Name: Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nellembrione mouse Uso In Vivo E In Vitro Saggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri la caratterizzazione dei progenitori timici assestanti nell'embrione di topo usando saggi in vivo e in vitro. Questo metodo consente la maturazione completa delle cellule T da progenitori definiti.

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Dichiarazione etica: tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo l&#39;Istituto Pasteur Etica Carta, approvato dal Ministero dell&#39;Agricoltura francese, e gli orientamenti dell&#39;Unione europea. Un manipolatore con la formazione su piccola chirurgia roditore, certificato dal Ministero dell&#39;Agricoltura francese, esegue tutti gli interventi chirurgici. NOTA: Vedere in allegato la tabella 1 mostra la procedura di programma in 5 fasi. 1. Selezione degli embrioni <ol><li> Utilizzare 36 C57BL femmine / 6 CD45.2, 12 femmine CD45.1, 12 C57BL / 6 maschi e 12 CD45.1 C57BL / 6 maschi CD45.2. Attraversando le femmine sia con genotipo maschio produrrà embrioni CD45.1 / 2 e CD45.1 usati come fonte di TSP o CD45.2 utilizzato come fonte di destinatario lobi timici. Casa tutti i maschi singolarmente. </li><li> Per ottenere embrioni per isolamento E18 TSP, mettere 2 femmine in una gabbia con uno CD45.1 maschile alle 06:00, 21 giorni prima dell&#39;esperimento innesto. Verificare la presenza di un tappo vaginale il giorno dopo, prima di mezzogiorno. Sepavalutare le femmine collegati. </li><li> Per ottenere gli embrioni E14 per essere colonizzata da TSP, ripetere la procedura (1.2), utilizzando i maschi CD45.2, 17 giorni prima dell&#39;esperimento innesto. </li><li> Per ottenere gli embrioni per isolare E13 TSP, ripetere la procedura (1.2), utilizzando i maschi C57BL / 6 CD45.1, 16 giorni prima dell&#39;esperimento innesto. </li></ol> 2. Dissezione del embrioni Sotto una orizzontale flusso laminare Hood NOTA: due giorni prima dell&#39;esperimento innesto. <ol><li> Sacrificare le femmine gravide per dislocazione cervicale o progressiva somministrazione di gas CO 2 per almeno 5 minuti, in una camera chiusa saturante. Garantire la morte per arresto definitivo dei movimenti cardio-respiratorio. Bagnare l&#39;addome con il 70% di etanolo. </li><li> Fate una incisione longitudinale nella pelle all&#39;addome linea mediana e aprirlo tirando la pelle a parte. Aprire il peritoneo con pinze e forbici senza toccare il tratto digestivo. Estrarre il uter bifidanoi e separarlo dalla vagina con le forbici. </li><li> Mettere l&#39;utero in una capsula di Petri di 90 x 15 mm, contenente 40-50 ml DPBS e tagliare trasversalmente tra decidua di ogni embrione. </li><li> Con la coppia di forbici punta fine e una pinza sottile rimuovere la membrana muscolare dell&#39;utero, togliere gli embrioni tagliando tra la placenta e il sacco vitellino, e rimuovere i amnios, che è mantenere gli embrioni. </li><li> Mettere gli embrioni in una capsula di Petri 90 x 15 mm contenente siero fetale di vitello HBSS + 1% (FCS). Per gli embrioni più vecchio di E15, togliere le teste con un paio di forbici prima di ogni ulteriore dissezione. </li></ol> 3. Isolamento del timo <ol><li> Sotto la lente d&#39;ingrandimento binoculare, posizionare l&#39;embrione, che giace in posizione supina (vista ventrale), su un letto di garza umida. </li><li> Inserire una pinza longitudinalmente lungo la cartilagine dello sterno, pizzico e aprire la griglia toracica. Con pinze curve, tirare la parete toracica da parte per visualizzare il tlobi hymic su ciascun lato della trachea. </li><li> Tenere con cura ogni lobo pizzicando sotto con una pinza sottile e metterli in una capsula di Petri contenente 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolare i lobi e rimuovere il tessuto connettivo circostante con due 1 ml siringhe + 26 G ⅜ &quot;aghi, senza danneggiare la capsula. </li><li> Lavare lobi in 3 ml di HBSS + 1% FCS per eliminare le cellule del sangue. NOTA: Prima E15, lobi timici sono situate su ciascun lato della trachea e fusibile successivamente nel mezzo di costituire un organo bi-lobare. </li></ol> 4. sospensioni cellulari <ol><li> Tease oltre i lobi sotto la lente di ingrandimento binoculare, con due aghi 26 G montate su 1 ml siringhe, in HBSS + 1% FCS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una maglia di nylon. </li></ol> 5. La colorazione con anticorpi fluorescenti e ordinamento delle cellule NOTA: Tutti gli anticorpi sono già titolati per ottenere la definizione ottimale delle popolazioni (il titration può variare con il lotto di anticorpi). <ol><li> Incubare i timociti (E13 o E18) per 15-30 minuti a 4 ° C