Name: Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Impara a isolare e co-colture gangli trigeminali e germi dentali in dispositivi microfluidici per studiare l'innervazione. Questo metodo permette di visualizzare le interazioni neuronali con i tessuti bersaglio in vitro.

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Il lavoro è stato finanziato dall'Università di Zurigo. Gli autori desiderano ringraziare Estrela Neto e la dottoressa Meriem Lamghari per aver contribuito a stabilire le condizioni di co-cultura.

Tutti i topi sono stati mantenuti e gestiti secondo la Legge benessere degli animali svizzera e nel rispetto delle norme del ufficio cantonale di veterinaria, Zurigo. 1. Preparazione di dissezione Materiale, Cultura Media, dispositivi microfluidici <ol><li> Autoclave pinze micro-dissezione e forbici (121 ° C, tempo di sterilizzazione: 20 min) e conservarle in un contenitore sterile. </li><li> Sterilizzare coprioggetto di vetro (24 mm x 24 mm) da loro incubazione in 1 M HCl per 24 ore in un agitatore orbitale a 37 ° C. Lavare per tre volte con una soluzione sterile, H 2 O distillata e tre volte con etanolo 99%. Secco poi i coprioggetti a 37 ° C o sotto cappa a flusso sterile. Infine, autoclave o esporre i coprioggetti alla luce UV (30 min) per completare la sterilizzazione. Coprioggetto possono essere conservati in etanolo al 70%. </li><li> Rimuovere accuratamente i dispositivi di isolamento AXIS Axon dal pacchetto con pinza sterile e metterli in una piastra di Petri sterile. </li&gt; <li> Utilizzando una biopsia sterile (ø: 1mm) creare un foro per ogni campione da coltivate (figura 1) in corrispondenza delle camere di coltura. NOTA: Non pugno troppo vicino alle microscanalature, in quanto potrebbero essere danneggiati dalla pressione applicata. </li><li> Sterilizzare i dispositivi di isolamento AXIS Axon da loro immergendo in etanolo al 70%. Asciutto, quindi AXIS Axon dispositivi di isolamento e coprioggetti completamente sotto una cappa a flusso sterili. Attendere almeno 3 ore prima di procedere. NOTA: essiccazione incompleta provocherà assemblaggio difettoso dei dispositivi microfluidici. </li><li> Posizionare ogni vetrino in una capsula di Petri da 35 mm o in un pozzo all&#39;interno di un 6-pozzetti. </li><li> Posizionare il dispositivo di isolamento AXIS Axon sul vetrino e premere delicatamente ma con fermezza, con una pinza con estremità piegate in modo da consentire la piena adesione tra il dispositivo di isolamento e il vetrino di vetro. </li><li> In ciascuna camera di coltura, pipetta 150 ml di poli-D-lisina (0,1 mg / ml in sterile, distillata H 2O). Posizionare i dispositivi microfluidici sotto vuoto per 5 minuti, per eliminare tutta l&#39;aria dalle camere di coltura. </li><li> Se l&#39;aria è ancora visibile all&#39;interno delle camere, ri-pipetta la soluzione poli-D-lisina nelle camere. </li><li> Incubare i dispositivi con poli-D-lisina O / N a 37 ° C. </li><li> Lavare camere tre volte con sterili, H 2 O. distillata </li><li> Riempire camere con 150 microlitri soluzione laminina lavoro (Sigma-Aldrich, 5 mcg / ml, in PBS o terreno privo di siero), e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Preparare 50 ml di terreno per le colture gangli trigeminali 37, così composto: 48 ml Neurobasal medio, 1 ml di B-27, 100 U / ml di penicillina / streptomicina, 2 mM L-glutammina, 5 ng / ml fattore di crescita nervoso (NGF) , 12:25 citosina arabinoside. </li><li> Preparare 50 ml di mezzo di crescita per dente germinali 37, così composto: 40 ml DMEM-F12, 10 ml di siero bovino fetale (FBS, concentrazione finale: 20%), 100 U / ml di penicillina / streptomicina, 2 mM L-glutammina, 150 mg / ml di acido ascorbico. </li></ol> Embrione Generazione ed Dissection 2. mouse <ol><li> Determinare l&#39;età embrionale secondo tappo vaginale (spina vaginale: embrionale giorno di sviluppo 0.5, E0.5) e confermare tramite criteri morfologici. Per questo protocollo, generalmente usiamo gli embrioni E14.5 E17.5-mouse. </li><li> Pulire l&#39;area dissezione e lo stereoscopio con etanolo al 70%. </li><li> Sacrifica la madre incinta tramite