Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

L'obiettivo generale di questa procedura è mostrare come isolare e co-coltivare i gangli del trigemino in via di sviluppo e i germi dei denti. Ciò si ottiene sterilizzando, montando e rivestendo prima i dispositivi microfluidici. Il secondo passo consiste nel sezionare i gangli del trigemino e i germi dei denti da uno specifico stadio di sviluppo nel topo di interesse.

Successivamente, i gangli del trigemino e i germi dei denti vengono inseriti nei dispositivi microfluidici e co-coltivati. Il passaggio finale consiste nel fissare le cellule e colorarle utilizzando l'immunofluorescenza. In definitiva, la microscopia viene utilizzata per mostrare il modello di innervazione che è il risultato della co-coltura.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le cocolture convenzionali, è che questo metodo consente la co-coltura di diversi organi e tessuti, ciascuno nella propria coltura ottimale. Medio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'innovazione artificiale, come il ruolo di diverse molecole sull'innovazione dentale e la regola dell'innovazione nello sviluppo dentale. Inizia con gli strumenti di dissezione in autoclave, che includono un paio di pinze per microdissezione e un paio di forbici.

Successivamente, sterilizzare un lotto di vetrini di vetro da 24 millimetri per 24 millimetri mettendoli in una soluzione di acido cloridrico molare su un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi lavare i vetrini di copertura tre volte con acqua distillata sterile, seguiti da tre risciacqui in etanolo al 99%, asciugarli sotto una cappa a flusso sterile una volta asciutti, accendere la cappa UV per 30 minuti. Quindi conservare i vetrini coprioggetto in etanolo al 70% fino a quando non sono necessari.

Quindi, utilizzare una pinza sterile per rimuovere con cura i dispositivi microfluidici di isolamento degli assoni dalla loro confezione e posizionarli in una capsula di Petri sterile utilizzando un punzone per biopsia sterile da un millimetro. Creare un foro nei dispositivi per ogni campione. In corrispondenza delle camere della cultura.

Fare attenzione a non perforare troppo vicino alle micro scanalature in quanto potrebbero essere danneggiate dalla pressione. Successivamente, sterilizzare i dispositivi immergendoli in etanolo al 70%. Avendo cura di rimuovere tutta l'aria intrappolata.

Quindi rimuovere i dispositivi dall'etanolo e asciugarli completamente sotto una cappa di flusso sterile. Inoltre, rimuovere i vetrini coprioggetto dalla soluzione di etanolo al 70% e lasciarli asciugare sotto la cappa di flusso sterile. Attendere un minimo di tre ore prima di procedere.

Posizionare ogni vetrino di copertura in un pozzetto all'interno di una piastra a sei pozzetti. Quindi posizionare il dispositivo microfluidico sul vetrino coprioggetti e premere delicatamente ma con decisione con la pinza per consentire la piena adesione tra il dispositivo di isolamento e il vetrino coprivetro. Quindi, pipettare 150 microlitri da 0,1 milligrammi per millilitro, poli-D luccina in ciascuna delle camere di coltura.

Quindi posizionare i dispositivi microfluidici sotto vuoto per cinque minuti per rimuovere tutta l'aria dalle camere. Se l'aria può ancora essere vista all'interno delle camere. Ripetere la soluzione di poli-D lisina nelle camere.

Incubare i dispositivi con poli de lisina per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Lavare le camere tre volte con acqua distillata sterile, quindi riempire le camere con 150 microlitri di cinque microgrammi per millilitro, soluzione di lavoro in lamina, e incubarle per una notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, riparare i terreni per i gangli del trigemino e le colture di germe dei denti come descritto nel protocollo di testo allegato.

Pulire l'area di dissezione e lo stereoscopio con etanolo al 70% e posizionare gli strumenti di dissezione dopo il sacrificio. Sezionare la pelle intorno al basso addome di un topo gravido con embrioni di topo in stadio da E 14,5 a E 17,5. Quindi aprire con cautela l'addome usando le forbici.

Individua l'utero, rimuovilo e mettilo in un tubo pieno di ghiaccio. I PBS freddi sezionano gli embrioni e li posizionano singolarmente in una nuova capsula di Petri riempita con PBS ghiacciato. Una volta che tutti gli embrioni sono stati rimossi dai tessuti extra embrionali, decapitarli con le forbici.

Separare la mascella inferiore dal resto della testa utilizzando una micro dissezione, forbici, facendo attenzione a non danneggiare i gangli del trigemino. Quindi, prendi la testa e posizionala su una capsula di Petri in vetro da dissezione fredda. Usa il forcipe per rimuovere la pelle e il cranio.

Quindi posizionare la pinza sotto il cephalon e sollevare. Per rimuovere il cefalone e il cervelletto, localizzare i gangli del trigemino e utilizzare le pinze e gli aghi da dissezione per separare i gangli del trigemino dai nervi del trigemino e pulire i gangli. Conservali in PBS freddo usando aghi da dissezione come coltelli.

Rimuovere la lingua e la pelle che circonda la mascella. Separare le mascelle dell'emi sinistra e destra tagliando lungo la linea mediana della mascella. Quindi localizzare i germi dei denti e isolarli con aghi da dissezione dopo la dissezione dei gangli del trigemino e dei germi dei denti, rimuovere la laminina dai dispositivi microfluidici e riempire le camere con 200 microlitri dei rispettivi mezzi.

Con una pinza, trasferire delicatamente i gangli del trigemino sezionati e i germi dei denti nei fori creati con un punzone per biopsia. Assicurarsi che i germi dei denti non galleggino e che affondino fino a quando non toccano i vetrini. Coltura, i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Cambiare il terreno di coltura ogni 48 ore per 10 giorni per cambiare il supporto. Per prima cosa, rimuovere il terreno puntando la pipetta verso il lato esterno dei pozzetti. Quindi aggiungere il terreno di preriscaldamento fresco sul lato dei wels situati di fronte alle camere durante il periodo di coltura.

Visualizzare le cocolture in qualsiasi momento utilizzando la microscopia ottica. Dopo il periodo di coltura, lavare le camere pipettando 150 microlitri di PBS in un pozzetto per camera e lasciando che il PBS fluisca attraverso le camere. Ripetere il lavaggio per un totale di tre volte dopo l'ultimo lavaggio.

Rimuovere il PBS e fissare i campioni pipettando 150 microlitri di aldeide paraforma al 4% in PBS in un pozzetto per camera e lasciandolo fluire nell'altra camera. Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi lavare le camere due volte con PBS e procedere con ulteriori analisi come la colorazione immunofluorescente e l'imaging della crescita.

Durante la coltura del carbone, i neuriti dei gangli del trigemino si diramano dal suo compartimento di coltura e si estendono verso il germe del dente in via di sviluppo. A un ingrandimento più elevato, si possono vedere i neuriti che si estendono attraverso le camere assonali e le micro scanalature nel dispositivo microfluidico. L'andamento della crescita nervosa può essere monitorato nel tempo per descrivere lo sviluppo dell'innovazione.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'RNA o la PROTEINIZZAZIONE per studiare, ad esempio, i cambiamenti dell'espressione genica o della secrezione proteica nei tessuti bersaglio a seguito di un'innovazione.