP), e viene ricompensato con un sistema semplificato che consente la valutazione dei isolate strutture normative e contrattili nella loro co nativonfiguration. Le misurazioni della forza utilizzando fibre muscolari scheletriche permeabilizzate sono quindi preziosi nel valutare alterazioni della funzione muscolare osservata in vivo. Per esempio, abbiamo usato questa tecnica per caratterizzare la capacità di forza generatrice di fibre da miostatina topi deficienti 1 e per valutare la causa della debolezza muscolare persistente esposto seguente rotatori cronica della cuffia lacrime 2,3. Metodologia fibra permeabilizzate moderna può essere fatta per primi studi autorevoli 4,5 ed è attualmente in uso da parte di un certo numero di gruppi di ricerca. Sebbene le tecniche sono state descritte in letteratura, che non sono ancora stati presentati in formato video. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di illustrare una versione aggiornata, tecnica valida e affidabile per misurare la capacità massima forza generatrice di singole fibre da campioni muscolari scheletriche permeabilizzate chimicamente. Per realizzare ciò, un segmento singola fibra (qui indicata come ̶0; fibre &quot;) viene estratto da un fascio pre-permeabilizzate di fibre e posto in una camera sperimentale contenente una soluzione rilassante, la caratteristica principale che è una concentrazione di calcio che è &lt;10 nM. La fibra viene quindi collegato ad una estremità ad una forza-trasduttore e all&#39;altra estremità ad un regolatore di lunghezza. Con la fibra presso una lunghezza ottimale sarcomere, viene trasferito a una soluzione attivante che ha una concentrazione di calcio sufficiente per provocare la massima forza di attivazione e quindi massima contrazione isometrica. Dati Force sono acquisiti, archiviati e analizzati utilizzando un personal computer.

<table><tbody><tr><td>Provetta per coltura in polistirene con tappo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga con tappo a vite da 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per microcentrifuga da 0,5 ml con o-ring</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>Crioteca per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Sutura non sterile 10-0 monofilamento</td><td>Ashaway Line Twine</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>Perni per insetti Strumenti per</td> scienze <td>fini</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze - Dumont #5</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per microdissezione Strumenti per</td><td>scienze fini</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>Il micrometro MZ8</td><td></td></tr><tr><td>aziona</td> il termometro <td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Circolatore a bagnomaria&nbsp;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Serie 800</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Software</td><td>National</td> <td>Instruments-Computer</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sistema</td><td></td> a camera variabile <td></td></tr><tr><td></td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di lunghezza</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore di forza</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagenti</td></tr><tr><td>K-proprionato</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (acido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&toro; 0,56H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (acido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (acido)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>pH 7 standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

L'analisi delle proprietà contrattili delle fibre muscolari scheletriche chimicamente scuoiate, o permeabilizzate, offre un potente mezzo con cui valutare la funzione muscolare a livello della singola cellula muscolare. Gli studi su singole fibre muscolari sono utili sia nella scienza di base che negli studi clinici. Per gli studi di base, le misurazioni della contrattilità di una singola fibra muscolare consentono di studiare i meccanismi fondamentali della produzione di forza e l'analisi della funzione muscolare nel contesto delle manipolazioni genetiche. Clinicamente, gli studi sulle singole fibre muscolari forniscono informazioni utili sull'impatto di lesioni e malattie sulla funzione muscolare e possono essere utilizzati per guidare la comprensione delle patologie muscolari. In questo articolo video descriviamo i passaggi necessari per preparare e isolare un singolo segmento di fibra muscolare scheletrica, collegarlo a un apparecchio di misurazione della forza, attivarlo per produrre la massima forza isometrica e stimare la sua area della sezione trasversale allo scopo di normalizzare la forza prodotta.