con 100 pl di un cocktail di anticorpi biotinilati per colorare le cellule positive lineage (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , CD11c anti-, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Per lavare via l&#39;eccesso di anticorpi rallentano i tubi con 4 ml HBSS + 1% FCS a 280 xg per 7 minuti, eliminare il supernatante e ri-sospensione il pellet in fresco HBSS + 1% FCS. Ripetere la centrifugazione. </li><li> Incubare le cellule marcati con biotina E18 con microsfere streptavidina durante 15 min a 4 ° C e lavare le cellule due volte in HBSS 1% FCS. Risospendere le cellule in 2 ml HBSS + 1% FCS. La maggior parte dei timociti E13 sono lignaggio negativo e, pertanto, non hanno bisogno di MACS arricchimento prima separazione delle cellule. </li><li> Passare le celle nella colonna LS, secondo le istruzioni del produttore. Quando tutta la sospensione cellulare è entrato colonna aggiungere 2 ml HBSS + 1% FCS. Recuperare il4 ml della colonna scorrono attraverso e centrifugare le cellule per 7 minuti a 280 x g. </li><li> Risospendere il pellet di una impoverito E18 o totali timociti E13 in 50 ml di miscela di anticorpi TSP (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 e streptavidina Pacific Blue ) e incubare per 20 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 4 ml HBSS + 1% FCS e risospendere le cellule in 1 ml HBSS + 1% FCS con ioduro di propidio. </li><li> Ordinare il TSP Lin - CD44 + CD117 + CD24 basso CD127 + CD135 + cellule in un FACS (con 4 laser) su un provette da 1,5 ml contenenti 200 ml terreno completo + 20% FCS. Prima porta le cellule in base alle loro dimensioni e granularità sulla FSC e canali SSC. Eliminare le cellule morte (colorazione con ioduro di propidio), cancello fuori doppiette e segnare la fluorescenza in scala esponenziale. Circa 100 o 600 TSP possono essere ottenuti da uno E13 o E18 uno timo, respectively. </li></ol> 6. La colonizzazione di E14 timica lobi con Progenitori: Hanging Tecnica Goccia <ol><li> Irradiare (30 Grays = 30 Gy) E14 lobi del timo da embrioni CD45.2, 3 ore prima della cultura. NOTA: E14 o E15 lobi timici sono stati utilizzati con successo come destinatario di progenitori delle cellule T. Utilizzando destinatari lobi timici di successivi giorni gestazionale risultati in necrosi precoce a causa delle dimensioni più grandi dell&#39;organo mentre lobi del timo in precedenti giorni di gestazione sviluppano male, probabilmente a causa di sviluppo incompleto delle cellule epiteliali. </li><li> Centrifuga allineati TSP e risospendere le cellule in terreno di coltura (OPTI-MEM terreno completo con il 10% FCS, penicillina (50 unità / ml), streptomicina (50 mg / ml) e 2β-mercaptoetanolo (50 micron)) tale che 35 ml contiene 500 TSP. </li><li> Mettere una goccia di 35 ml di sospensione cellulare ogni altro bene di una piastra ben Terasaki 60. NOTA: 35 gocce microlitri può fondere se sono collocati in pozzi contigui. </li><li> Inserire un lobo irradiati sulla superficie di ciascuna goccia. Chiudere la piastra Terasaki e ruotare la piastra capovolta per consentire le cellule raggiungono il polo apicale della goccia per gravità. </li><li> Hit delicatamente il lato superiore della piastra capovolta per obbligare i lobi di scorrere verso il bordo apicale della goccia. Incubare la piastra Terasaki invertita in un incubatore umidificato per 48 ore a 37 ° C + 5% CO 2. Dopo la colonizzazione, sia la cultura E14 thymi in FTOC 7, o trapianto sotto la capsula renale di un destinatario del mouse per adulti 8. </li></ol> 7. fetale timica Cultura Organo <ol><li> Inserire 3 ml di terreno completo su una piastra di Petri da 35 mm. Inserire un filtro a membrana isopore galleggia sul supporto. Posizionare i lobi ricostituiti sul bordo della membrana con una pinza (non più di 8 lobi su una membrana). </li><li> Porre le capsule Petri contenenti lobi timici all&#39;interno di un piatto 90 millimetri Petri, insieme con un piatto 35 mm, senza coperchio, contenente 2 ml di water, per assicurare l&#39;umidità ottimale. Incubare 12 giorni a 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. Innesti sotto la capsula renale Under sterili Condizioni NOTA: Il parenchima renale è circondato da tessuto connettivo formando una capsula. La regione sub-capsulare è particolarmente ricca di vasi sanguigni e linfatici fornendo in tal modo un ambiente adatto per lo sviluppo di innesti (ad esempio, i lobi del timo, isole pancreatiche o cuori neonati). Innesti si realizza al rene sinistro perché è più accessibile rispetto al rene destro. CD3 - / - topi maschi sono stati utilizzati come destinatari evitando reazione GVH a causa di antigeni di istocompatibilità