Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

L'obiettivo generale del seguente esperimento è consentire misurazioni ripetute della conducibilità idraulica o della permeabilità all'acqua delle pareti dei microvasi Ular nel mesentere del ratto in condizioni sperimentali controllate. Questo risultato si ottiene cannullando i microvasi Ular in modo da regolare le pressioni oncotiche e idrostatiche nel lume e da controllare con precisione la composizione chimica del perfusato e dei tessuti circostanti. Successivamente, il vaso viene occluso e i globuli rossi sospesi nel perfusato, che fungono da marcatori di flusso, possono essere osservati mentre si muovono nel lume come indicatori dello scambio transvascolare di fluidi.

Quindi, la posizione e la velocità delle cellule marcatore rosse vengono registrate sia verso il sito di occlusione che lontano dal sito di occlusione. Infine, l'occlusione viene rilasciata e ripetuta per ulteriori misurazioni oppure il vaso viene cannullato nuovamente e le misurazioni vengono ripetute in condizioni modificate.

Infine, è possibile effettuare misurazioni accoppiate della conducibilità idraulica in condizioni di controllo e di prova, consentendo l'indagine più diretta dei fattori che regolano la permeabilità dei microvasi. Un vantaggio della tecnica di Landis modificata per lo studio della regolazione della permeabilità capillare è il passaggio di perfusione. La microperfusione permette di misurare la permeabilità della parete dei microvasi in condizioni in cui la composizione del perfusato, la superficie di scambio e la pressione nei microvasi sono tutte controllate direttamente.

Questo metodo può affrontare domande relative ai meccanismi cellulari e molecolari che regolano la permeabilità nei microvasi rappresentativi di organi integri e può fornire un confronto con i risultati ottenuti da monocapati endoteliali coltivati, spesso utilizzati per studiare nei dettagli i meccanismi molecolari. A illustrare il nostro protocollo è Joyce Clark, la responsabile del laboratorio. Joyce ha contribuito ad apportare numerosi miglioramenti a questo protocollo durante il suo tempo trascorso come responsabile del nostro laboratorio.

Per iniziare, utilizzare un estrattore elettronico per modellare diversi tubi capillari di vetro borosilicato in semipunte affusolate, ciascuna con una lunghezza della punta di circa un centimetro, impiegando una mola azionata ad aria e una carta abrasiva da 0,5 micron bagnata in acqua e un supporto per micropipette impostato a un angolo di 30 gradi rispetto al piano orizzontale, le micropipette. Dopo aver lavato e asciugato le micropipette secondo il protocollo descritto nel testo, selezionare micropipette con un'apertura di circa 50 micron di lunghezza e un rapporto tra lunghezza e larghezza del bisellino compreso tra 3,1 e 3,5. Dovrebbero inoltre presentare una punta fortemente affusolata, utile per penetrare le resistenti fibre di collagene nel mesentere.

Per realizzare dei restringitori, tenere brevemente una pipetta capillare di vetro tirata senza bocca sotto una piccola fiamma per formare una punta smussata. Ripetere l'operazione per ottenere diversi restringitori e conservarli in una scatola priva di polvere. Successivamente, preparare i micro occluditori tenendo un tubo capillare tirato senza bocca ad un angolo sotto una piccola fiamma e utilizzando un adattatore per tubi o una micropipetta rotta per piegare delicatamente il tubo a circa quattro millimetri dalla punta, formando un angolo prossimo ai 120 gradi.

Rispetto alla punta, è importante che non venga sigillata con la fiamma né rotta. Dopo aver anestetizzato un ratto e disposto il tessuto mesenterico e l'intestino secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare il vassoio dell'animale sullo stage del microscopio in modo che il mesenterico sia visibile attraverso gli oculari. Posizionare una linea di gocciolamento a gravità contenente soluzione fisiologica per mammiferi per mantenere un'irrorazione continua.

Quindi, utilizzare tamponi di garza per tenere fermo l'intestino, aiutare a mantenere l'umidità e assorbire l'eccesso di soluzione fisiologica dalla superficie; regolare il flusso e aspirare l'effluente per mantenere uno strato costante di soluzione salina, identificare i microvasi bersaglio, ovvero segmenti non ramificati a valle di un flusso convergente e uno o due rami a valle dei veri capillari. Individuare un vaso non ramificato con flusso ematico rapido e privo di cellule bianche aderenti alla parete del vaso. Posizionare i microvasi da testare al centro del campo del microscopio e spostare il fissatore in prossimità del sito di cannuolatura scelto.

Per riempire la pipetta micrometrica, aspirare il perfusato e lavare gli eritrociti in una siringa preparata secondo il protocollo descritto nel testo, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria nel tubicino. Inserire il tubicino nell'estremità più larga della pipetta micrometrica fino a quando non raggiunge la zona conica. Applicare una leggera spinta rapida sullo stantuffo della siringa per riempire la punta della pipetta micrometrica.

Apparirà un piccolo flusso o goccia sulla punta quando sarà piena. Mentre si ritira il tubo, premere delicatamente sullo stantuffo per riempire il fusto della micropipetta. Successivamente, rimuovere le piccole bolle d'aria nel fusto dandogli leggeri colpetti.

