Name: Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Scopri la tecnica di microperfusione modificata Landis per misurare la conduttività idraulica dei microvasi nel mesentere di ratto. Questo metodo permette di controllare pressioni oncotiche e idrostatiche per studiare lo scambio transvascolare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HL44485 e HL28607.

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l&#39;uso degli animali istituzionale. 1. Fabbricazione preliminare di Micropipette, la limitazione dei movimenti, e bloccanti <ol><li> Estrarre diversi tubi capillari di vetro borosilicato pulite in metà con un estrattore elettronico regolato in modo che, quando viene tirato, la porzione allungata del tubo è di circa 1 cm di lunghezza e le due metà sono piuttosto simmetriche. Assicurarsi che il cono è coerente con le dimensioni in figura 1. Utilizzare le due metà per micropipette, la limitazione dei movimenti e bloccanti. <ol><li> Bevel le micropipette con un&#39;aria azionato mola 30 con 0,5 micron carta abrasiva bagnata con acqua. Impostare l&#39;angolo del supporto micropipetta in modo che sia di circa 30 gradi rispetto all&#39;orizzontale. </li><li> Lavare accuratamente e asciugare le micropipette utilizzando aspirazione a tirare acetone pulita attraverso la punta e il pozzo. Ispezionare le micropipette (Figura 1A) con un piccolo microscopio verticale con 4 × 40 × e gli obiettivi dotati di un supporto micropipetta coccodrillo e un reticolo oculare. </li><li> Selezionare le micropipette con apertura punta di circa 50 micron di lunghezza con uno smusso il cui rapporto lunghezza / larghezza è compresa tra 3.1 e 3.5 e con un punto di profonda rastrematura che aiuta a penetrare le fibre di collagene dure nel mesentere. </li><li> Conservare 15-20 micropipette di leggermente diverse dimensioni in una scatola senza polvere. </li></ol></li><li> Fai la limitazione dei movimenti che utilizzano tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare di vetro tirato brevemente vicino a un microfiamma per formare una punta smussata (Figura 1B). Conservare diversi in una scatola senza polvere. </li><li> Fai microoccluders utilizzando tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare tirato sotto un microfiamma e delicatamente piegare (tramite un adattatore tubi, ad es., 23G) la punta fine (circa 4 mm dalla punta) a formare un angolo di quasi 120 gradi all&#39;albero ( <strong&gt; Figura 1C). Marca e memorizzare diversi. </li></ol> Preparazione degli animali 2. e Chirurgia <ol><li> Anestetizzare maschile (350-450 g) o ratti femmina Sprague-Dawley (200-300 g) con sodio pentobarbital (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) per via sottocutanea; proteggere il mesentere non usando iniezione intraperitoneale. </li><li> Nel corso procedure chirurgiche e protocolli sperimentali, mantenere l&#39;anestesia con iniezioni supplementari (30 mg / kg) in base alle esigenze. Determinare profondità dell&#39;anestesia per pizzico piedi o riflesso corneale. Dopo il completamento della procedura sperimentale, eutanasia ratto con pentobarbital sovradosaggio o iniezione intra-cardiaca di cloruro di potassio saturo sotto anestesia. </li></ol> 3. Preparare Soluzioni e eritrociti da utilizzare come flusso Marcatori <ol><li> Preparare la soluzione dei mammiferi di Ringer per superfusate e soluzione di controllo perfusato (mammiferi soluzione di Ringer contenente 10 mg / ml di acido grasso in generegratis albumina sierica bovina, BSA). <ol><li> Filtro perfusato attraverso 0,2 micron filtri siringa per rimuovere le particelle molto piccole che potrebbero bloccare la punta micropipetta; filtrare nel piccolo contenitore pulito. </li></ol></li><li> Preparare eritrociti disegnando circa 0,2 ml di sangue dalla vena della coda del topo anestetizzato in un ago 20G in una piccola siringa contenente 0,05 ml di eparina (1.000 U / ml) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente circa 14 ml di mammifero soluzione Ringer . <ol><li> Centrifuga per imballare delicatamente le cellule rosse (circa max 200 × g per 7 minuti). Aspirare il surnatante e risospendere i globuli rossi in soluzione di Ringer. </li><li> Dopo centrifugazione e la rimozione del supernatante tre volte lasciano i globuli rossi concentrati nella parte inferiore del tubo per un uso successivo. Si noti che questa procedura riduce piastrine nei perfusates finali a meno dello 0,1% dei livelli normali 31. </li></ol></li></ol> 4. Disporre il tessuto sul AnimalVassoio <ol><li> Radere l&#39;addome del topo anestetizzato da sotto l&#39;ombelico al processo xifoideo. Assicurarsi che l&#39;area rasata estende intorno al lato destro (per ratto posto sul