minori legate al cromosoma Y, perché la determinazione del sesso prima di E15 non è fatto facilmente. <ol><li> Sterilizzare gli strumenti ed indossare guanti sterili lungo la chirurgia. Anestetizzare il mouse per iniezione intra peritoneale di una soluzione di ketamina 10 mg / ml + Xylazina 1 mg /ml diluito in PBS: (50 a 100 microlitri per 10 g di peso corporeo), utilizzando una siringa da 1 ml. Verificare anestesia verificando la mancanza di riflessi interdigitali. Mettere una goccia di gel idro-Optimune su ciascun occhio per prevenire la disidratazione durante l&#39;anestesia. NOTA: La soluzione deve essere preparata estemporaneamente e riscaldata a temperatura ambiente prima dell&#39;iniezione. L&#39;anestesia dura almeno 20 minuti. Il grado di anestesia dovrebbe essere controllato lungo tutta la chirurgia. L&#39;anestesia può essere prolungata iniezione intra peritoneale di mezza dose ogni 20 min. </li><li> Posizionare il mouse sul lato destro, sotto una cappa a flusso lamina orizzontale. Sterilizzare il campo chirurgico con etanolo al 70% e il 10% di soluzione di ioduro dermica. Con una parte pinza capelli mouse lungo una lunghezza di 2 centimetri appena sopra l&#39;articolazione della zampa posteriore. Radere l&#39;area chirurgica. </li><li> Con un bisturi praticare un&#39;incisione 1,5 cm di lunghezza della prima, il tessuto cutaneo, quindi con forbici tagliare il tessuto muscolare. Applicare una leggera pressione su entrambi i lati dell&#39;incisione, Che costringerà il rene fuori della cavità addominale. </li><li> Applicare soluzione salina con un batuffolo di cotone con auricolari per mantenere il rene umido. Se avete difficoltà a esporre l&#39;organo, utilizzare una pinza piatta per estrarre il tessuto adipociti circostante a cui è collegato il rene. Mantenere il rene fuori della cavità retroperitoneale da un batuffolo di cotone posto sotto l&#39;organo. </li><li> Con due pinza sottile, praticare un foro 2-3 mm nella capsula (evitare di toccare il parenchima per prevenire le emorragie). Durante tutta la procedura chirurgica mantenere la capsula renale esposti continuamente inumidito. </li><li> Inserire attentamente i lobi sotto la capsula renale, mantenendo la parete della capsula aperta e far scorrere l&#39;innesto sotto la capsula verso il polo bordo. Posizionare fino a 6 lobi per rene. </li><li> Sostituire il rene nella cavità retro-peritoneale. Suturare la aponeurosi muscolare, poi la pelle con i singoli nodi chirurgo. Bagnare la ferita con soluzione al 10% di povidone ioduro. Posizionare il mouse su una pa riscaldatod a 37 ° C. </li><li> Indagine il mouse trapiantato fino al completo recupero dall&#39;anestesia per il controllo dei movimenti cardiaci, respiratori e basette, i colori delle mucose fino al recupero totale visto da Self Contained movimenti. NOTA: si consiglia l&#39;iniezione di soluzione analgesico (buprenorfina, 0,1 mg / kg) del muscolo intra subito dopo l&#39;intervento chirurgico e 2 giorni dopo l&#39;intervento per prevenire il dolore post-operatorio. </li><li> Mantenere l&#39;animale operato in isolamento fino alla completa guarigione. Controllare ogni giorno i punti della ferita per verificare e prevenire l&#39;infezione. Mai osservata infezione della ferita seguendo questa procedura. NOTA: analisi settimanale di cellule del sangue periferico dal CD3 - / - mice innestate consentono di rilevare la timica popolazioni provenienti originati sia da E13 o E18 progenitori utilizzando il marcatore allotypic CD45 e lignaggio cellule T anticorpi specifici (Figura 3). </li></ol> 9. Analisi della progenie TSP mediante citometria di flusso <ol><li&gt; stuzzicare il FTOCs individualmente per ottenere sospensioni singola cella (vedere paragrafo protocollo 4). </li><li> Sospensioni cellulari Macchia da lobi individuali con una miscela di anticorpi contenenti anticorpi che riconoscono CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE e incubare come descritto nel capitolo 5. </li><li> Risospendere le cellule in HBSS + 1% FCS + propidio ioduro e analizzare in un citometro a flusso (vedere i risultati in figura 2). </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Due saggi principali possono essere utilizzati per analizzare differenziazione delle cellule T ex vivo. Il più recentemente riportato è il co-coltura di progenitori emopoietici con cellule stromali BM, OP9, esprimendo i ligandi di Noth1, delta come 1 o 4 12. Questo test 2-D è facile da eseguire, altamente efficiente e sensibile, permettendo analisi a livello di singola cellula. Tuttavia, esso non sostiene lo sviluppo delle cellule T oltre lo stadio di DP né la generazione di γδ DETC 13, en...