Quindi posizionare la micropipetta in un supporto per pipette dotato di un foro laterale che permette una connessione fluida continua a un manometro ad acqua. Assicurarsi che il supporto, collegato a un attuatore idraulico e a un micromanipolatore, sia regolato con un leggero angolo orizzontale in modo che il bordo del restringimento della micropipetta non urti l’intestino o il vassoio. Mediante una siringa o una pipetta di gomma riempita d’acqua, regolare la pressione idrostatica applicata al fluido nella micropipetta modificando l’altezza del liquido nella colonna d’acqua del manometro fino a raggiungere circa 40 centimetri di colonna d’acqua al di sopra del mesentere.

Prima di posizionare la micropipetta riempita sotto il microscopio, premere delicatamente il fermo sul tessuto vicino ai micro vasi, applicando una forza sufficiente per afferrare il tessuto; quindi tirare leggermente indietro il fermo, allungando il tessuto in linea con i micro vasi in modo che le sollecitazioni delle fibre di collagene mesenteriche siano allineate con il vaso. Allineare la micropipetta con il vaso e abbassarla fino a portarla in vista attraverso gli oculari. Posizionare la punta appena a monte del sito di cannullazione scelto e abbassarla sul tessuto in modo che ostacoli parzialmente il flusso all'interno del vaso, senza occluderlo.

Utilizzando la pompa idraulica, cannuilare il vaso inserendo lentamente la punta della pipetta nel lume del vaso, avendo cura di non spingere la punta attraverso il lato opposto del vaso. Quando la micropipetta entra nel lume, il perfusato otterrà rapidamente il lavaggio del sangue dal lume del vaso e si immetterà nella circolazione. Ridurre la pressione di perfusione regolando il manometro finché i globuli rossi oscillano dolcemente all'interno del lume vascolare.

Questo determina la pressione di equilibrio, che misura la pressione idrostatica nei micro vasi o PC all'estremità distale del segmento di micro vasi. Mantenere la perfusione del vaso al di sopra di questa pressione di equilibrio per eseguire l'occlusione microscopica. Posizionare il bloccatore al di sopra del vaso perfuso, vicino al margine inferiore del campo del microscopio, utilizzando video e audio.

Registrare verbalmente la posizione del sito di blocco osservata nel pezzo rosso I. Il sito di blocco è a 57 con la punta del bloccante posizionata appena sopra il microvaso. Utilizzare il controllo fine Z del micromanipolatore per abbassare delicatamente il bloccante fino a quando il flusso nel vaso non viene occluso.

Utilizzare l'audio per rilevare la pressione del manometro. La pressione è 50. Applicare quindi l'occlusione per tre-dieci secondi e rilasciare.

Per ripristinare la perfusione libera, spostare il sito di blocco lungo il vaso in direzione della punta della pipetta a passi di cinque-dieci micron, effettuando non più di tre-cinque occlusioni per ogni posizione al fine di prevenire danni alla parete vascolare nel sito di blocco. Analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo. Questo andamento temporale misura le variazioni di conducibilità idraulica o LP. In vasi microscopici ulari di ratto correttamente cannullati con otto perfusati.

L'entità della LP a pressione costante è stata utilizzata per misurare le variazioni nei microvasi. La permeabilità della parete quando perfusi con BSA al 1% come controllo rispetto a 10 moli dell'agente infiammatorio Bradychinina o bk. Come mostrato qui, BK ha causato un aumento transitorio della LP che è tornato ai livelli di controllo entro 10-15 minuti.

Dopo aver ristabilito i livelli di base con BSA 1% a 10 nanomolari, la BK è stata reperfusa insieme a un micromolare di pH scene one fosfato o S one P. I risultati indicano che la S one P ha notevolmente attenuato la risposta alla bk. Per alcuni disegni sperimentali, è importante stimare sia il coefficiente di riflessione del soluto per una macromolecola sia la lp.

Questo viene realizzato al meglio misurando JV a diverse pressioni su ciascun singolo microvaso. Questo esperimento ha stimato sia LP che la pressione oncotica efficace dell'albumina al 5% nel PERFUSE eight in assenza di albumina nei tessuti circostanti i microvasi. JV rispetto a S è stato misurato a tre pressioni diverse e riportato graficamente qui.

L'LP è la pendenza della relazione tra JV su S e la pressione, e l'intercetta sull'asse della pressione è la differenza efficace di pressione oncoticca attraverso la parete del vaso. Quando combinata con altre tecniche come la marcatura mediante immunofluorescenza e la microscopia confocale, o addirittura la microscopia elettronica a trasmissione, la microperfusione fornisce un'analisi potente dell'endotelio microvascolare e della sua funzione, utilizzando vasi di permeabilità nota. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare misurazioni ripetute della conduttività idraulica o della permeabilità all'acqua di microvasi ulari nel mesentere del ratto in condizioni sperimentali controllate.

È possibile utilizzare questo approccio nei modelli di ratto attualmente disponibili, ma sono particolarmente interessato alla possibilità che possa essere impiegato in nuovi ratti geneticamente modificati che diventeranno disponibili grazie alla tecnologia CRISPR Cas nine, e spero che venga esteso in questo modo.