lato destro) in modo che i capelli non forma uno stoppino per disegnare il superfusate fuori del tessuto ben. Rimuovere i peli tagliati con una garza bagnata o tessuto. <ol><li> Tenere la pelle con un ottuso pinza dentata e fare un&#39;incisione linea centrale (lunga 2-3 cm) attraverso la pelle utilizzando un paio di forbici robuste. Utilizzando una multa (iris) forbici fanno un&#39;incisione simile attraverso la linea alba, sollevando la parete addominale con una pinza dentata per evitare di danneggiare l&#39;intestino. </li><li> Con l&#39;animale su un fianco sul vassoio animale, estrarre delicatamente l&#39;intestino dalla cavità addominale utilizzando applicatori con punta in cotone (bastone di legno) imbevute di soluzione di Ringer e pinze dentellate smussato. Disporre l&#39;intestino nel tessuto bene in modo che il mesentere è drappeggiato su colonna per la visualizzazione al microscopio facendo attenzione a non toccare il mesentere (potentially danneggiando microvasi) sia con pinze o cotone. Nota: Il vassoio animale (Figura 2A) può essere costruito da plexiglas e richiede un tessuto ben (circa 3 mm di profondità), una colonna otticamente trasparente (ad esempio, quarzo lucidato circa 2 cm di diametro e 5 mm di altezza.), E un tampone riscaldamento regolato per mantenere la temperatura dell&#39;animale. Lo spessore del pilastro non deve superare la distanza di lavoro dell&#39;obiettivo. </li></ol></li><li> Posizionare il vassoio animale sul palco microscopio in modo che il mesentere è visibile attraverso gli oculari. </li><li> Posizionare una linea di gocciolamento per gravità a superfuse continuamente mesentere con la soluzione dei mammiferi di Ringer mantenuta a 35-37 ° C. Utilizzare garze per tenere l&#39;intestino in luogo, contribuire a mantenere l&#39;umidità e favorire la soluzione in eccesso di Ringer fuori dalla superficie. Regolare il flusso e aspirare l&#39;effluente di mantenere uno spessore superfusate coerente. </li><li> Identificare bersaglio microvasi venulari, che sonosegmenti non ramificate a valle del flusso convergente, uno o due rami distali ai veri capillari. Trovare un vaso non ramificato (idealmente, da 600 a 1.000 micron di lunghezza) che hanno attivo il flusso di sangue e privo di globuli bianchi che spuntano sulle pareti del serbatoio. </li><li> Posizionare microrecipiente prova nel centro del campo ottico e spostare il dispositivo di immobilizzazione nella posizione vicino al sito cannulazione prescelto. </li></ol> 5. Riempire Micropipetta e il Monte di Holder <ol><li> Poco prima cannulating, sospendere i globuli rossi del perfusato. Aggiungere 7 ml di globuli rossi concentrati a 0,5 ml perfusato in una provetta pulita borosilicato. Nota: ematocrito del 1-3% può essere utilizzato, ma ematocrito coerente porterà a concentrazioni perfusato coerenti di eventuali sostanze rilasciate dai globuli rossi. </li><li> Montare una siringa da 1 ml con un adattatore tubi 23G e PE 50 tubi (5-15 cm di lunghezza). Disegna la / miscela di cellule rosso perfusato nella siringa. Capovolgere la siringa per mescolare ed espellere tutte le bolle dal tubo eadattatore. Per una maggiore efficienza, la tubazione adatta a diverse siringhe prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento e tenerli in una scatola senza polvere o sacchetto di plastica. </li><li> Riempire il micropipetta avanzando il tubo nel grande fine della micropipetta fino a che non confina con la regione rastremata. Applicare una spinta rapida delicato sulla stantuffo della siringa per riempire la punta micropipetta. Nota: Un piccolo ruscello o di goccioline devono essere visibili sulla punta di evidenziare riempimento completo. </li><li> Ritirare il tubo mentre spingendo delicatamente lo stantuffo per riempire la parte più larga dell&#39;albero micropipetta. Rimuovere piccole bolle nel vasto pozzo muovendo con cautela l&#39;albero micropipetta. Nota: Una procedura simile è stata illustrata 32. </li><li> Posizionare la micropipetta in un supporto pipetta con una porta laterale che consente un collegamento di fluido continuo ad un manometro ad acqua. Assicurarsi che il titolare, che è attaccato ad un azionamento idraulico utilizzato per controllare l&#39;avanzamento molto fine della micropipetta, è con una leggera angolazione (15-25 °)all&#39;orizzontale in modo che il bordo del cono micropipetta non colpisce l&#39;intestino o il vassoio. </li><li> Montare l&#39;azionamento idraulico su un micromanipolatore mobile, che ha x, y, z e unità per consentire stretto allineamento al recipiente di prova (figura 2). </li><li> Regolare la pressione idrostatica applicata al fluido nella micropipetta con una siringa o bulbo di gomma pieno