Linfociti T, che porta il αβ o γδ recettore delle cellule T (TCR), si differenziano in un organo specializzato, il timo. Il timo completamente sviluppato è organizzato in due regioni distinte: la corteccia, dove progenitori timiche sviluppare e dove timociti che produttivamente riorganizzare i β TCR e catena geni α sono salvati dalla morte programmata (un processo noto come selezione positiva); e il midollo, dove scelto timociti con troppo forte reattività per auto-leganti vengono eliminati (selezione negativa) 1,2. Il timo proviene dallo strato endodermico del terzo sacchetto faringeo che è poi circondata da cellule mesenchimali 3. Si è colonizzata da progenitori ematopoietici a partire da giorno embrionali E12 e, da allora in poi, il reclutamento continua è necessaria per il normale sviluppo delle cellule T 4. Immigrati del timo evolvono attraverso fasi di sviluppo successive, orchestrato da un programma strettamente regolato, iniziato e maintained per l&#39;attivazione della via di segnalazione di Notch sui timociti in seguito all&#39;interazione con il suo ligando, delta come 4, espresso sulle cellule epiteliali del timo (TEC) 5. Sviluppo timocita inizia il cosiddetto CD4 - CD8 - doppia negativi (DN) fasi. Timociti DN possono essere ulteriormente suddivisi secondo l&#39;espressione di CD25 e CD44 in DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) e DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) e CD117 (c-Kit) suddivide ulteriormente il vano DN1 in 5 sottogruppi dove DN1A e b corrispondono ai primi progenitori timo (PTE). Timociti riordinare le δ, β e α catene TCR in fase di DN e sottoposti pre-TcR selezione (stadi DN3-DN4). Essi hanno inoltre il transito al CD4 + CD8 + doppio positiva (DP) del vano in cui la catena α TcR riorganizza prima sele positivi e negativiction. In questa fase la maggior parte dei timociti sono eliminati e solo una piccola percentuale (3-5%) raggiungono il CD4 + o CD8 + T maturi vano cella. La differenziazione percorso linfoide progredisce attraverso le tappe di HSC che generano progenitori multipotenti (MPP) e progenitori multipotenti linfoidi predisposte (LMPP) che hanno perso il eritrociti e megacariociti potenziale 6. LMPP sono fenotipicamente definito dall&#39;assenza di marcatori di cellule del sangue differenziate (lineage negative, Lin -), l&#39;espressione di c-kit (CD117), Sca-1 e Flt3 / Flk2 (CD135) e l&#39;assenza di livelli rilevabili di interleuchina ( IL) -7 recettore α catena (IL-7rα o CD127). LMPPs ulteriormente differenziarsi in progenitori comuni linfoidi (CLP) 7 che a quel punto hanno perso la capacità di generare cellule mieloidi. CLP conservare linfociti (B e T cellulare), delle cellule NK, DC e cellule linfoidi innate (ILC) potenziale, e differiscono da LMPP dall&#39;espressione di CD127 e l&#39;assenza di elevati livelli di Sca-1. Anche se la natura dei timici assestamento progenitori (TSP) è stato ampiamente dibattuto 8, è diventato recentemente chiaro che il cambiamento TSP fenotipo, il potenziale e la funzione di differenziazione, durante tutto lo sviluppo 9. Abbiamo eseguito in vitro e in vivo per caratterizzare il TSP, isolato da FACS cell sorting sia da E13 (prima onda) o E18 (seconda ondata). Fetali colture d&#39;organo del timo (FTOC) con lobi timici irradiati colonizzate da un numero uguale di E13 e E18 progenitori, tenendo diversi marker allotypic, ammessi dopo la loro prole in un ambiente di sviluppo simile e rivelate cellule proprietà intrinseche, diversi tra i due tipi di progenitori. Lobi del timo colonizzati da una E13 o E18 TSP permesso lo sviluppo senza selezione a causa della concorrenza tra i due progenitori. In vivo il trapianto dei lobi timici colonizzati ha dimostrato inoltre che anche tegli progenie maturo di E13 e E18 TSP hanno differenti proprietà biologiche in vivo. TSP dalla prima ondata rapidamente generano cellule T, ma danno origine a un basso numero di cellule αβ e γδ T. Tra questi ultimi abbiamo rilevato dendritiche cellule epiteliali Vγ5Vδ1 T (detc), che hanno un TcR invariante, migrano verso l&#39;epidermide in cui esercitano una funzione nella guarigione delle ferite e sono prodotti solo durante lo sviluppo embrionale 10. Al contrario, TSP dalla seconda ondata richiede tempo maggiore per generare un numero elevato di cellule TcR + T e non sono in grado di generare DETC.