dislocazione cervicale. Bloccare il collo del mouse con il primo e secondo dito su una griglia, e tirare con decisione la coda. </li><li> Sezionare la pelle intorno basso addome, e aprire l&#39;addome con le forbici. Individuare l&#39;utero: durante queste ultime fasi della gravidanza, l&#39;utero abbondantemente riempire la cavità addominale. </li><li> Sezionare l&#39;utero e posto in un tubo riempito con PBS sul ghiaccio. Quando sul ghiaccio, il tessuto può essere lasciato per vari hr. Eliminare il cadavere della madre in base alle linee guida istituzionali </li> &lt;li&gt; sezionare gli embrioni dall&#39;utero e liberarli dai loro tessuti extraembrionali. Mettere gli embrioni in PBS sul ghiaccio. </li><li> Decapitare gli embrioni con forbici, e separare la mascella inferiore dal resto della testa con le forbici micro-dissezione (Figura 2A). Rimuovere proprio la mascella inferiore, senza danneggiare i gangli del trigemino; come quest&#39;ultimo sono localizzate in prossimità della mascella inferiore, il loro danneggiamento accidentale è possibile. Conservare la mandibola e il resto della testa in PBS freddo, sul ghiaccio. </li><li> Per sezionare TG, prendere la testa e metterlo su un piatto di vetro Petri dissezione, già pieno di PBS freddo. Utilizzando le pinze, togliere la pelle e il cranio. Rimuovere poi il telencefalo e il cervelletto ponendo forcipe sotto telencefalo e ascensore; telencefalo e cervelletto si capovolgere insieme, lasciando il fondo del cranio esposto. </li><li> Localizzare gangli del trigemino (Figura 2B). Utilizzare le pinzeper separare il TG dai nervi trigemino. Eliminare i resti delle proiezioni trigeminali con gli aghi di dissezione come coltelli. Posizionare il TG sezionato in una capsula di Petri riempita con PBS freddo e tenerli su ghiaccio. </li><li> Per sezionare denti embrionali, posizionare la mascella inferiore, precedentemente separato dal cranio, sulla piastra di Petri di vetro dissezione, pieno di PBS freddo. Usando aghi dissezione come coltelli, rimuovere la lingua e la pelle che circonda la mascella. Separare la destra emi-griffe sinistra e tagliando lungo la linea mediana della mandibola. I germi dei denti sono facilmente visibili, come mostrato nella Figura 1C. Isolare i germi dei denti utilizzando aghi dissezione e rimuovere l&#39;eccesso di tessuti non-dentali. Posizionare i germi dente sezionato in una capsula di Petri riempita con PBS freddo e tenerli su ghiaccio. </li></ol> 3. Microfluidic co-culture <ol><li> Dopo la dissezione, rimuovere laminina dai dispositivi microfluidica. Riempire le camere con 200 microlitri della respective media. </li><li> Con pinze, trasferire delicatamente i TG e dei denti germi sezionato nei fori creati dalla punzonatura (Figura 1D). Assicurarsi che i germi dei denti non galleggiano e che affondano fino a quando entrano in contatto con le lamelle. </li><li> Cultura campioni in incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Modificare il terreno di coltura ogni 48 ore. Non svuotare le camere completamente, e non pipettare direttamente nelle camere di coltura. Completo svuotamento delle camere comporterebbe la formazione di bolle d&#39;aria all&#39;interno delle camere; pipettaggio diretto nella camera potrebbe causare un danno assonale. Per evitare questi problemi, rimuovere il supporto punta della pipetta verso il lato esterno dei pozzetti; analogamente, pipettare il mezzo fresco sulla parete del pozzetto situato di fronte alle camere. </li><li> Durante il periodo di coltura, co-culture possono essere facilmente ripreso al microscopio time-lapse. Co-culture possono essere mantenuti per più di 10 giorni. </li><li> Dopo il perio culturad, lavare le camere pipettando 150 ml di soluzione in un pozzo per ogni camera, e lasciando PBS fluire attraverso le camere per tre volte. </li><li> Rimuovere la PBS e fissare i campioni pipettando 150 ml di paraformaldeide 4% (in PBS) in un pozzetto per camera; incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Lavare le camere due volte con PBS come descritto in 3.6. </li><li> Procedere con ulteriori analisi. </li></ol>