d&#39;acqua per modificare l&#39;altezza del liquido nella colonna d&#39;acqua del manometro a circa 40 cm H 2 O sopra mesentere. </li><li> Incannulare microrecipiente appena possibile dopo il riempimento della pipetta; globuli rossi si depositano sul fondo della pipetta, in modo che dopo circa 40 min pochissimi globuli rossi fluirà nel recipiente. </li></ol> 6. Microcannulation e microvascolari pressione misura <ol><li> Prima di posizionare la micropipetta pieno sotto il microscopio, premere delicatamente il restrainer sul tessuto pressi microrecipiente applicare una forza sufficiente per afferrare il tessuto. Disegnare larestrainer indietro, leggermente l&#39;allungamento dei tessuti in linea con microrecipiente modo che le sollecitazioni nelle fibre di collagene mesenterici sono allineate con il vaso. <ol><li> Allineare la micropipetta con la nave e abbassarlo in vista attraverso gli oculari. Posizionare la punta appena a monte del sito di incannulamento scelto e abbassarlo sul tessuto in modo che ostruisce parzialmente il flusso all&#39;interno del recipiente, ma non occlude esso. </li></ol></li><li> Incannulare la nave guidando la punta della pipetta lentamente nel lume del vaso con l&#39;azionamento idraulico. Fare attenzione a non spingere attraverso il lato inferiore del recipiente. Nota: Poiché la micropipetta entra nel lumen, il perfusato lava rapidamente il sangue nel vaso di lume e perfusato liberamente sfocia circolazione distale degli animali alla microrecipiente prova, spostando parte del normale perfusione sanguigna nei vasi a valle. </li><li> Abbassare la pressione di perfusione regolando manometro finché il sangue (come indicatoda globuli rossi dell&#39;animale) viene tirato indietro nel segmento perfusione; questo determina la pressione equilibrio in cui i globuli rossi oscillano dolcemente nel lume del vaso e misura la pressione idrostatica microvasi (P c) all&#39;estremità distale del segmento microvasi. Mantenere nave perfusione a tutte le pressioni di cui sopra questa pressione equilibrio. </li></ol> 7. Microocclusion e raccolta dei dati <ol><li> Passaggio facoltativo: Prima di utilizzare il micro-occlusore per bloccare la nave, premere in tessuto, in una zona non utilizzata di mesentere lontano da ogni nave in modo che la punta si accumula un bel blocco di tessuto che protegge la nave sperimentale durante micro ripetuto occlusioni. </li><li> Posizionare il blocco di sopra del recipiente perfuso vicino al bordo inferiore del campo del microscopio. </li><li> Registrare il seguente con il video e l&#39;audio. <ol><li> Verbalmente registrare la posizione del sito di blocco e il bordo schermo inferiore come visto sul reticolo oculare. </li><li> Con la puntadel bloccante posta proprio sopra il microvasi, utilizzare il controllo z multa di micromanipolatore per abbassare delicatamente il blocco fino a quando il flusso nel serbatoio è occluso. Nota la pressione manometro (P c) audio. Applicare l&#39;occlusione di solito per 3-10 secondi, quindi rilasciare, ripristinando la perfusione gratuito. Spostare il sito blocco la nave verso la punta della pipetta in 5-10 micron passi in base al tempo (&gt; 5 min dopo il blocco iniziale in un sito), il numero di occlusioni (3-5), per evitare di danneggiare parete del vaso presso il sito del blocco . </li></ol></li></ol> 8. Analisi dei dati e valutazione di L p (acqua permeabilità) <ol><li> Durante la riproduzione video, determinare la distanza iniziale (ℓ 0) da una cella rossa marcatore per il sito dell&#39;occlusione dall&#39;uso di un&#39;immagine di un micrometro e le posizioni note sulle immagini. Determinare la velocità iniziale (dℓ / dt) della cella marcatore dalla sua posizione in diversi frame durante la 3-10 sec di immagini registrate. Dissuadereminiera il raggio del serbatoio (r) dalle immagini scattate durante l&#39;occlusione (Figura 3). </li><li> Calcola J v / S per ogni occlusione (dℓ / dt) × (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcolare L p ad una pressione costante (J v / S) diviso per la pressione di pilotaggio (pressione microvasi - efficace pressione osmotica colloide; vedi Discussione). </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dettagli dei calcoli p L. Anche se il movimento fluido transvascular si verifica mentre la nave è liberamente perfuso, tale scambio è troppo piccolo per essere misurato durante la perfusione libero perché è in genere inferiore allo 0,01% del tasso di perfusione nave. Tuttavia, in condizioni di perfusione viene transitoriamente fermato occludendo microrecipiente, flusso transvascular (cioè, filtrazione) è misurata dal movimento dei globuli rossi marcatori nel lume della colonna di fluido tra ...