<table><tbody><tr><td>Piastre di Petri per colture di tessuti plastici da 90 x 15 mm e 35 x 15 mm.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Campionamento</td></tr><tr><td>26 g &frac38; " Siringhe 0,45 x 10 mm con aghi</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell suspension</td></tr><tr><td>Panno di bullonaggio in rete di nylon sterilizzato pezzi da 50/50 mm.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtrazione di celle</td></tr><tr><td>Etanolo 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Azioni di sterilità</td></tr><tr><td>Ioduro Povidone 10% (Betadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Azioni di sterilità</td></tr><tr><td>Ketamina 100 mg/ml (soluzione madre)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesic</td></tr><tr><td>Xilazina 100 mg/ml in PBS (soluzione madre)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anestetico e miorilassante</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/ml soluzione madre</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Analgesico morfinico</td></tr><tr><td>Gel oftalmico (0,2% ciclosporina)</td><td>Schering-Plough Salute degli animali</td><td></td><td>Protezione degli occhi</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>per isolare gli embrioni</td></tr><tr><td>HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>per lavare via il sangue e sezionare gli embrioni</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Terreno per colture</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>additivo per colture</td></tr><tr><td>Penicilina e streptomicina</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibiotici per colture</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>additivo per colture</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Microscopio di dissezione</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Sorgente di lampada fredda</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compatto</td><td>Due fibre a collo d'oca adattate</td></tr><tr><td>Elastomero siliconico</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Cuscinetto di dissezione</td></tr><tr><td>Cucchiaio, rotondo e perforato</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Strumenti di dissezione</td></tr><tr><td>Fine forbici per iride</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Strumenti di dissezione</td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Strumenti di dissezione</td></tr><tr><td>Pinze: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Strumenti di dissezione</td></tr><tr><td>2 paia di pinze da orologiaio dritte e fini Dumont #5 punte sottili da 11 cm.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Strumenti di dissezione</td></tr><tr><td>Filo di poliammide con ago 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>per suture</td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>per suture</td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>Per mantenere la temperatura del topo durante l'anestesia</td></tr><tr><td>Membrana Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>Per</td></tr><tr><td>FTOC Terasaki 60 pozzetti piastre</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>Per appendere la tecnica della goccia</td></tr><tr><td>Tamponi di garza sterili 7,5 x 7,5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>Per applicare la soluzione disinfettante</td></tr><tr><td>Anticorpi marcati con fluorescenza o biotina</td><td>BD Biosciences, Biolegend o e-Biocsiences&nbsp;</td><td>Numero di cloni, vedere la tabella sottostante</td>: <td>Cellule di colorazione</td></tr><tr><td>, Colonne MACS/Microsfere di streptavidina,</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td>, <td>Deplezione cellulare,</td></tr><tr><td>Topi,</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) e Janvier Labs. (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 O CD45.2</td><td>Fonte di cellule e lobi timici</td></tr><tr><td>Topi</td><td>CDTA Orl&eacute; ans, Francia</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Esperimento di innesto</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione di timica assestamento progenitori nell&#39;embrione mouse uso<em&gt; in vivo</em&gt; e<em&gt; in vitro</em&gt; saggi