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<li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maxillary+factor%2C+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Precedente in studi in vitro di dente innervazione erano basati su co-colture convenzionali di gangli trigeminali e tessuti dentali o cellule 26,28,29. Sono stati condotti Questi studi per investigare principalmente gli effetti interessanti di queste cellule o tessuti di assoni sensoriali 38. Anche se portare significativi progressi nel campo, alcuni problemi tecnici sono state sollevate. Germi denti cominciano a degenerare dopo pochi giorni di coltura 37. Sulla base di...

Innervazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo, omeostasi e la rigenerazione di organi e tessuti 1,2. Inoltre, innervazione è coinvolto nella regolazione della proliferazione delle cellule staminali, la mobilitazione e la differenziazione 3-5. Infatti, recenti studi realizzati in tessuti del complesso orofacciale hanno dimostrato che i nervi parasimpatici sono necessari per la funzione epiteliali cellule progenitrici durante lo sviluppo e la rigenerazione delle ghiandole salivari 6,7. Analogamente, è stato dimostrato che innervazione è necessario per lo sviluppo e il mantenimento delle papille gustative 8 - 11. Pertanto, è importante analizzare i ruoli ancora trascurati innervazione nello sviluppo di altri importanti organi e tessuti orofacciali come i denti. Nonostante la ricca innervazione dei denti adulti, e in contrasto con tutti gli altri organi e tessuti del corpo, svidenti ping cominciano ad essere innervato nelle fasi postnatali prime. Denti si sviluppano a causa di interazioni sequenziali e reciproche tra l&#39;ectoderma orale e cranio neurale mesenchima crest-derivati. Queste interazioni danno luogo a ameloblasts epiteliali derivate e odontoblasti mesenchima-derivati ​​che sono responsabili della formazione di smalto e dentina, rispettivamente 12. Nervi sensoriali del gangli trigeminali e nervi simpatici dai gangli cervicale superiore innervano i denti adulti 13 - 15. Durante l&#39;embriogenesi, fibre nervose che emana dal progetto gangli trigeminali verso i germi di sviluppo dei denti e progressivamente li circondano, ma non penetrare nel dentale papilla mesenchima 13. Fibre nervose entrano la polpa dentale mesenchima a stadi di sviluppo più avanzati che correlano con la differenziazione odontoblast e matrice dentina deposizione 16. Dental polpa innervazione è completed subito dopo l&#39;eruzione dei denti nel cavo orale 13. Studi precedenti hanno rivelato che diversi semaforine e neurotrofine sono coinvolti nella regolazione della innervazione durante l&#39;odontogenesi 16-19. Studi precedenti hanno chiaramente dimostrato che innervazione è un prerequisito per la formazione dei denti nei pesci 20. Studi più recenti hanno dimostrato che l&#39;omeostasi delle cellule staminali mesenchima dentale in incisivi mouse è regolata da nervi sensoriali attraverso la secrezione di sonic hedgehog (Shh) 21. Tuttavia, il ruolo di innervazione in dente iniziazione, lo sviluppo e la rigenerazione è ancora molto controversa nei mammiferi 22 - 24. Una pletora di studi in vivo hanno fornito importanti informazioni sui modelli di innervazione di tessuti dentali durante lo sviluppo e riparazione processi di vari modelli animali 13,25,26. Tuttavia, la maggior parte di questi Approdolori non sono ottimali per evidenziare le basi molecolari delle interazioni tra le fibre nervose e organi bersaglio e dei tessuti. Co-culture costituiscono un valido metodo per indagare e manipolare le interazioni tra le fibre nervose e denti in un ambiente controllato e isolato 26 a 29 -. Allo stesso tempo, co-coltura è soggetta a varie regolazioni tecniche. Ad esempio, nervi e tessuti dentali specifici (ad esempio, pasta dentale, follicolo dentale, epitelio dentale) spesso richiedono terreni di coltura diversa per garantire la sopravvivenza del tessuto per lunghi periodi di tempo 30-32. Negli ultimi decenni, co-colture convenzionali che utilizzano lo stesso mezzo di coltura sono stati effettuati per periodi molto brevi (ad esempio, due giorni) per studiare gli effetti di attrazione o repulsione di sviluppare tessuti orali e dentali sulle fibre nervose sensoriali 27-29.Tuttavia, l&#39;estensione del periodo di coltura è necessario per studiare gli effetti di innervazione sul dente morfogenesi e citodifferenziazione, e per studiare le dinamiche di fibre nervose si diramano all&#39;interno organi bersaglio. Pertanto, co-colture non contigui sarebbe più adatto per realizzare studi su tessuti interazioni neuronali-dentale. Sistemi di microfluidica permettono co-colture di neuroni e diversi tipi di cellule nella loro terreni di coltura appropriati. In questi dispositivi, tessuti dentali e neuroni sono separati in differenti compartimenti, pur consentendo la crescita degli assoni dai corpi cellulari neuronali attraverso microcanali verso il compartimento contenente il tessuto bersaglio 33. Dispositivi microfluidici sono già stati utilizzati per studiare le interazioni tra neuroni e microglia 34,35, così come cellule alle interazioni cellulari nel cancro e neovascolarizzazione 35. Inoltre, questi sistemi sono stati utilizzati per studiare le interazioni tra dorsal gangli e osteoblasti 36. Abbiamo recentemente dimostrato che gangli del trigemino (TG) ed i denti sono in grado di sopravvivere per lunghi periodi di tempo quando co-coltivate in dispositivi microfluidici 37. Inoltre, abbiamo dimostrato che i denti da diverse fasi di sviluppo di mantenere in queste condizioni in vitro gli stessi effetti ripugnanti o attraenti innervazione del trigemino che mostrano in vivo 37. Questo protocollo fornisce informazioni su un modo semplice, potente e flessibile di co-coltura gangli / nervi e tessuti bersaglio e per studiare il ruolo di molecole specifiche su tali interazioni in un ambiente controllato e isolato.