Microperfusione nella vascolatura comporta istituisce controllato flusso di perfusato artificiale di composizione nota mediante una micropipetta in un vaso sanguigno di solito meno di 40 micron di diametro. Il vaso perfuso rimane nel suo ambiente tessuto normale e viene perfuso con dell&#39;animale sangue fino al momento della cannulazione. Quando utilizzato in combinazione con una serie di video di immagini o di tecniche fluorimetrica, in situ microperfusione consente la misurazione dei flussi idrici e dei soluti attraverso le pareti dei microvasi in condizioni quali siano note le forze trainanti di questi flussi e le proprietà di permeabilità della parete vascolare può essere direttamente valutati. Inoltre, controllando la composizione del fluido circostante microrecipiente nel tessuto (perfusato e superfusate), la regolazione della permeabilità microvascolare e di scambio può essere indagata attivando le cellule endoteliali formano la parete microrecipiente essere esposti a una varietà di econdizioni Xperimental (agonisti, le condizioni di perfusione modificate, indicatori fluorescenti per misurare la composizione intracellulare e di segnalazione) per periodi misurati con precisione di tempo (sec a hr). Inoltre, le valutazioni ultrastrutturali o citochimici di chiave strutture molecolari cellulari che regolano la barriera possono essere studiate nelle stesse microrecipienti in cui la permeabilità viene misurata direttamente. L&#39;approccio costituisce così un ponte tra studio dei meccanismi cellulari e molecolari di modificare la funzione di barriera endoteliale in coltura monostrato di cellule endoteliali e indagine microvasi intatti. Vedere le seguenti recensioni per un&#39;ulteriore valutazione 1-6. Una limitazione di microperfusione è che può essere utilizzato solo in letti microvascolari che sono sottili, trasparenti e con integrità strutturale sufficiente a consentire incannulazione con una micropipetta di vetro. Mentre i primi accertamenti utilizzati microvasi rana in mesenterio e sottile cutanea pectoris muscle 7,8, di gran lunga la preparazione più comunemente usato nei modelli di mammiferi è il topo mesentere 9-15. La maggior parte delle indagini si sono concentrate sui cambiamenti acuti in permeabilità vascolare studiato per periodi di 1-4 ore, ma le indagini più recenti sono state estese a misurazioni su singoli pescherecci 24-72 ore dopo un iniziale perfusione 12,16. La tecnologia CRISPR recentemente sviluppato, che promette di rendere più modelli di ratto geneticamente modificati per lo studio vascolare regolazione della permeabilità 17 dovrebbe consentire i metodi descritti nella presente comunicazione da applicare in microvasi venulari del mesentere di questi nuovi importanti modelli di ratto. Il metodo richiede un microscopio rovesciato dotato di un palco microscopio su misura sufficientemente grande per contenere sia la preparazione degli animali e almeno tre micromanipolatori utilizzato per posizionare microtools vicino alla nave perfuso e per allineare una micropipetta perfusione con la navelumen. Ad esempio una piattaforma personalizzata per un palco microscopio xy (circa 90 × 60 cm) può essere fabbricata da una piastra di acciaio dello spessore di 1 cm con un rivestimento antiruggine. Lo stadio è collegato a una tabella indice ingegneria o due slitte a coda di rondine montate ad angolo retto e supportati su pilastri teflon o trasferimenti a sfere per il movimento nel piano orizzontale. Un impianto tipico (vedi figura 2) ha molto in comune con il microscopio e microposizionamento attrezzature utilizzate per una serie di esperimenti microcircolazione intravitale come quelli per misurare il flusso unico dei vasi sanguigni e dell&#39;ematocrito, il trasporto di ossigeno locale sangue perfusione microvasi, regolazione di vascolare liscio il tono muscolare, e l&#39;accumulo microvascolare locale dei traccianti fluorescenti iniettate nel suo complesso circolazione. 18-26 L&#39;aspetto fondamentale della tecnica è la misura della portata (J v) attraverso una superficie definita (S) della parete microvascolare. Realizzarequesto tramite la tecnica Landis modificato qui descritta una semplice microscopio invertito è adeguata. Una piccola videocamera è montata sulla porta immagine e il segnale video, con una base tempo aggiunto, viene visualizzato su un monitor video e registrate in forma digitale su un computer o un segnale digitale o analogico su un videoregistratore. Una volta microrecipiente si incannula la porzione di microvasi visibile alla telecamera può essere modificato spostando la fase e manipolatori come unità senza interrompere la cannulazione. Misurazione dei flussi transvascular può anche essere combinato con indagini più dettagliate utilizzando un sofisticato microscopio a fluorescenza con filtri appropriati, quali