Confrontando l'affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di confrontare le affinità relative dei partner di legame proteico per gli ACE GT P della famiglia Row in condizioni di carico nucleotidico attentamente controllate. Ciò si ottiene purificando prima i presunti partner di legame competitivi, ciascuno etichettato con lo stesso tag, ad esempio la proteina fluorescente verde o GFP. Il secondo passo è quello di purificare il GTPA di interesse.

Ad esempio, RAC uno e caricare con il nucleotide appropriato per ottenere lo stato di segnalazione GTPA desiderato. Successivamente, il gtpa caricato con nucleotidi viene incubato con una quantità fissa di un concorrente di legame e quantità crescenti dell'altro concorrente di legame per ottenere una curva di legame di titolazione. Il passo finale consiste nel risolvere le proteine legate alla PASI GT immobilizzata mediante western blot e sondare la membrana per il tag GFP che è condiviso tra i due partner di legame.

In definitiva, il Western blot viene utilizzato per identificare le concentrazioni relative alle quali quantità simili di ciascun partner di legame marcato con GFP vengono catturate dalla GTPasi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la coprecipitazione, è che le proprietà di legame proteico del gtpa sono dettate dal nucleotide legato nella cellula. Il nucleotide legato è labile, il che rende difficile l'interpretazione dei dati di legame con le proteine.

Iniziare questa procedura con la purificazione del gtpa marcato GST e l'espressione delle proteine leganti gtpa come descritto nel protocollo di testo. RIN i flaconi di cellule trasfettate in soluzione salina tampone fosfato o PBS e scolare il pallone per cinque minuti. Aspirando il liquido libero, quindi raschiare via le cellule in 500 microlitri di tampone di lisi in un tubo micro fuge, mescolare le cellule per lisi per inversione a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Durante la lisi, lavare tre volte due lotti da 40 microlitri di perle trappola GFP con sedimento tampone di lisi fresco. Le perle a 2, 700 volte G per due minuti tra un lavaggio e l'altro. Dopo la lisi, chiarificare i lisati mediante centrifugazione a 21.000 volte G per 10 minuti.

Trasferire il lisato chiarificato di ciascuna delle proteine concorrenti in perle trappola GFP separate. Lasciare che le proteine di fusione GFP si leghino per due ore, mescolandosi per inversione a quattro gradi Celsius. Lavare le perle della trappola GFP caricate due volte nel tampone di lisi e due volte in competizione.

Legare le perle di sedimentazione del tampone a 2, 700 volte G per due minuti tra un lavaggio e l'altro. Eluire le proteine di fusione GFP aggiungendo 40 microlitri di glicina molare 0,2 e pipettando su e giù per 30 secondi, sedimentare immediatamente le perle a 21.000 volte G per 60 secondi e trasferire il liquido in un nuovo tubo di fuge contenente quattro microlitri di un tris molare HCL, eseguire rapidamente questo passaggio per limitare i danni alla proteina purificata. Analizzare un microlitro di ciascuna proteina purificata mediante western blot e sondare con un anticorpo anti GFP per stabilire la resa relativa utilizzando un sistema di blotting quantitativo secondo il protocollo del produttore.

Equalizzare la concentrazione di proteine molari mediante l'aggiunta di un tampone legante la competizione. Prendi 90 microlitri di perle GST preparate e lavale tre volte con un tampone di caricamento nucleotidico utilizzando un selezionatore di particelle magnetiche per far precipitare le perle ad ogni passaggio. Aspirare il tampone dalle perle e aggiungere 100 microlitri di tampone di caricamento nucleotidico a seconda che sia richiesto G-D-P-G-T-P o nessun carico nucleotidico.

Per l'esperimento della competizione, aggiungere 12 microlitri di GDP 100 millimolari, 12 microlitri di 10 millimolari GTP gamma S o nessun nucleotide a 60 microlitri di perle GST rack one per i controlli di carico dei nucleotidi. Dividere le perle rimanenti in tre quat da 10 microlitri e aggiungere due microlitri di GDP da 100 millimolari, due microlitri di GTP gamma S da 10 millimolari o nessun nucleotide a ciascuna provetta. Incubare le miscele di perle per 30 minuti a 30 gradi Celsius con agitazione.

Stabilizzare il rack legato ai nucleotidi, uno mediante l'aggiunta di un molare di cloruro di magnesio alla miscela sperimentale e alle miscele di controllo per eseguire il legame della competizione. Installa sei tubi micro fuge. Ciascuno contiene 200 microlitri di tampone legante da competizione.

Ogni provetta deve contenere anche 10 microlitri del rack caricato con nucleotidi, una perlina e cinque microlitri del rack. Una proteina legante A come proteina legante costante a ciascuna provetta, aggiunge 0, 1, 2, 0,55, 10 o 20 microlitri di proteina legante B come proteina legante variabile. Questi volumi assumono concentrazioni di stock approssimativamente uguali delle proteine leganti costanti e variabili e potrebbe essere necessario aggiustarli.

Portare il volume totale della miscela legante a 235 microlitri con l'aggiunta del tampone legante da competizione. Quindi, installa un tubo micro fuge contenente 200 microlitri di tampone da competizione. 10 microlitri di rack sperimentale caricato con nucleotidi, una perlina e 10 microlitri di rack una proteina legante A.Quindi impostare il G-D-P-G-T-P gamma S e le provette di controllo senza nucleotidi come descritto nel protocollo di testo.

Incubare le provette per due ore, mescolando per inversione a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione. Lavare le perline tre volte con il tampone per legatura da competizione. Infine, eluire le proteine legate in 20 microlitri di tampone riducente del campione.

Il western blotting quantitativo del tag GFP di GFP RCC 2 purificato e GFP Corona in un dominio C.Propeller rivela che la proteina nella banda superiore, GFP RCC 2 è 1,4 volte più abbondante della banda inferiore e dovrebbe essere diluita per ottenere un rapporto molare uno a uno per l'esperimento di competizione. Un esperimento di controllo dimostra che lo stato di carico nucleotidico del rack uno determina la specificità del legame titolando volumi crescenti di GFP RCC due contro un volume fisso di GFP Corona equimolare in un dominio dell'elica C e blotting. Le proteine che si legano al rack uno consentono di visualizzare un cambiamento relativo nella proteina legata tracciando le intensità della banda GFP per entrambi i concorrenti sullo stesso grafico e identificando il punto in cui le linee si intersecano, consente di identificare il volume della proteina legante variabile all'equilibrio.

Tuttavia, è necessario prestare attenzione per garantire che problemi come l'interazione tra i concorrenti o l'eccesso di esca gtpa non compromettano l'esperimento. L'aumento di un concorrente senza perdita dell'altro, come mostrato qui, indica un problema durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordarsi di verificare che esista una relazione reciproca tra l'abbondanza dei partner leganti in competizione.

Esistono diversi problemi che possono distorcere i risultati e/o possono essere risolti purché vengano identificati esaminando i dati.