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caratterizzare timo sedimentazione progenitori è importante per comprendere le fasi di pre-timici di sviluppo delle cellule T, essenziale per elaborare strategie di sostituzione delle cellule T nei pazienti linfocitopenico. Abbiamo studiato timica stabilirsi progenitori da murino giorno embrionale 13 e 18 thymi da due complementari in vitro ed in vivo le tecniche, sia in base al metodo &quot;goccia appeso&quot;. Questo metodo ha permesso la colonizzazione irradiati lobi del timo fetale con E13 e / o E18 progenitori timo distinguono per CD45 marcatori allotypic e successive loro progenie così. La colonizzazione con popolazioni miste consente l&#39;analisi di cellule differenze autonome in proprietà biologiche dei progenitori, mentre la colonizzazione sia con popolazione rimuove eventuali pressioni selettive competitive. I lobi timici colonizzati possono anche essere innestati immunodeficienti topi riceventi maschi consentono l&#39;analisi della progenie di cellule T mature in vivo, quali la dinamica di popolazione di tegli PERIFERICA sistema immunitario e colonizzazione dei vari tessuti ed organi. Colture d&#39;organo timo fetali hanno rivelato che i progenitori E13 sviluppato rapidamente in tutto mature cellule CD3 + e hanno dato luogo al sottoinsieme di cellule T γδ canonica, noto come le cellule T epiteliali dendritiche. In confronto, i progenitori E18 hanno una differenziazione ritardata e non erano in grado di generare cellule epiteliali T dendritiche. Il monitoraggio di sangue periferico di timo-innestato CD3 - / - mice inoltre dimostrato che progenitori E18 timica decantazione generano, con il tempo, un maggior numero di cellule T mature rispetto ai loro omologhi E13, una caratteristica che non poteva essere apprezzata nel timo fetale breve termine colture d&#39;organo.