impianti utilizzati per la misurazione di soluto permeabilità, controllo rapporto fluorescente di calcio citoplasmatico o di altri meccanismi cellulari, e confocale 6,12,13, 27. Un vantaggio fondamentale di tutti gli approcci microperfusione è la capacità di fare misure ripetute, sulla nave, Sotto cambiamento controllato di forza motrice, come pressioni idrostatiche e oncotica, o cambiamento indotto nella risposta dei vasi alle condizioni infiammatorie. Il tipo più comune è un confronto accoppiato di conduttività idraulica misurata (L p) sulla nave con il vaso prima perfuso con una micropipetta riempito con un perfusato controllo e sospensione di eritrociti per stabilire uno stato basale permeabilità, quindi con una seconda pipetta con l&#39;agente di test aggiunto perfusato. Molteplici cannulazioni sono possibili con il ciclo ripetuto dopo riperfusione con la pipetta di controllo. Il presente protocollo dimostra la cannulazione e microperfusione di un vaso venulare nel ratto mesentere registrare flussi di acqua attraverso la parete microvessel e misurare la L p della parete del vaso, un indice utile della permeabilità del percorso comune per l&#39;acqua e soluti attraverso intatto barriera endoteliale. La procedura si chiama techniq Landis modificatoue perché il principio originale Landis di utilizzare il movimento relativo dei globuli rossi come misura di scambio fluido transvascular dopo perfusione è bloccato è conservato 28, ma la gamma di condizioni sperimentali (ad esempio, le differenze di pressione oncotica idrostatica e albumina attraverso la parete microrecipiente) disponibile dopo microperfusione è di gran lunga maggiore rispetto al sangue perfuso uncannulated microvasi 8,29.

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPIO, TAVOLO E TAVOLINO Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>invertito (tipo metallurgico) con testa trinoculare per video: esempio</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>cerca di posizionare gli oculari più in alto rispetto al tavolino: devi guardare attraverso gli oculari mentre raggiungi la parte superiore del tavolino sopra i micromanipolatori intermedi</td></tr><tr><td>microscopio invertito (tipo metallurgico) con testa trinoculare per video: esempio</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>cerca di posizionare gli oculari più in alto rispetto al palco: devi guardare attraverso gli oculari mentre raggiungi la parte superiore del palco sopra i micromanipolatori intermedi</td></tr> diametro <tr><td>stretto, lunga distanza di lavoro obiettivo: esempio</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10&times;/0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>stage platform - 1/2 pollice o 1 cm</td><td>di officina di saldatura</td><td></td> in lamiera d'acciaio <td>questo dovrebbe essere pesante per ridurre le vibrazioni</td></tr><tr><td>Unislide x-y table: diapositive a coda di rondine</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO Videocamera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD: esempio</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (non più disponibile)</td><td>nessun colore necessario</td></tr><tr><td>sistema di acquisizione video con audio--sistema di riproduzione video generico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(fotogramma completamente fermo, movimento a fotogramma singolo)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>piccolo microfoni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPOLATORI, SUPPORTI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipolatore, XYZ (3)</td> <td>Prior/Stoelting (non più disponibile)</td><td></td> <td>cercare Z fine e una gamma più ampia di corsa in azionamenti grossolani per facilitare il posizionamento azionamento idraulico</td></tr><tr><td>della sonda, un modo</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>bisogno di acquistare azionamento manuale o azionamento elettronico</td></tr><tr><td>azionamento manuale del tamburo&nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>o azionamento idraulico, 3 vie</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1 via) o MX630 (3 vie)</td> <td>ottimo per bracci corti, riempito d'acqua e deve essere rispedito indietro per la ricarica ~ ogni 2 anni</td></tr><tr><td>connettori / aste / supporti</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB ecc.