Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

L'obiettivo generale del test di irritazione oculare è quello di classificare ed etichettare le sostanze e le miscele in base al loro potenziale di irritazione oculare. Questa procedura utilizza un modello di tessuto simile a una cornea ricostruita tridimensionale. All'arrivo, il kit di test viene preincubato per una notte nel terreno di prova il giorno successivo, i tessuti vengono idratati, seguita dall'applicazione topica dei controlli positivi e negativi e delle sostanze chimiche in esame di interesse sulle superfici dei tessuti in duplicato.

Dopo un determinato periodo di esposizione, le sostanze chimiche in esame vengono rimosse mediante lavaggio. I tessuti vengono post-incubati in un terreno di analisi fresco e la tossicità delle sostanze chimiche viene quindi valutata mediante test MTT. In definitiva, il potenziale irritante degli articoli in esame può essere valutato confrontando la vitalità relativa dei tessuti trattati con l'articolo in esame con i tessuti trattati con controllo negativo.

Il vantaggio principale di questa tecnica, rispetto ai metodi esistenti, come i test rapidi di irritazione delle tracce, è che non coinvolge animali da laboratorio. Utilizza in vitro un modello di tessuto cornale decostruito simile a un oculare, che comprende cellule umane normali. È applicabile a tutti i tipi di sostanze e miscele e può discriminare tra le sostanze chimiche che inducono irritazione oculare o gravi danni agli occhi dai materiali.

Non irritanti che non richiedono classificazione ed etichettatura. La cornea umana ricostruita come il tessuto epiteliale o epi. Ocular viene preparato in inserti con una membrana porosa attraverso la quale i nutrienti passano alle cellule.

Il tessuto ricostruito forma un epitelio non cheratinizzato che modella l'epitelio corneale con cellule progressivamente stratificate ma non cornificate. Al ricevimento del kit epiteliale simile alla cornea umana, equilibrare i tessuti nel contenitore di spedizione a 24 pozzetti a temperatura ambiente Dopo 15 minuti, aprire la sacca contenente la piastra di tessuto a 24 pozzetti in condizioni sterili e ispezionare tutti i tessuti per verificare la presenza di bolle d'aria tra il gel agros e gli inserti. Tagliare. Aprire il nastro.

Rimuovere il coperchio con una garza sterile e ispezionare la superficie del tessuto. Successivamente, aliquotare un millilitro di terreno di prova kit a 37 gradi Celsius nei pozzetti delle piastre a sei pozzetti pre-etichettate. Quindi utilizzare una pinza sterile per tamponare delicatamente il tessuto contenente inserti su una garza sterile per rimuovere eventuali residui di spedizione e posizionarli nei singoli pozzetti delle piastre a sei pozzetti.

Dopo un'ora, sostituire il terreno con un millilitro di terreno di coltura fresco a 37 gradi Celsius e incubare i tessuti in condizioni di coltura standard per una notte. Il giorno dopo ho pepato 20 microlitri di DPBS senza calcio e magnesio sulla superficie apicale di ogni tessuto. Se il DPBS non si diffonde sui tessuti, tenere delicatamente l'inserto con una pinza e picchiettare sulla piastra per assicurarsi che la soluzione salina bagni l'intera superficie del tessuto.

Incubare le piastre per 30 minuti. Quindi, per trattare i tessuti con articoli di prova liquidi, applicare 50 microlitri di controllo negativo, il controllo positivo e gli articoli di prova appropriati in duplicato secondo il calendario. Fare attenzione a garantire che i trattamenti coprano l'intera superficie del tessuto e quindi incubare gli inserti per 30 minuti per trattare i tessuti con articoli di prova solidi.

Per prima cosa, trasferire gli inserti su una superficie sterile. Tenere la piastra coperta per evitare la contaminazione con particelle solide sospese nell'aria. Quindi, utilizzando un cucchiaio livellato, applicare localmente 50 milligrammi di articolo di prova sui tessuti duplicati secondo il calendario, avendo cura che il trattamento copra l'intera superficie del tessuto.

In alternativa, utilizzare una siringa preriempita da un millilitro con la testa tagliata. Posizionare le polveri direttamente sulla coltura. Premere lo stantuffo per applicare la polvere subito dopo aver applicato gli articoli di prova solidi, rimettere gli inserti nelle loro piastre a sei pozzetti e incubare i tessuti per sei ore per risciacquare i tessuti.

Dopo il trattamento, riempire 3 becher da 150 millilitri per articolo di prova con 100 millilitri di DPBS al termine dell'incubazione dell'esposizione. Afferrare il bordo superiore degli inserti con una pinza curva per rimuoverli dai pozzetti. Quindi, utilizzando una pinza, prelevare due inserti dello stesso trattamento per i bordi superiori e decantare i trattamenti su un materiale assorbente pulito.