Sano, permeabilizzate chimicamente singole fibre dovrebbero apparire uniformi in forma e avere una spaziatura striatura coerente se visto sotto alto ingrandimento. Fibre che sono inflessibile quando manipolato con le pinze o hanno evidenti danni strutturali devono essere eliminate. Alto ingrandimento immagini digitali scattate durante la fase 15 vengono analizzati per 5 misure di diametro accoppiati lungo la parte centrale della fibra. Fibra CSA calcola assumendo una sezione trasversale ellittica e una media di 5 misurazioni individuali CSA come illustrato nella Figura 7A. Figura 7B serve anche a illustrare come dimensioni fibra in una vista può essere significativamente diverso rispetto a dimensioni associato nel altra vista (cioè, incrociata sezioni non sono, in generale, rotondo). Rappresentativi forza tracce di fibre lente e veloci umani sono illustrati nelle figure 8A e 8B, rispettivamente. Voltage uscita della forza-trasduttore è acquisito durante un test e convertito forzare (mN) utilizzando software di acquisizione e analisi (LabVIEW). Figura 9 illustra l&#39;approccio utilizzato per valutare la forza attiva massima (F o), che è calcolato sottraendo la forza richiesta per mantenere la fibra alla lunghezza ottimale sarcomere mentre in uno stato rilassato (forza passiva, F P), dalla massima forza isometrica sviluppato durante l&#39;attivazione della fibra massimale (forza totale, F T). Poiché l&#39;uscita del trasduttore di forza che corrisponde alla forza zero è, in generale, diverso per ciascuna delle diverse stanze da bagno, brevemente allentare la fibra sia nel pre-attivazione e attivare soluzioni di catturare il livello zero forza nel disco sperimentale. Normalizzazione della massima forza attiva da fibra CSA viene utilizzato per generare il valore più informativo di forza specifica (SF o). Poiché prende in considerazione la CSA della fibra, SF o </sub&gt; fornisce una misura della capacità intrinseca forza generatrice dell&#39;apparato contrattile della fibra, consentendo così confronti funzionali tra fibre di dimensioni diverse. Va tuttavia osservato che le misurazioni CSA non sono in grado di distinguere la proporzione della fibra occupata da filamenti contrattili contro la proporzione occupata da altre strutture subcellulari. Caratteristiche tipiche di sano, fibre adulti di Claflin et al. 2011 10 per l&#39;uomo, Mendias et al. 2011 1 per mouse e Gumucio et al. 2012 2 per ratto sono dettagliati in tabella 3. Tutti i dati riportati nella tabella 3 sono stati generati utilizzando il tecniche descritte in questo articolo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Umano (Vasto laterale) </strong&gt; </td><td> Topo (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Ratto (Sottospinato) </td></tr><tr><td colspan="2"> Maschio </td><td colspan="2"> Femminile </td><td> Maschio </td><td> Maschio </td></tr><tr><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> (Non digitato) </td><td> (Non digitato) </td></tr><tr><td> CSA (micron 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F o (Mn) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64-0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14-0,25 </td><td> 0,55-0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Caratteristiche tipiche di fibre, adulti sani dal vasto umano lateralis 10, mouse estensore lungo delle dita 1 e ratto infraspinato 2 muscoli. Lunghezze sarcomero ottimali sono stati fissati a 2,7 micron per le fibre umane 7,8 e 2,5 micron sia per mouse (36, 37) e le fibre di ratto (38). Gamme Sperimentale L F (25 ° e 75 th quartili) erano 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm e 1,32-1,59 mm rispettivamente per uomo, topo e ratto. Intervalli mostrati indicano il 25 e 75 th quartili e n è il numero di fibre testate. I problemi più comuni emersi durante i test includono una scivolata cappio di sutura, che si traduce in una forza response con un &quot;catturare&quot; come quello illustrato in Figura 10A, e uno spessore rottura parziale o totale della fibra, che si traduce in una risposta forza che restituisce bruscamente verso o per (break) zero, mentre la fibra è ancora immersa in soluzione attivazione (Figura 10B). Se un lapsus, strappo o rottura si verifica nel corso di un esperimento, la fibra deve essere eliminata e esclusi i dati, pur mantenendo un record di fallimenti in fibra può anche essere informativo 11. Un altro risultato negativo che possono verificarsi è l&#39;attivazione prematura della fibra mentre nel pre-attivazione della soluzione (Figura 10C). Attivazione parziale nella soluzione pre-attivante suggerisce un notevole contaminazione incrociata bene (cioè, un aumento non intenzionale della concentrazione di calcio nel pre-attivazione ben). In questo caso, tutte le vasche devono essere aspirati e risciacquati con acqua deionizzata. Asciugatura le superfici divisorie tra le camere è anche raccoded come umidità o condensa in queste aree può portare a traspirazione di soluzione tra bagni. La decisione di includere o escludere i dati dipende in ultima analisi l&#39;attenzione sperimentale e devono pertanto essere considerati quando si progetta lo studio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figura 1: ciclo di sutura (10-0 monofilamento di nylon di sutura). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figura 2:. Dissezione Bundle forcipe sono in mano sinistra, le forbici di microdissezione sono nella mano destra. Linea rossa indica l&#39;orientamento favorevole del polso e forbici con gli assi longitudinali delle fibre. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; (A) Apparecchio di prova con i componenti etichettati. (A) camere sperimentali con fondo trasparente. (B) Lunghezza-controller. (C) Forza-trasduttore. (D) sorgente luminosa. (E) di lunghezza controllore xyz auto micrometrica con display digitale. (F) unità Fase micrometrica con display digitale. (G) Forza trasduttore auto xyz micrometro. (H) Piattaforma per lo schermo l&#39;obiettivo di laser-diffrazione calibrato. Tavolo isolamento (i) Vibrazione. (B) Close-up vista delle camere sperimentali. Di superficie (j) allegato in acciaio inox che si estende dal controller lunghezza. Di superficie (k) allegato in acciaio inox che si estende dalla forza-trasduttore. (L) Side-view prisma. (M) alloggiamento per moduli di raffreddamento termoelettrici. (N) termocoppia per la segnalazione di te da cameramperature. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figura 4: Modificato 100 microlitri punta pipetta utilizzato per trasferire la fibra da piatto dissezione a camera sperimentale. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figura 5:. Montaggio singola fibra su dispositivi sperimentali (A) loop di sutura preparati infilate su superfici di fissaggio in acciaio inox. (B) fibra trasferito alla camera sperimentale. (C) Fiber ancorata alle superfici di fissaggio di acciaio inossidabile dalla prima coppia di anelli di sutura con eccesso suture rimosso. (D) Seconda coppia di anelli di sutura filettati sulla sommità di loop prima sutura e legato in posizione. <img alt="Figura 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6: lunghezza sarcomero è valutata dalla proiezione di un modello di interferenza laser su uno schermo di destinazione calibrato (a) sorgente laser.. (B) Mirror. (C) schermo di destinazione. Pattern di interferenza (d) Laser. <img alt="Figura 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="Figura 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figura 7: (A) Determinazione della zona della fibra in sezione ed in lunghezza ottimale sarcomero (umana = 2,7 um). Assumendo una sezione trasversale ellittica, CSA è calcolato per ciascuna delle cinque posizioni lungo la parte mediana fibra e la media dei cinque misurazioni individuali è segnalato come fibra CSA. 2a rappresenta top diametro vista ed è<html> un asse dell&#39;ellisse, 2b rappresenta vista laterale diametro ed è l&#39;altro asse dell&#39;ellisse. (B) immagini fibra Rappresentante illustrano ciascuna delle cinque misurazioni del diametro corrispondente, sia nella vista dall&#39;alto e laterale. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figura 8: Rappresentante forza tracce di sano vasto umano lateralis fibre muscolari (A) Tipo 1 fibre (CSA: 5710 micron 2, F o: 0.89 milioni di euro e sF o: 156 kPa).. (B) Tipo fibra 2a (CSA: 9510 micron 2, F o: 1.66 mN e SF o: 174 kPa). Fibra miosina a catena pesante è stato determinato attraverso l&#39;utilizzo di separazione elettroforetico e argento-colorazione tecniche 22. OAD / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9: Calcolo della forza attiva massima (F o) (a), vista espansa della risposta forza fibra durante il-gioco che induce il movimento di lunghezza controller avviato in soluzione pre-attivazione.. F P è la forza richiesta per mantenere una lunghezza sarcomero di 2,7 micron con la fibra a riposo. (B) Vista estesa di lunghezza-controller di movimento-gioco che inducono. Si noti che F o F = T - F P. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figura 10: slittamento (A) cappio di sutura, evidenziato da un &quot;fermo&quot; in vigore traccia durante l&#39;aumento di forza. Controllare per essere sicuri i cicli siano sicuri prima di attivare la fibra. (B) rottura della fibra durante l&#39;attivazione. Può essere dovuta a integrità fibra poveri o trattamento fibra aggressivo durante sutura posto ciclomento. (C) l&#39;attivazione della fibra parziale prematura a causa della contaminazione di camera di pre-attivazione con Ca 2+.