<table><tbody><tr><td>Sono disponibili dispositivi di isolamento AXIS Axon</td><td>Millipore</td><td>AX15010-TC</td><td>Sono disponibili microcanali di diversa lunghezza</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante beta-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG-100</td><td>Beta-NGF umano e ratto (R& D Systems) sono equivalenti</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di sviluppo di denti germ innervazione uso di dispositivi microfluidic co-cultura

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Innervazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo, omeostasi e la rigenerazione di organi e tessuti. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi fenomeni non sono ancora ben compresi. In particolare, il ruolo di innervazione in sviluppo dentale e rigenerazione è trascurato. Diversi studi in vivo hanno fornito importanti informazioni sui modelli di innervazione di tessuti dentali durante lo sviluppo e riparazione processi di vari modelli animali. Tuttavia, la maggior parte di questi approcci non sono ottimali per evidenziare le basi molecolari delle interazioni tra le fibre nervose e organi bersaglio e dei tessuti. Co-culture costituiscono un valido metodo per indagare e manipolare le interazioni tra le fibre nervose e denti in un ambiente controllato e isolato. Negli ultimi decenni, co-colture convenzionali utilizzando lo stesso terreno di coltura sono stati effettuati per periodi molto brevi (ad esempio, due giorni)per studiare gli effetti di attrazione o repulsione di sviluppare tessuti orali e dentali su fibre nervose sensoriali. Tuttavia, l&#39;estensione del periodo di coltura è necessario per studiare gli effetti del innervazione sul dente morfogenesi e citodifferenziazione. Sistemi di microfluidica permettono co-colture di neuroni e diversi tipi di cellule nella loro terreni di coltura appropriati. Abbiamo recentemente dimostrato che gangli del trigemino (TG) ed i denti sono in grado di sopravvivere per un lungo periodo di tempo in cui co-coltivate in dispositivi microfluidici, e che mantengono in queste condizioni lo stesso modello innervazione che mostrano in vivo. Su questa base, si descrive come isolare e co-coltura di sviluppo del trigemino gangli e dei denti germi in un protocollo di co-coltura microfluidica system.This descrive un modo semplice e flessibile di co-coltura gangli / nervi e tessuti bersaglio e per studiare i ruoli di molecole specifiche su tali interazioni in un controlled e ambiente isolato.