Quindi, immergere gli inserti nel primo becher di DPBS lavando i fazzoletti con un movimento circolare vorticoso per due secondi. Quindi sollevare gli inserti in modo che siano per lo più riempiti con DPBS e travasare nuovamente il liquido nel becher. Ripetere il lavaggio due volte nel primo bicchiere.

Quindi sciacquare gli inserti nel secondo e terzo bicchiere di DPB S3 volte ciascuno allo stesso modo dopo l'ultimo lavaggio. Ruotare ciascun inserto di circa 45 gradi con l'estremità aperta rivolta verso il basso e toccare il labbro superiore con il materiale assorbente per decantare eventuali DPBS rimanenti. Quindi immergere immediatamente i tessuti in cinque millilitri di terreno di prova a temperatura ambiente.

In una piastra da 12 pozzetti pre-etichettata al termine del periodo di immersione post-immersione, decantare il terreno di prova e tamponare gli inserti su un materiale assorbente. Quindi trasferire gli inserti in una nuova piastra a sei pozzetti contenente un millilitro di terreno di coltura caldo per pozzetto e posizionare le piastre nell'incubatore per avviare il test di vitalità MTT. Trasferire gli inserti in una piastra a 24 pozzetti contenente 0,3 millilitri di soluzione MTT appena preparata.

Tamponare gli inserti sul materiale assorbente prima del trasferimento. Rilasciare eventuali bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti e rimettere i fazzoletti nell'incubatrice dopo tre ore, rivestire il fondo degli inserti sul materiale assorbente. Quindi, per l'estrazione sommersa di articoli di prova liquidi non coloranti, immergere gli inserti in una piastra pre-marcata a 24 pozzetti contenente due millilitri della soluzione di estrazione appropriata per pozzetto per un'estrazione sommersa non sommersa di coloranti solidi o liquidi.

Trasferire gli inserti in una piastra a sei pozzetti pre-etichettata contenente un millilitro di soluzione di estrazione per pozzetto. Quindi sigillare le piastre con una termosigillatrice o una paraforma per inibire l'evaporazione ed estrarre su un agitatore orbitale per due o tre ore a temperatura ambiente con un leggero agitamento al termine dell'estrazione sommersa. Forare i tessuti e poi decantare il liquido all'interno di ciascun inserto di nuovo nel, beh, quindi scartare gli inserti con i fazzoletti.

Miscelare la soluzione di estratto in ciascun pozzetto e trasferire due aliquote da 200 microlitri di ciascun campione nei pozzetti appropriati di una piastra da 96 pozzetti pre-marcata, come illustrato nello schema alla fine dell'estrazione sommersa non in acqua. Scartare gli inserti e i fazzoletti senza perforare e aggiungere un millilitro di soluzione estraente a ciascuno. Mescolare bene la soluzione di estrazione nei pozzetti e trasferire due aliquote da 200 microlitri da ciascun campione nei pozzetti appropriati di una piastra da 96 pozzetti pre-etichettata, come appena dimostrato.

Infine, leggere la densità ottica dei campioni in uno spettrofotometro a 96 pozzetti a una lunghezza d'onda di 570 nanometri senza utilizzare un filtro di riferimento e inserire i risultati in un foglio di calcolo per calcolare le rispettive passività tissutali. Tenere conto delle correzioni dovute all'interferenza chimica del test, come indicato nel protocollo di testo qui, in questo esperimento vengono mostrati i risultati rappresentativi dei test di irritazione oculare condotti con 10 articoli di prova e i controlli negativi e positivi. È stata osservata una densità ottica media di 1,31 per il controllo negativo, corrispondente a una vitalità tissutale del 100%, con una vitalità tissutale relativa del 31,2% Per il test di controllo positivo, gli articoli 1, 2, 4, 7 e 8 hanno mostrato variabilità tissutali superiori al 60%, classificando questi articoli come articoli del test non irritanti 3, 5, 6, 9 e 10.

D'altra parte, hanno mostrato variabilità tissutali inferiori o uguali al 60%, con conseguente classificazione come irritanti. La differenza nella vitalità tissutale tra i tessuti duplicati in questo esperimento è stata inferiore al 20% per tutti gli articoli testati, ad eccezione dell'articolo di prova due. Pertanto, i risultati di tutti gli articoli di prova, ad eccezione dell'articolo di prova due, sono stati considerati qualificati in quanto soddisfacevano tutti i criteri di accettazione del test di irritazione oculare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come dovrebbe eseguire il test DICATION, utilizzando il modello di tessuto corneale umano ricostruttivo in vitro quattro, l'etichettatura di identificazione del pericolo della sostanza chimica. Questa procedura è stata implementata nelle linee guida per i test EOC D come parte della strategia di test a più livelli.