Analisi delle proprietà contrattili delle fibre muscolari chimicamente dalla pelle, o permeabilizzate, scheletriche offre un potente strumento con cui valutare la funzione muscolare a livello della cellula muscolare singolo. In questo articolo descriviamo una tecnica valida e affidabile per preparare e testare permeabilizzate fibre muscolari scheletriche in vitro.

Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la capacità massima di generazione di forza isometrica di singole fibre provenienti da campioni di muscolo scheletrico resi chimicamente permeabili. Questo risultato si ottiene innanzitutto esponendo le membrane delle fibre muscolari a un detergente chimico, rimuovendo così la barriera tra i contenuti extracellulari e intracellulari. Il secondo passaggio consiste nell'estrarre una singola fibra da un piccolo fascio di fibre e nell'attaccarla all'apparato sperimentale.Successivamente, vengono utilizzati modelli di interferenza laser per impostare la lunghezza ottimale del sarcomero per la singola fibra. Infine, viene somministrato calcio per indurre la forza massima di contrazione isometrica. In definitiva, la tecnica della singola fibra permeabilizzata consente di valutare le proprietà contrattili del muscolo scheletrico senza le complessità associate all'architettura del muscolo intero.La dimostrazione visiva di questo metodo è utile poiché i passaggi chiave per eseguire correttamente il protocollo possono risultare difficili da apprendere. Iniziare preparando le soluzioni per la dissezione, lo stoccaggio e i test come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, utilizzare pinze per preparare dei cappi di sutura da filamenti di sutura monofilamento in nylon USP 10 zero.Utilizzando la tecnica del nodo doppio, preparare quattro cappi per ogni fibra da testare. Una volta formato, posizionare il nodo sotto un microscopio e ridurne le dimensioni a un diametro di circa 750 micrometri, utilizzando i segni dell'IPS GTI come guida.Quindi tagliare l'eccesso di sutura, lasciando solo la cravatta e piccole estremità lunghe 500 micrometri su entrambi i lati. Trasferire una piccola quantità di tessuto muscolare ottenuta mediante biopsia aperta o con ago in una piastra contenente soluzione di dissezione fredda e aggiungere altra soluzione di dissezione per assicurare che il tessuto rimanga completamente immerso. Esaminare il campione al microscopio e manipolarlo in modo da allineare l'asse longitudinale delle fibre verso la spalla destra dell'operatore.Quindi fissare il campione alla piastra bloccandolo agli angoli con la pinzetta nella mano sinistra e le forbici da microdissezione nella mano destra. Iniziare delicatamente a dissezionare un fascio lungo i margini longitudinali tra le fibre. Rimuovere e scartare qualsiasi tessuto danneggiato dalla pinzetta o dai perni.Come risultato del processo di dissezione, trasferire i fasci dalla soluzione di dissezione in una provetta da tre millilitri contenente 2,5 millilitri di soluzione di dissezione fresca e refrigerata, alla quale è stato aggiunto un detergente non ionico. Incubare il campione sul ghiaccio per 30 minuti, agitando delicatamente di tanto in tanto, e assicurarsi che i fasci rimangano completamente immersi per tutta la durata dell'incubazione. Successivamente, trasferire i fasci in una provetta contenente soluzione di dissezione fresca e agitare delicatamente e brevemente per rimuovere qualsiasi residuo di detergente.Dopo averli risciacquati, trasferire i fasci in una provetta contenente soluzione di conservazione fredda e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere la provetta dalla conservazione a quattro gradi Celsius e trasferire tutti i fasci in un bicchierino da medicina o in una bacinella per dissezione. In previsione della conservazione, trasferire i fasci in provette criogeniche etichettate singolarmente, riempite con da 200 a 400 microlitri di soluzione di conservazione fresca, e assicurarsi che il fascio non sia attaccato alla parete della provetta o galleggi sulla superficie.Quindi chiudere il tubo e conservare il campione a meno 80 gradi Celsius. Allestire un apparato sperimentale come quello mostrato qui e descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, riempire la prima camera sperimentale con soluzione rilassante, la seconda camera con soluzione pre-reattivante e la terza con soluzione attivante.Regolare la temperatura nella camera fino a quando non raggiunge un valore costante di 15 gradi Celsius con l'apparato immerso nella soluzione rilassante. Infilare due dei lacci di sutura preparati sulle superfici di attacco in acciaio inossidabile che sporgono sia dal trasduttore di forza che dal regolatore di lunghezza. Successivamente, scongelare un fascio di fibre di interesse su ghiaccio per circa 15 minuti, quindi trasferirlo in una capsula di Petri rivestita con elastomero di silicone riempita con