</td><td></td></tr><tr><td>morsa a spillo</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>per contenere</td></tr><tr><td>il portapipette</td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>manometro dell'acqua ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VASSOIO</td><td></td><td></td><td></td>PER</tr><tr><td>MICROSCOPIO in plexiglas trasparente per vassoio per animali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco in quarzo lucido da 3/4 di pollice ~1/4 di pollice alto ~ 1/4 di pollice di altezza</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>personalizzato</td><td>&nbsp;( o plexiglass lucido, vetro); assicurarsi che l'altezza sia inferiore alla distanza di lavoro dell'obiettivo</td></tr><tr><td>Colla di plexiglas (Weld-on 4: ATTENZIONE CANCEROGENA)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>adesivo medico per pozzetto dei tessuti</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>Tappetino riscaldante in gomma siliconica multiuso, 5" L x 2" W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>riscaldatore per vassoio per microscopio - necessita di cavo e controller - versione 240V disponibile</td></tr><tr><td>Adattatore per cavo di alimentazione per riscaldatori e kit Kapton, 6 piedi, 120 V CA</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Regolatore a tensione variabile, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>estrattore per pipette verticale</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 con filamento</td><td></td>di nicromo</tr><tr><td>1,5 mm OD tubo capillare a parete sottile</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>macinatore per pipette per pietra porosa e microscopio per dissezione: vedere il riferimento nel testo</td><td></td><td></td><td>o acquistare un pacchetto da Sutter Instruments o World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Levigatrice RX, System II</td><td>RX Levigatrice Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Macchina</td><td>alternativa per pietra porosa, utilizzare con un microscopio da dissezione montato ad angolo</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; con disco per affilare in ceramica</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>utilizzare "così com'è" o attaccare</td></tr><tr><td>fogli di pellicola per lappatura, 0,3 o 0,5 um</td><td></td><td>3M codice 051144 80827</td><td>268X Fogli di pellicola per lappatura imperiali con retro adesivo - può essere acquistato da Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusione tecnica per indagare regolamento di microvasi permeabilità a rat mesentere

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Gli esperimenti per misurare le proprietà di permeabilità dei microvasi irrorati individualmente forniscono un ponte tra studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano la permeabilità vascolare in coltura monostrato di cellule endoteliali e le proprietà di scambio funzionali di interi letti microvascolari. Un metodo per cannulare e perfusione microvasi venulari di ratto mesentere e misurare la conduttività idraulica della parete dei microvasi è descritta. Le principali attrezzature necessarie include un microscopio intravitale con un grande palco modificato che supporta micromanipolatori di posizionare tre differenti microtools: (1) una micropipetta di vetro smussato a cannulare e perfusione microrecipiente; (2) un vetro micro-occlusore per bloccare transitoriamente perfusione e consentire la misurazione di transvascular movimento flusso d&#39;acqua ad una pressione idrostatica misurata, e (3) una bacchetta di vetro smussato per stabilizzare il tessuto mesenterico nel sito di incannulamento. Il Landis micro-occlusione techniq modificatoue utilizza globuli rossi sospese nel perfusato artificiale come marcatori di fluido movimento transvascular, e consente inoltre misurazioni ripetute di questi flussi condizioni sperimentali sono cambiati e differenza idrostatica e colloide pressione osmotica attraverso i microvasi sono attentamente controllati. Le misurazioni della conducibilità idraulica prima con un perfusato controllo, quindi dopo la ri-incannulamento della stessa microvasi con i perfusates prova consentono confronti della risposta dei microvasi in queste condizioni ben controllate associati. I tentativi di estendere il metodo per microvasi nel mesentere di topi con modificazioni genetiche che si prevede di modificare la permeabilità vascolare erano fortemente limitata a causa dell&#39;assenza di lunghi microvasi dritti e ramificati nel mesentere del mouse, ma la recente disponibilità dei ratti con modificazioni genetiche simili utilizzando la tecnologia / Cas9 CRISPR è prevista l&#39;apertura di nuove aree di indagine in cui possono essere applicati i metodi qui descritti. </p&gt;

La Figura 4 mostra i risultati di misurazione del decorso temporale delle variazioni di L p in un ratto venulare microvasi cannulato successivamente con quattro perfusates. 33 L&#39;entità di L p calcolata a pressione costante è stato usato come una misura delle variazioni di microvasi permeabilità della parete, prima nello stato di controllo con un perfusato contenente 1% di albumina sierica bovina poi, quando la nave è stata esposta per la bradichinina agente infiammat...