Per scegliere un metodo per esaurire lobi timici di timociti endogeni che permettono il migliore sviluppo dei progenitori colonizzatrici, abbiamo confrontato i livelli di ricostituzione delle cellule T in lobi del timo colonizzati dopo l&#39;irradiazione o un desossi-guanosina 5 giorni (d-Gua) trattamento. I risultati mostrano che, mentre non vi è alcuna differenza a giorno 9 della cultura, lobi irradiati contenevano più cellule T rispetto a quelli trattati con d-Gua, al giorno 12. Pertanto, l&#39;irraggiamento è più ap...

Questo articolo descrive la metodologia in vivo e in vitro per caratterizzare i progenitori di sedimentazione timica mediante l'analisi della cinetica di generazione, fenotipo e numero della loro progenie di cellule T.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la cinetica fenotipica della generazione e del numero di linfociti T prodotti da progenitori che colonizzano il timo a E13 o E18. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto i lobi timici da embrioni di topo a E13, E14 ed E18. Nel secondo passaggio, i lobi timici a E14 vengono irradiati e successivamente colonizzati con cellule provenienti da E13 o E18, separate tramite citometria a flusso, e coltivati per 48 ore in goccia sospesa.Nell'ultimo passaggio, i lobi colonizzati vengono trapiantati sotto la capsula renale di topi adulti CD tre knockout. Infine, la citometria a flusso può essere utilizzata per valutare la presenza dei progenitori emigrati dal timo agli stadi E13 ed E18 e della loro progenie nel sangue degli animali chimera. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la coltura in vitro di cellule T su cellule ine so, è che essa combina un metodo che permette la maturazione completa delle cellule T a partire da progenitori definiti in un saggio tridimensionale con il trapianto di colture organotipiche timiche in topi riceventi integri, consentendo la valutazione della differenziazione e della funzione dei progenitori timici derivati da fette e della loro progenie.Come ingegnere ricercatore con esperienza in chirurgia su roditori, dimostrerò la procedura. Due giorni prima dell'esperimento di innesto, all'interno di una cappa a flusso laminare, disinfettare l'addome di una femmina di topo gravida con etanolo al 70% ed eseguire un'incisione longitudinale lungo la linea mediana. Allargare la pelle per aprire l'incisione, quindi utilizzare pinzette e forbici per aprire il peritoneo senza toccare il tratto digestivo. Successivamente, estrarre l'utero bifido e utilizzare le forbici per separarlo dalla vagina. Quindi, posizionare l'utero in una piastra di Petri da 90 per 15 millimetri contenente da 40 a 50 millilitri di DPBS ed effettuare un'incisione trasversale tra le decidui di ciascun embrione.Utilizzare un paio di forbici a punta fine e pinzette fini per rimuovere la membrana muscolare dell'utero, tagliando tra la placenta e il sacco vitellino per estrarre ogni embrione. Successivamente, rimuovere l'amnios mantenendo gli embrioni e posizionare gli embrioni in una nuova capsula di Petri contenente HBSS più 1% FCS. Per isolare il timo, posizionare gli embrioni uno alla volta in posizione supina sotto una lente di ingrandimento binoculare.Quindi inserire una pinza longitudinalmente lungo la cartilagine dello sterno e afferrare e aprire la griglia toracica utilizzando pinze curve. Tirare da parte la parete toracica per visualizzare i lobi timici su ciascun lato della trachea. Successivamente, afferrare delicatamente al di sotto del timo con una pinza fine per rimuovere con attenzione ciascun lobo e posizionarli in una piastra di Petri contenente un millilitro di HBSS più 1% FCS.Successivamente, utilizzare due pinzette fini per rimuovere il tessuto connettivo circostante senza danneggiare i lobi. Quindi lavare i lobi in tre millilitri di HBSS più 1% FCS per eliminare i globuli rossi e iniziare la coltura organotipica timica fetale irradiata. Lobi timici di E14 isolati da embrioni CD45.2, come appena dimostrato.Lasciare riposare i lobi per circa tre ore. Quindi centrifugare i progenitori del timo appena selezionati E 13 o E 18. Sospendere nuovamente il pellet nel mezzo di coltura fino a una concentrazione finale di 500 cellule per 35 microlitri di mezzo.Quindi posizionare una goccia di 35 microlitri di sospensione cellulare in ogni altra pozzetta di una piastra terasaki da 60 pozzette e posizionare un lobo irradiato sulla superficie di ciascuna goccia. Chiudere la piastra e capovolgerla per permettere alle cellule di raggiungere il polo apicale della goccia per gravità, battendo delicatamente sul lato superiore della piastra capovolta per favorire lo scorrimento dei lobi verso il margine apicale della goccia. Successivamente, incubare la piastra capovolta in un incubatore umidificato per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo che i lobi timici sono stati colonizzati, verificare il livello di anestesia dell'animale ricevente attraverso l'assenza di risposta riflessa. Applicare quindi una goccia di pomata oculare su ciascun occhio e posizionare il topo sul fianco destro sotto una cappa a flusso laminare. Successivamente, rasare l'area chirurgica appena sopra l'articolazione della zampa posteriore.Successivamente, indossare un paio di guanti sterili e sterilizzare il campo operatorio con etanolo al 70% e una soluzione di IOD DY DER al 10%. Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione di 1,5 centimetri attraverso il tessuto cutaneo, seguita da un'incisione attraverso il tessuto muscolare. Applicare ora una leggera pressione su entrambi i lati dell'incisione per far uscire il rene dalla cavità addominale e mantenere il rene umido con soluzione fisiologica.Mantenere il rene con un bastoncino di cotone all'esterno della cavità retroperitoneale ed utilizzare due pinze fini per praticare un foro di due-tre millimetri nella capsula. Quindi, tenendo aperta con attenzione la parete della capsula, far scivolare delicatamente fino a sei innesti di lobo timico sotto la capsula fino al margine del polo renale e reinserire il rene nella cavità retroperitoneale. Suturare il muscolo con una neurotizia, seguita da sutura cutanea con nodi chirurgici individuali.Quindi inumidire la ferita con soluzione di povidone iodio al 10%, posizionare il topo su un tappetino riscaldante a 37 gradi Celsius e monitorare l'animale e la ferita chirurgica fino a quando entrambi non si saranno completamente ripresi, al fine di determinare il metodo migliore per esaurire i timociti endogeni per lo sviluppo dei progenitori colonizzanti. In questo esperimento, sono stati confrontati i livelli di riconstituzione dei linfociti T in un lobo timico colonizzato dopo un trattamento con radiazioni o con deossiguana per cinque giorni. Sebbene non si osservassero differenze nel numero di linfociti colonizzanti al nono giorno di coltura, i lobi irradiati contenevano più linfociti T rispetto a quelli trattati con deossiguana al dodicesimo giorno, rendendo l'irradiazione il trattamento preferito per favorire lo sviluppo dei linfociti T dopo la colonizzazione timica. Per studiare il potenziale di sviluppo dei progenitori timici di E 13 ed E 18, in questo caso lobi timici irradiati di E 14 sono stati colonizzati con un numero uguale dei due tipi di progenitori. Come osservato, i progenitori timici di E 13 hanno generato un numero inferiore di timociti e di linfociti T doppi positivi rispetto ai progenitori timici di E 18.La frequenza delle cellule mature CD3 positive, tuttavia, era aumentata e la produzione di cellule T epiteliali dendritiche è stata rilevata soltanto nella progenie dei progenitori timici colonizzanti all'E13; per analizzare il potenziale in vivo dei progenitori timici colonizzanti all'E13 e all'E18, lobi timici colonizzati con ciascun tipo di progenitori sono stati trapiantati sotto la capsula renale di riceventi knockout per CD3. Come appena dimostrato, come previsto, i progenitori timici colonizzanti all’E13 hanno generato cellule T più rapidamente rispetto ai progenitori all’E18, sebbene il numero di cellule T circolanti fosse significativamente inferiore negli animali colonizzati dai progenitori timici all’E13 nel complesso. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia dello sviluppo per esplorare le proprietà di sottopopolazioni di cellule T, alcune delle quali hanno un'origine strettamente embrionale in un modello mammifero.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come tracciare i percorsi differenziali e funzionali dei progenitori di Timex e della loro progenie in un ambiente naturale, anche in condizioni competitive.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Vi presentiamo passo-passo le istruzioni per la generazione di chimere neonatale e la dissezione e la preparazione del timo per ex vivo imaging 2-Photon Microscopia.