soluzione rilassante fresca e fredda.Fissare il fascio in posizione con perni a ciascuna estremità e assicurarsi che sia completamente immerso utilizzando la pinzetta. Afferrare una fibra a un'estremità e iniziare a estrarla con movimenti regolari lungo il suo asse longitudinale. È necessario prestare attenzione durante l'estrazione delle fibre dal fascio, poiché le adesioni tra le fibre e la matrice extracellulare possono generare una tensione eccessiva, portando infine a danni indotti da stiramento.Dopo l'estrazione, inserire la fibra in una punta di pipetta modificata insieme a una piccola quantità di soluzione rilassante e trasferirla nella camera sperimentale che contiene la soluzione, guidandola delicatamente con la pinzetta. Rimuovere la fibra dalla punta della pipetta e fissarla al controllore di lunghezza. Utilizzando il primo cappio di sutura, posizionare l'altra estremità della fibra verso il trasduttore di forza e fissare la fibra seguendo la stessa procedura.Rimuovere qualsiasi eccesso di sutura utilizzando le forbici da dissezione microchirurgiche. Successivamente, passare il secondo cappio sopra il primo e fissare la fibra in un punto entro 0,2 millimetri dell'estremità della superficie di attacco del regolatore di lunghezza. Ripetere l'operazione con il secondo cappio all'estremità della fibra collegata al trasduttore di forza.Regolare la posizione del regolatore di lunghezza lungo l'asse Y in modo da allineare la fibra parallelamente alle pareti laterali della camera sperimentale. Successivamente, osservare la fibra dalla vista laterale del prisma e regolare la posizione del regolatore di lunghezza lungo l'asse Z finché la fibra non risulta parallela al fondo della camera. Se la fibra è danneggiata in qualsiasi modo, essa deve essere scartata e una nuova fibra deve essere collegata.Accendere il laser e regolare la posizione della piastra in modo che il laser passi attraverso il centro della fibra. Successivamente, impostare la lunghezza del sarcomero aumentando o diminuendo la tensione sulla fibra mediante il micrometro del controllore di lunghezza sull'asse X, fino a osservare sullo schermo bersaglio la distanza desiderata della luce diffratta. Dopo aver impostato la lunghezza ottimale del sarcomero, misurare la distanza tra le due suture più interne.Posizionare la camera in modo che il reticolo verticale dell'oculare sia allineato con il bordo più interno di una sutura interna e con lo zero. Il display digitale del micrometro guida lo spostamento del palchetto lungo l'asse x rispetto al microscopio, fino a quando il reticolo verticale dell'oculare è allineato con la sutura più interna. Il display digitale indicherà la lunghezza della fibra, mantenere la fibra alla lunghezza misurata e utilizzare la fotocamera montata sul microscopio per acquisire un'immagine ad alta ingrandimento della porzione centrale della fibra, sia da una vista superiore che laterale.Utilizzare queste immagini per calcolare l'area della sezione trasversale della fibra. Utilizzare il software di controllo della camera per spostare la fibra nella camera contenente la soluzione pre-reattivante e incubare per tre minuti. Mentre la fibra è nella soluzione inattivante, misurare la sua tensione passiva, quindi spostare la fibra nella camera contenente la soluzione attivante e lasciare sviluppare la forza isometrica massima, come indicato da un plateau della forza preceduto da un rapido aumento.Successivamente, utilizzare il controllo della lunghezza per applicare una rapida e breve riduzione della distanza tra i punti di attacco della fibra, seguita da un rapido ritorno alla lunghezza originale, al fine di identificare l'uscita del trasduttore di forza corrispondente a zero. Le forze mostrate qui sono viste sia dalla parte superiore che laterali di una fibra di forma ellittica, ottenute da queste prospettive. L'area della sezione trasversale è stata determinata misurando i diametri in cinque punti lungo la lunghezza della fibra e calcolando quindi la media delle cinque aree risultanti.Tracce di forza ottenute da fibre muscolari umane, lente e veloci mostrano che le fibre veloci generano forza a un ritmo maggiore rispetto alle fibre lente, utilizzando la tecnica illustrata in questo video. Le caratteristiche tipiche delle fibre muscolari di uomo, topo e ratto sono state misurate e sono presentate qui. L'intervallo indicato corrisponde ai quartili dal 25° al 75° e N rappresenta il numero di fibre testate.Si noti l'ampia variabilità della forza specifica tra le diverse specie. Le procedure descritte qui consentono di valutare la massima capacità intrinseca di generare forza di una singola fibra muscolare scheletrica, aggiungendo ulteriori interventi, importanti aspetti della fisiologia del muscolo scheletrico, tra cui, tra gli altri, la relazione lunghezza-forza, la relazione forza-velocità e le relazioni forza-calcio.