La tecnica Landis modificata consente la misurazione accoppiata della conducibilità idraulica di singoli microvasi nel mesentere di ratti normali e geneticamente modificati in condizioni di controllo e test utilizzando tecniche di microperfusione. Fornisce un metodo conveniente per valutare i meccanismi che regolano la permeabilità dei microvasi e lo scambio transvascolare in condizioni fisiologiche.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è consentire misurazioni ripetute della conducibilità idraulica o della permeabilità all'acqua delle pareti dei microvasi Ular nel mesentere del ratto in condizioni sperimentali controllate. Questo risultato si ottiene cannullando i microvasi Ular in modo da regolare le pressioni oncotiche e idrostatiche nel lume e da controllare con precisione la composizione chimica del perfusato e dei tessuti circostanti. Successivamente, il vaso viene occluso e i globuli rossi sospesi nel perfusato, che fungono da marcatori di flusso, possono essere osservati mentre si muovono nel lume come indicatori dello scambio transvascolare di fluidi.Quindi, la posizione e la velocità delle cellule marcatore rosse vengono registrate sia verso il sito di occlusione che lontano dal sito di occlusione. Infine, l'occlusione viene rilasciata e ripetuta per ulteriori misurazioni oppure il vaso viene cannullato nuovamente e le misurazioni vengono ripetute in condizioni modificate.Infine, è possibile effettuare misurazioni accoppiate della conducibilità idraulica in condizioni di controllo e di prova, consentendo l'indagine più diretta dei fattori che regolano la permeabilità dei microvasi. Un vantaggio della tecnica di Landis modificata per lo studio della regolazione della permeabilità capillare è il passaggio di perfusione. La microperfusione permette di misurare la permeabilità della parete dei microvasi in condizioni in cui la composizione del perfusato, la superficie di scambio e la pressione nei microvasi sono tutte controllate direttamente.Questo metodo può affrontare domande relative ai meccanismi cellulari e molecolari che regolano la permeabilità nei microvasi rappresentativi di organi integri e può fornire un confronto con i risultati ottenuti da monocapati endoteliali coltivati, spesso utilizzati per studiare nei dettagli i meccanismi molecolari. A illustrare il nostro protocollo è Joyce Clark, la responsabile del laboratorio. Joyce ha contribuito ad apportare numerosi miglioramenti a questo protocollo durante il suo tempo trascorso come responsabile del nostro laboratorio.Per iniziare, utilizzare un estrattore elettronico per modellare diversi tubi capillari di vetro borosilicato in semipunte affusolate, ciascuna con una lunghezza della punta di circa un centimetro, impiegando una mola azionata ad aria e una carta abrasiva da 0,5 micron bagnata in acqua e un supporto per micropipette impostato a un angolo di 30 gradi rispetto al piano orizzontale, le micropipette. Dopo aver lavato e asciugato le micropipette secondo il protocollo descritto nel testo, selezionare micropipette con un'apertura di circa 50 micron di lunghezza e un rapporto tra lunghezza e larghezza del bisellino compreso tra 3,1 e 3,5. Dovrebbero inoltre presentare una punta fortemente affusolata, utile per penetrare le resistenti fibre di collagene nel mesentere.Per realizzare dei restringitori, tenere brevemente una pipetta capillare di vetro tirata senza bocca sotto una piccola fiamma per formare una punta smussata. Ripetere l'operazione per ottenere diversi restringitori e conservarli in una scatola priva di polvere. Successivamente, preparare i micro occluditori tenendo un tubo capillare tirato senza bocca ad un angolo sotto una piccola fiamma e utilizzando un adattatore per tubi o una micropipetta rotta per piegare delicatamente il tubo a circa quattro millimetri dalla punta, formando un angolo prossimo ai 120 gradi.Rispetto alla punta, è importante che non venga sigillata con la fiamma né rotta. Dopo aver anestetizzato un ratto e disposto il tessuto mesenterico e l'intestino secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare il vassoio dell'animale sullo stage del microscopio in modo che il mesenterico sia visibile attraverso gli oculari. Posizionare una linea di gocciolamento a gravità contenente soluzione fisiologica per mammiferi per mantenere un'irrorazione continua.Quindi, utilizzare tamponi di garza per tenere fermo l'intestino, aiutare a mantenere l'umidità e assorbire l'eccesso di soluzione fisiologica dalla superficie; regolare il flusso e aspirare l'effluente per mantenere uno strato costante di soluzione salina, identificare i microvasi bersaglio, ovvero segmenti non ramificati a valle di un flusso convergente e uno o due rami a valle dei veri capillari. Individuare un vaso non ramificato con flusso ematico rapido e privo di cellule bianche aderenti alla parete del vaso. Posizionare i microvasi da testare al centro del campo del microscopio e spostare il fissatore in prossimità del sito di cannuolatura scelto.Per riempire la pipetta micrometrica, aspirare il perfusato e lavare gli eritrociti in una siringa preparata secondo il protocollo descritto nel testo, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria nel tubicino. Inserire il tubicino nell'estremità più larga della pipetta micrometrica fino a quando non raggiunge la zona conica. Applicare una leggera spinta rapida sullo stantuffo della siringa per riempire la punta della pipetta micrometrica.Apparirà un piccolo flusso o goccia sulla punta quando sarà