Questi risultati mostrano che isolati gangli trigemini possono crescere in un compartimento del dispositivo microfluidico e, inoltre, che lo sviluppo dei germi isolati dente è mantenuta per un lungo periodo di tempo in altro compartimento del dispositivo microfluidico. Diversi terreni di coltura sono utilizzati nei due scomparti, e le microscolpiture tra i due compartimenti consentono estensione dell&#39;assone dal ganglio trigeminale verso i germi di sviluppo dei denti. Figura 3 rappresenta una visuali...

Le co-colture rappresentano un metodo prezioso per studiare le interazioni tra nervi e tessuti e organi bersaglio. I sistemi microfluidici consentono la co-coltura di gangli e interi organi o tessuti in via di sviluppo in diversi terreni di coltura, rappresentando così un valido strumento per lo studio in vitro del crosstalk tra neuroni e i loro bersagli.

Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è mostrare come isolare e coltivare in co-coltura i gangli trigeminali in via di sviluppo e i germi dentari. Questo viene realizzato innanzitutto sterilizzando, montando e rivestendo i dispositivi microfluidici. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire la dissezione dei gangli trigeminali e dei germi dentari a uno specifico stadio di sviluppo nel topo di interesse.Successivamente, i gangli trigeminali e i germi dentari vengono posizionati nei dispositivi microfluidici e coltivati in co-coltura. L'ultimo passaggio consiste nel fissare le cellule e colorarle mediante immunofluorescenza. Infine, si utilizza la microscopia per visualizzare il pattern di innervazione risultante dalla co-coltura.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le co-colture convenzionali, è che questo metodo permette la co-coltura di diversi organi e tessuti, ciascuno nel proprio mezzo di coltura ottimale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'innovazione artificiale, come il ruolo di diverse molecole nell'innovazione dentale e la regola dell'innovazione nello sviluppo dei denti. Iniziare sterilizzando in autoclave gli strumenti di dissezione, che includono una pinzetta da microdissezione e un paio di forbici.Successivamente, sterilizzare un lotto di coprioggetti in vetro di 24 millimetri per 24 millimetri posizionandoli in una soluzione di acido cloridrico uno molare su un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi lavare i coprioggetti tre volte con acqua distillata sterile, seguiti da tre risciacqui in etanolo al 99%, asciugarli sotto una cappa a flusso laminare; una volta asciutti, accendere la luce UV della cappa per 30 minuti. Successivamente, conservare i coprioggetti in etanolo al 70% fino al momento dell'utilizzo.Successivamente, utilizzare pinze sterili per rimuovere con attenzione i dispositivi microfluidici per l'isolamento degli assoni dal loro imballaggio e posizionarli in una piastra di Petri sterile usando un punch per biopsie sterile da un millimetro. Creare un foro nei dispositivi per ogni campione, in corrispondenza delle camere di coltura.Attenzione a non forare troppo vicino alle microscanalature, poiché potrebbero essere danneggiate dalla pressione. Successivamente, sterilizzare i dispositivi immergendoli in etanolo al 70%. Assicurarsi di rimuovere tutta l'aria intrappolata.Quindi rimuovere i dispositivi dall'etanolo ed essiccarli completamente sotto una cappa a flusso laminare sterile. Inoltre, rimuovere i vetrini dalla soluzione di etanolo al 70% e lasciarli asciugare sotto la cappa sterile. Attendere almeno tre ore prima di proseguire.Posizionare ogni lamella in una pozzetta di una piastra a sei pozzette. Quindi posizionare il dispositivo microfluidico sulla lamella e premere delicatamente ma con fermezza utilizzando la pinzetta, in modo da garantire un'adesione completa tra il dispositivo di isolamento e la lamella di vetro. Successivamente, aggiungere con la pipetta 150 microlitri di poli-D-lisina allo 0,1 milligrammo per millilitro in ciascuna delle camere di coltura.Quindi posizionare i dispositivi microfluidici sotto vuoto per cinque minuti per rimuovere tutta l'aria dalle camere. Se all'interno delle camere è ancora visibile dell'aria, ripetere l'aggiunta della soluzione di poli-D-lisina nelle camere.Incubare i dispositivi con poli-L-lisina durante la notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Lavare le camere tre volte con acqua distillata sterile, quindi riempire le camere con 