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo video dimostra la modulazione di attività riflessa, la forza volitiva e deambulazione mediante valutazioni cliniche e quantitativa in individui con motore incompleto SCI a seguito di somministrazione orale acuta di un inibitore della ricaptazione della serotonina (SSRI).

I metodi per quantificare alterazioni indotta farmacologicamente in funzione motoria in Human incompleta SCI

Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

Questo video dimostra la preparazione chirurgica e le procedure necessarie per studiare le risposte contrattili del gastrocnemio mediale preparazione muscolare di...

Procedure di Rat<em&gt; In situ</em&gt; Proprietà muscolatura scheletrica contrattili

Descriviamo un metodo per misurare direttamente la forza muscolare, potenza muscolare, cinetica contrattili e affaticabilità dei muscoli scheletrici isolati in...

Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

Misurazioni funzione muscolare contribuiscono alla valutazione dei potenziali terapie per patologie muscolari, nonché alla determinazione dei meccanismi sottostanti fisiologia di questo tessuto. Si dimostrerà la preparazione del muscolo estensore lungo delle dita e muscoli del diaframma per i test funzionali. Protocolli per contrazioni isometriche ed eccentriche verrà mostrato, così come le differenze nei risultati tra muscoli distrofici, che rappresentano uno stato patologico, e muscoli di...

Isometrica ed eccentrica valutazione della forza dei muscoli scheletrici Isolato da modelli murini di distrofie muscolari

Presentiamo un protocollo per valutare i cambiamenti nella funzione neuromuscolare. La stimolazione nervosa elettrica percutanea è un metodo non invasivo che evoca risposte muscolari. Le proprietà elettrofisiologiche e meccaniche di queste risposte permettono di valutare la funzione neuromuscolare dal cervello al muscolo (a livello sopra-spinale, spinale e periferico).

Valutazione della Neuromuscolare Funzione Con percutanea stimolazione elettrica del nervo

Descriviamo un protocollo in vivo per misurare la dorsiflessione del piede in seguito alla stimolazione del nervo peroneo e alla contrazione del compartimento crurale anteriore dell'arto posteriore del ratto. Tali misurazioni sono uno strumento traslazionale indispensabile per valutare la patologia del muscolo scheletrico e gli approcci di ingegneria tissutale alla riparazione e alla rigenerazione muscolare.

applicazioni di<em&gt; In Vivo</em&gt; Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione

Una valutazione funzionale della giunzione neuromuscolare (NMJ) può fornire informazioni essenziali sulla comunicazione tra nervo e del muscolo. Qui descriviamo un protocollo per valutare globalmente la giunzione neuromuscolare e il muscolo funzionalità utilizzando due preparazioni diverse del nervo-muscolo, cioè Soleo-sciatic e diaframma-frenico.

Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.

Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton

La valutazione del recupero motorio rimane la misura di risultato di riferimento negli studi sperimentali sui nervi periferici. La misurazione della forza tetanica isometrica del muscolo tibiale anteriore nel ratto è uno strumento inestimabile per valutare gli esiti funzionali dopo la ricostruzione dei difetti nervosi sciatici. I metodi e le sfumature sono dettagliati in questo articolo.

Misurazione massima della forza tetanica isometrica del muscolo anteriore tibiale nel ratto

Il presente protocollo descrive dettagli sperimentali concisi sulla valutazione e l'interpretazione dei dati di coppia in vivo ottenuti tramite stimolazione elettrica del nervo peroneale comune in suini anestetizzati.

In vivo Misurazione della coppia isometrica del dorsiflexor hindlimb da pig

Impara a misurare la forza isometrica massima generata da singole fibre muscolari scheletriche permeabilizzate. Questo metodo consente di valutare le proprietà contrattili in vitro senza le complessità dell'architettura muscolare completa.

Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

Esplora altri video