piena. Mentre si ritira il tubo, premere delicatamente sullo stantuffo per riempire il fusto della micropipetta. Successivamente, rimuovere le piccole bolle d'aria nel fusto dandogli leggeri colpetti.Quindi posizionare la micropipetta in un supporto per pipette dotato di un foro laterale che permette una connessione fluida continua a un manometro ad acqua. Assicurarsi che il supporto, collegato a un attuatore idraulico e a un micromanipolatore, sia regolato con un leggero angolo orizzontale in modo che il bordo del restringimento della micropipetta non urti l’intestino o il vassoio. Mediante una siringa o una pipetta di gomma riempita d’acqua, regolare la pressione idrostatica applicata al fluido nella micropipetta modificando l’altezza del liquido nella colonna d’acqua del manometro fino a raggiungere circa 40 centimetri di colonna d’acqua al di sopra del mesentere.Prima di posizionare la micropipetta riempita sotto il microscopio, premere delicatamente il fermo sul tessuto vicino ai micro vasi, applicando una forza sufficiente per afferrare il tessuto; quindi tirare leggermente indietro il fermo, allungando il tessuto in linea con i micro vasi in modo che le sollecitazioni delle fibre di collagene mesenteriche siano allineate con il vaso. Allineare la micropipetta con il vaso e abbassarla fino a portarla in vista attraverso gli oculari. Posizionare la punta appena a monte del sito di cannullazione scelto e abbassarla sul tessuto in modo che ostacoli parzialmente il flusso all'interno del vaso, senza occluderlo.Utilizzando la pompa idraulica, cannuilare il vaso inserendo lentamente la punta della pipetta nel lume del vaso, avendo cura di non spingere la punta attraverso il lato opposto del vaso. Quando la micropipetta entra nel lume, il perfusato otterrà rapidamente il lavaggio del sangue dal lume del vaso e si immetterà nella circolazione. Ridurre la pressione di perfusione regolando il manometro finché i globuli rossi oscillano dolcemente all'interno del lume vascolare.Questo determina la pressione di equilibrio, che misura la pressione idrostatica nei micro vasi o PC all'estremità distale del segmento di micro vasi. Mantenere la perfusione del vaso al di sopra di questa pressione di equilibrio per eseguire l'occlusione microscopica. Posizionare il bloccatore al di sopra del vaso perfuso, vicino al margine inferiore del campo del microscopio, utilizzando video e audio.Registrare verbalmente la posizione del sito di blocco osservata nel pezzo rosso I. Il sito di blocco è a 57 con la punta del bloccante posizionata appena sopra il microvaso. Utilizzare il controllo fine Z del micromanipolatore per abbassare delicatamente il bloccante fino a quando il flusso nel vaso non viene occluso.Utilizzare l'audio per rilevare la pressione del manometro. La pressione è 50. Applicare quindi l'occlusione per tre-dieci secondi e rilasciare.Per ripristinare la perfusione libera, spostare il sito di blocco lungo il vaso in direzione della punta della pipetta a passi di cinque-dieci micron, effettuando non più di tre-cinque occlusioni per ogni posizione al fine di prevenire danni alla parete vascolare nel sito di blocco. Analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo. Questo andamento temporale misura le variazioni di conducibilità idraulica o LP. In vasi microscopici ulari di ratto correttamente cannullati con otto perfusati.L'entità della LP a pressione costante è stata utilizzata per misurare le variazioni nei microvasi. La permeabilità della parete quando perfusi con BSA al 1% come controllo rispetto a 10 moli dell'agente infiammatorio Bradychinina o bk. Come mostrato qui, BK ha causato un aumento transitorio della LP che è tornato ai livelli di controllo entro 10-15 minuti.Dopo aver ristabilito i livelli di base con BSA 1% a 10 nanomolari, la BK è stata reperfusa insieme a un micromolare di pH scene one fosfato o S one P. I risultati indicano che la S one P ha notevolmente attenuato la risposta alla bk. Per alcuni disegni sperimentali, è importante stimare sia il coefficiente di riflessione del soluto per una macromolecola sia la lp.Questo viene realizzato al meglio misurando JV a diverse pressioni su ciascun singolo microvaso. Questo esperimento ha stimato sia LP che la pressione oncotica efficace dell'albumina al 5% nel PERFUSE eight in assenza di albumina nei tessuti circostanti i microvasi. JV rispetto a S è stato misurato a tre pressioni diverse e riportato graficamente qui.L'LP è la pendenza della relazione tra JV su S e la pressione, e l'intercetta sull'asse della pressione è la differenza efficace di pressione oncoticca attraverso la parete del vaso. Quando combinata con altre tecniche come la marcatura mediante immunofluorescenza e la microscopia confocale, o addirittura la microscopia elettronica a trasmissione, la microperfusione fornisce un'analisi potente dell'endotelio microvascolare e della sua funzione, utilizzando vasi di permeabilità nota. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare misurazioni ripetute della conduttività idraulica o della permeabilità all'acqua di microvasi ulari nel mesentere del ratto in condizioni sperimentali controllate.È possibile utilizzare questo approccio nei modelli di ratto attualmente disponibili, ma sono particolarmente interessato alla possibilità che possa essere impiegato in nuovi ratti geneticamente modificati che diventeranno disponibili grazie alla tecnologia CRISPR Cas nine, e spero che venga esteso in questo modo.

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