Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

L'obiettivo generale di questo procedimento è mostrare come isolare e coltivare in co-coltura i gangli trigeminali in via di sviluppo e i germi dentari. Questo viene realizzato innanzitutto sterilizzando, montando e rivestendo i dispositivi microfluidici. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire la dissezione dei gangli trigeminali e dei germi dentari a uno specifico stadio di sviluppo nel topo di interesse.

Successivamente, i gangli trigeminali e i germi dentari vengono posizionati nei dispositivi microfluidici e coltivati in co-coltura. L'ultimo passaggio consiste nel fissare le cellule e colorarle mediante immunofluorescenza. Infine, si utilizza la microscopia per visualizzare il pattern di innervazione risultante dalla co-coltura.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le co-colture convenzionali, è che questo metodo permette la co-coltura di diversi organi e tessuti, ciascuno nel proprio mezzo di coltura ottimale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'innovazione artificiale, come il ruolo di diverse molecole nell'innovazione dentale e la regola dell'innovazione nello sviluppo dei denti. Iniziare sterilizzando in autoclave gli strumenti di dissezione, che includono una pinzetta da microdissezione e un paio di forbici.

Successivamente, sterilizzare un lotto di coprioggetti in vetro di 24 millimetri per 24 millimetri posizionandoli in una soluzione di acido cloridrico uno molare su un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi lavare i coprioggetti tre volte con acqua distillata sterile, seguiti da tre risciacqui in etanolo al 99%, asciugarli sotto una cappa a flusso laminare; una volta asciutti, accendere la luce UV della cappa per 30 minuti. Successivamente, conservare i coprioggetti in etanolo al 70% fino al momento dell'utilizzo.

Successivamente, utilizzare pinze sterili per rimuovere con attenzione i dispositivi microfluidici per l'isolamento degli assoni dal loro imballaggio e posizionarli in una piastra di Petri sterile usando un punch per biopsie sterile da un millimetro. Creare un foro nei dispositivi per ogni campione, in corrispondenza delle camere di coltura.

Attenzione a non forare troppo vicino alle microscanalature, poiché potrebbero essere danneggiate dalla pressione. Successivamente, sterilizzare i dispositivi immergendoli in etanolo al 70%. Assicurarsi di rimuovere tutta l'aria intrappolata.

Quindi rimuovere i dispositivi dall'etanolo ed essiccarli completamente sotto una cappa a flusso laminare sterile. Inoltre, rimuovere i vetrini dalla soluzione di etanolo al 70% e lasciarli asciugare sotto la cappa sterile. Attendere almeno tre ore prima di proseguire.

Posizionare ogni lamella in una pozzetta di una piastra a sei pozzette. Quindi posizionare il dispositivo microfluidico sulla lamella e premere delicatamente ma con fermezza utilizzando la pinzetta, in modo da garantire un'adesione completa tra il dispositivo di isolamento e la lamella di vetro. Successivamente, aggiungere con la pipetta 150 microlitri di poli-D-lisina allo 0,1 milligrammo per millilitro in ciascuna delle camere di coltura.

Quindi posizionare i dispositivi microfluidici sotto vuoto per cinque minuti per rimuovere tutta l'aria dalle camere. Se all'interno delle camere è ancora visibile dell'aria, ripetere l'aggiunta della soluzione di poli-D-lisina nelle camere.

Incubare i dispositivi con poli-L-lisina durante la notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Lavare le camere tre volte con acqua distillata sterile, quindi riempire le camere con 150 microlitri di soluzione lavorativa di laminina a cinque microgrammi per millilitro e incubare nuovamente durante la notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, preparare i mezzi di coltura per i gangli trigeminali e i germi dentali come descritto nel protocollo di testo allegato.

Pulire l'area di dissezione e il stereomicroscopio con etanolo al 70% e posizionare gli strumenti di dissezione dopo l'eutanasia. Dissettare la pelle attorno alla parte inferiore dell'addome di un topo incinta con embrioni in stadio E 14,5-E 17,5. Quindi aprire con attenzione l'addome utilizzando forbici.

Individuare l'utero, rimuoverlo e collocarlo in un tubo riempito di ghiaccio. Dissezionare gli embrioni in PBS freddo e posizionarli singolarmente in una nuova piastra di Petri contenente PBS ghiacciato. Una volta rimossi tutti gli embrioni dai tessuti extraembrionali, decapitarli utilizzando forbici.

Separare la mascella inferiore dal resto della testa utilizzando forbici da dissezione microchirurgiche, avendo cura di non danneggiare i gangli trigeminali. Successivamente, prendere la testa e posizionarla su una piastra di Petri in vetro raffreddata. Utilizzare pinze per rimuovere la pelle e il cranio.

Quindi posizionare la pinzetta sotto il cefalone e sollevare. Per rimuovere il cefalone e il cervelletto, localizzare i gangli del trigemino e utilizzare la pinzetta e gli aghi da dissezione per separare i gangli dal nervo trigemino e pulire i gangli. Conservarli in PBS freddo utilizzando gli aghi da dissezione come se fossero coltelli.

Rimuovere la lingua e la pelle che circonda la mascella. Separare le due emimandibole tagliando lungo la linea mediana della mascella. Quindi localizzare i germi dentali e isolarli utilizzando aghi da dissezione. Dopo la dissezione dei gangli trigemini e dei germi dentali, rimuovere la laminina dai dispositivi microfluidici e riempire le camere con 200 microlitri del rispettivo mezzo.

Con una pinzetta, trasferire delicatamente i gangli trigeminali dissecati e i germi dentari nei fori creati con un punch per biopsia. Assicurarsi che i germi dentari non galleggino e affondino fino a entrare in contatto con i coprioggetti. Coltivare i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Cambiare il mezzo di coltura ogni 48 ore per 10 giorni. In primo luogo, rimuovere il mezzo orientando la pipetta verso il lato esterno delle pozzette. Successivamente, aggiungere il mezzo fresco preriscaldato sul lato delle pozzette opposto rispetto alle camere durante il periodo di coltura.

Immagini le colture co-coltivate in qualsiasi momento utilizzando la microscopia ottica. Al termine del periodo di coltura, lavare le camere pipettando 150 microlitri di PBS in una pozzetta per ogni camera, permettendo al PBS di fluire attraverso le camere. Ripetere il lavaggio per un totale di tre volte, dopo l'ultimo lavaggio.

Rimuovere il PBS e fissare i campioni aggiungendo 150 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS in un pozzetto per camera, permettendo al liquido di fluire nell'altra camera. Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per 15 minuti. Lavare quindi le camere due volte con PBS e procedere con ulteriori analisi, come la colorazione immunofluorescente e l'acquisizione delle immagini della migrazione cellulare.

Durante la coltura in co-coltura, i neuriti provenienti dai gangli trigeminali si diramano dal loro compartimento di coltura ed si estendono verso il germe dentale in via di sviluppo. A ingrandimento maggiore, è possibile osservare i neuriti che si estendono attraverso le camere assonali e le microscopiche scanalature nel dispositivo microfluidico. Il progresso della crescita nervosa può essere monitorato nel tempo per descrivere lo sviluppo dell'innovazione.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'analisi di RNA o PROTEINIZZAZIONE al fine di studiare, ad esempio, le variazioni nell'espressione genica o nella secrezione di proteine nei tessuti bersaglio in seguito all'innovazione.