Imaging in situ del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopia

Abbiamo sviluppato strumenti di laboratorio nuovi e protocolli per l'acquisizione di immagini intravitale del timo. La nostra tecnica dovrebbe aiutare nell'identificazione di "nicchie" all'interno del timo in cui lo sviluppo delle cellule T si verifica.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Questo video mostra un protocollo per la generazione di cellule T funzionali antigene-specifiche da cellule T immature derivate da iPSC utilizzando un sistema di coltura timica tridimensionale. La co-coltura delle cellule T immature derivate da iPSC con lobi timici fetali di topi endogeni depleti di linfociti ha portato alla maturazione delle cellule T per formare emigranti timici derivati da iPSC CD8αβ+ MHC di classe I+ iPSC.

Sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigranti timici derivati da iPSC

Le cellule staminali embrionali di topo possono essere differenziate in cellule T in vitro utilizzando il sistema di co-coltura OP9-DL1. Il successo di questa procedura richiede un'attenta attenzione alla manutenzione del reagente/cellula e ai passaggi chiave della tecnica. Qui discutiamo questi parametri critici e forniamo un protocollo dettagliato per incoraggiare l'adozione di questa tecnologia.

Derivazione di cellule T In Vitro Da cellule staminali embrionali di topo

Lo studio delle cellule epiteliali midollari del timo in vitro è stato in gran parte infruttuoso, poiché gli attuali sistemi di coltura 2D non imitano lo scenario in vivo. Il sistema di coltura 3D qui descritto - un modello di coltura organotipica della pelle modificata - si è dimostrato superiore nella ricapitolazione della proliferazione, della differenziazione e del mantenimento dell'espressione genica promiscua di mTEC.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Questo protocollo presenta un metodo per eseguire quantitativa, cella singola analisi in situ di espressione della proteina per studiare specifiche lignaggio in embrioni di topo preimpianto. Le procedure necessarie per la raccolta di blastocisti, tutto il montaggio di rilevamento di immunofluorescenza di proteine, l'imaging di campioni su un microscopio confocale, e la segmentazione nucleare e l'analisi delle immagini sono descritte.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

Mentre i macrofagi infiltranti vengono reclutati continuamente nei tessuti adulti da precursori circolanti, i macrofagi residenti seminano il loro tessuto durante lo sviluppo, dove vengono mantenuti senza ulteriori input da progenitori. I progenitori per i macrofagi residenti sono stati recentemente identificati. Qui presentiamo metodi per la mappatura genetica dei fenomeni genetici dei progenitori macrofagi.

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

In questo articolo, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo dell'immunoglobulina (Ig) T-dipendenti e T-indipendente in topi usando ELISA. Questo metodo usato da solo o in combinazione con flusso cytometry permetterà ai ricercatori di identificare le differenze nelle risposte di isotipo Ig B cellulo-mediata nei topi dopo immunizzazione antigene T-dipendente e T-indipendente.

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

L'obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell'innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l'uscita di cellula T maturo.

Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

Questo articolo descrive un nuovo metodo per generare emigranti timici (iTE) derivati da cellule staminali specifiche dell'antigene tumorale del tumore da un sistema di coltura timica tridimensionale (3D). ITE sono un sottoinsieme omogeneo di cellule T strettamente correlate alle cellule T ingenue con la capacità di proliferazione, formazione della memoria, e la soppressione del tumore.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

Questo articolo fornisce un metodo per isolare puri tessuti embrionali da embrioni di pollo e quaglie che possono essere combinati per formare ex vivo chimerico organi.

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

Scopri la caratterizzazione dei progenitori timici assestanti nell'embrione di topo usando saggi in vivo e in vitro. Questo metodo consente la maturazione completa delle cellule T da progenitori definiti.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell'embrione mouse Uso

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