150 microlitri di soluzione lavorativa di laminina a cinque microgrammi per millilitro e incubare nuovamente durante la notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, preparare i mezzi di coltura per i gangli trigeminali e i germi dentali come descritto nel protocollo di testo allegato.Pulire l'area di dissezione e il stereomicroscopio con etanolo al 70% e posizionare gli strumenti di dissezione dopo l'eutanasia. Dissettare la pelle attorno alla parte inferiore dell'addome di un topo incinta con embrioni in stadio E 14,5-E 17,5. Quindi aprire con attenzione l'addome utilizzando forbici.Individuare l'utero, rimuoverlo e collocarlo in un tubo riempito di ghiaccio. Dissezionare gli embrioni in PBS freddo e posizionarli singolarmente in una nuova piastra di Petri contenente PBS ghiacciato. Una volta rimossi tutti gli embrioni dai tessuti extraembrionali, decapitarli utilizzando forbici.Separare la mascella inferiore dal resto della testa utilizzando forbici da dissezione microchirurgiche, avendo cura di non danneggiare i gangli trigeminali. Successivamente, prendere la testa e posizionarla su una piastra di Petri in vetro raffreddata. Utilizzare pinze per rimuovere la pelle e il cranio.Quindi posizionare la pinzetta sotto il cefalone e sollevare. Per rimuovere il cefalone e il cervelletto, localizzare i gangli del trigemino e utilizzare la pinzetta e gli aghi da dissezione per separare i gangli dal nervo trigemino e pulire i gangli. Conservarli in PBS freddo utilizzando gli aghi da dissezione come se fossero coltelli.Rimuovere la lingua e la pelle che circonda la mascella. Separare le due emimandibole tagliando lungo la linea mediana della mascella. Quindi localizzare i germi dentali e isolarli utilizzando aghi da dissezione. Dopo la dissezione dei gangli trigemini e dei germi dentali, rimuovere la laminina dai dispositivi microfluidici e riempire le camere con 200 microlitri del rispettivo mezzo.Con una pinzetta, trasferire delicatamente i gangli trigeminali dissecati e i germi dentari nei fori creati con un punch per biopsia. Assicurarsi che i germi dentari non galleggino e affondino fino a entrare in contatto con i coprioggetti. Coltivare i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Cambiare il mezzo di coltura ogni 48 ore per 10 giorni. In primo luogo, rimuovere il mezzo orientando la pipetta verso il lato esterno delle pozzette. Successivamente, aggiungere il mezzo fresco preriscaldato sul lato delle pozzette opposto rispetto alle camere durante il periodo di coltura.Immagini le colture co-coltivate in qualsiasi momento utilizzando la microscopia ottica. Al termine del periodo di coltura, lavare le camere pipettando 150 microlitri di PBS in una pozzetta per ogni camera, permettendo al PBS di fluire attraverso le camere. Ripetere il lavaggio per un totale di tre volte, dopo l'ultimo lavaggio.Rimuovere il PBS e fissare i campioni aggiungendo 150 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS in un pozzetto per camera, permettendo al liquido di fluire nell'altra camera. Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per 15 minuti. Lavare quindi le camere due volte con PBS e procedere con ulteriori analisi, come la colorazione immunofluorescente e l'acquisizione delle immagini della migrazione cellulare.Durante la coltura in co-coltura, i neuriti provenienti dai gangli trigeminali si diramano dal loro compartimento di coltura ed si estendono verso il germe dentale in via di sviluppo. A ingrandimento maggiore, è possibile osservare i neuriti che si estendono attraverso le camere assonali e le microscopiche scanalature nel dispositivo microfluidico. Il progresso della crescita nervosa può essere monitorato nel tempo per descrivere lo sviluppo dell'innovazione.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'analisi di RNA o PROTEINIZZAZIONE al fine di studiare, ad esempio, le variazioni nell'espressione genica o nella secrezione di proteine nei tessuti bersaglio in seguito all'innovazione.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Il video mostra la formazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico. Le cellule precursori neurali e le cellule progenitrici muscolari vengono seminate in diversi pozzetti all'interno del dispositivo e lasciate maturare rispettivamente in motoneuroni e miotubi. La creazione di un gradiente volumetrico e chimico porta allo sviluppo di giunzioni neuromuscolari attive.

Generazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico

Questo video mostra una tecnica per stabilire una co-coltura di neuroni trigemino e cellule primarie della polpa dentale utilizzando un filtro transwell. In questa condizione fisicamente separata, le cellule mesenchimali ottenute dal tessuto pulpare dentale secernono molecole di segnalazione paracrina che attraversano i pori, promuovendo la differenziazione e la migrazione dei neuroni verso le cellule mesenchimali stabilendo un sistema di co-coltura.

Stabilire una co-coltura di cellule della polpa dentale e neuroni del trigemino per la comunicazione incrociata

Questo video dimostra l'utilizzo di un dispositivo microfluidico per studiare le interazioni tra la polpa germinale dei denti e i gangli del trigemino. Mostra il posizionamento dei tessuti all'interno del dispositivo microfluidico e fornisce una visualizzazione dettagliata della crescita dei neuriti trigeminali verso il germe del dente attraverso le microscanalature del dispositivo. Inoltre, evidenzia il ruolo dei fattori molecolari derivati dai denti nel promuovere o inibire l'estensione dei...

Analisi delle interazioni tra germe dei denti e gangli del trigemino utilizzando un sistema di co-coltura microfluidica

Questo video dimostra la valutazione dell'attività elettrica neuronale in una co-coltura di neuroni glutammatergici corticali derivati da hiPSC e cellule di glioma utilizzando un dispositivo microfluidico con array multielettrodi.

Valutazione delle interazioni tra neuroni glutammatergici e cellule di glioma in una co-coltura

Qui ci dettaglio un metodo per cultura germi denti in fette mandibola con un chopper tessuto. Questo metodo consente l'accesso esclusivo al dente durante lo sviluppo, fornendo un'ottima opportunità per la manipolazione e lignaggio tracing, non disponibile utilizzando metodi di coltura più tradizionali.

Il Metodo Culture Slice per seguire lo sviluppo dei germi dente Espianto Cultura

Sono descritti protocolli per singolo neurone microfluidica arraying e mascheramento acqua per il patterning plasma in-chip di rivestimenti biomateriale. Co-colture altamente interconnessi possono essere preparati utilizzando gli ingressi di cellule minimali.

Preparazione della neuronali Co-culture con precisione singola cella

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Il metodo di coltura degli organi di tipo Trowell è stato utilizzato per svelare complesse reti di segnalazione che governano lo sviluppo dei denti e, più recentemente, per studiare la regolazione coinvolta nelle cellule staminali dell'incisivo di topo in continua crescita. I modelli animali fluorescenti e i metodi di imaging dal vivo facilitano analisi approfondite delle cellule staminali dentali e del loro specifico microambiente di nicchia.

Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

Lavori recenti scoprono l'impatto neuronale sulle cellule di glioma pediatrico di alto grado (pHGG) e le loro interazioni reciproche. Il presente lavoro mostra lo sviluppo di un modello in vitro che co-coltiva cellule pHGG e neuroni glutamatergici e registra le loro interazioni elettrofisiologiche per imitare tali interattività.

Co-coltura di neuroni glutamatergici e cellule di glioma pediatrico di alto grado in dispositivi microfluidici per valutare le interazioni elettriche

neuroHuMiX è un modello avanzato gut-on-a-chip per studiare le interazioni di cellule batteriche, epiteliali e neuronali in condizioni di co-coltura prossimali e rappresentative. Questo modello permette di svelare i meccanismi molecolari alla base della comunicazione tra il microbioma intestinale e il sistema nervoso.

Un modello gut-on-a-chip per studiare l'asse microbioma intestinale-sistema nervoso

Impara a isolare e co-colture gangli trigeminali e germi dentali in dispositivi microfluidici per studiare l'innervazione. Questo metodo permette di visualizzare le interazioni neuronali con i tessuti bersaglio in vitro.

Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

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