Confrontando l'affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare le affinità relative dei partner di legame proteici per le GTPasi della famiglia Row in condizioni di carico del nucleotide attentamente controllate. Questo viene ottenuto innanzitutto purificando i presunti partner di legame competitivi, ciascuno marcato con lo stesso tag, ad esempio la proteina verde fluorescente o GFP. Il secondo passaggio consiste nella purificazione della GTPA di interesse.

Ad esempio, RAC uno viene caricato con il nucleotide appropriato per raggiungere lo stato di segnalazione GTPA desiderato. Successivamente, il GTPA caricato con nucleotide viene incubato con una quantità fissa di un competitore di legame e quantità crescenti dell'altro competitore di legame, al fine di ottenere una curva di legame di titolazione. L'ultimo passaggio consiste nel risolvere le proteine legate alla GTpasi immobilizzata mediante blotting western e sondare la membrana per il marcatore GFP condiviso tra i due partner di legame.

In definitiva, il Western blot viene utilizzato per identificare le concentrazioni relative alle quali vengono catturate quantità simili di ciascun partner di legame marcato con GFP dalla GTPasi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la co-precipitazione, è che le proprietà di legame proteico della GTPasi sono determinate dal nucleotide legato all'interno della cellula. Il nucleotide legato è labile, rendendo difficile l'interpretazione dei dati sul legame proteico.

Iniziare questa procedura con la purificazione della proteina G tpa marcatra con GST e con l'espressione delle proteine che legano gtpa, come descritto nel protocollo testuale. Lavare i flaconi delle cellule trasfettate con soluzione salina fosfato tampone o PBS e lasciare defluire il flacone per cinque minuti. Aspirare il liquido in eccesso, quindi raschiare le cellule in 500 microlitri di buffer di lisi in un tubo microcentrifuga, quindi mescolare le cellule per lisarle mediante inversione a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Durante la lisi, lavare due volte 40 microlitri di perle GFP trap tre volte con buffer di lisi fresco, centrifugando le perle a 2.700 × g per due minuti tra un lavaggio e l'altro. Dopo la lisi, chiarificare i lisati mediante centrifugazione a 21.000 × g per 10 minuti.

Trasferire il lisato chiarito di ciascuna delle proteine competitrici su perle GFP trap separate e precedentemente lavate. Lasciare legare le proteine di fusione GFP per due ore, mescolando mediante inversione a quattro gradi Celsius. Lavare le perle GFP trap caricate due volte con buffer di lisi e due volte con tampone di competizione.

Sedimentare le perle nel buffer di legame a 2.700 ×g per due minuti tra un lavaggio e l'altro. Eluire le proteine fuse a GFP aggiungendo 40 microlitri di glicina 0,2 M ed eseguendo pipettaggi su e giù per 30 secondi; sedimentare immediatamente le perle a 21.000 ×g per 60 secondi e trasferire il liquido in un nuovo tubo da centrifuga contenente quattro microlitri di Tris HCl 1 M. Eseguire questo passaggio rapidamente per limitare i danni alla proteina purificata. Analizzare un microlitro di ciascuna proteina purificata mediante western blot e sottoporre a sonda con un anticorpo anti-GFP per determinare il rendimento relativo, utilizzando un sistema di blot quantitativo secondo il protocollo del produttore.

Equalizzare la concentrazione molare delle proteine aggiungendo il buffer per il legame competitivo. Prelevare 90 microlitri dei microsfera GST preparati del rack uno e lavarli tre volte con il buffer di caricamento dei nucleotidi, utilizzando un separatore magnetico per precipitare le microsfere a ogni passaggio. Aspirare il buffer dalle microsfere e aggiungere 100 microlitri di buffer di caricamento dei nucleotidi, a seconda che sia richiesto il caricamento con G-D-P-G-T-P o senza nucleotide.

Per l'esperimento di competizione, aggiungere 12 microlitri di GDP 100 millimolare, 12 microlitri di GTP gamma S 10 millimolare o nessun nucleotide a 60 microlitri di perle GST-RACK1 per i controlli di carico del nucleotide. Dividere le perle rimanenti in tre aliquote da 10 microlitri e aggiungere a ciascun tubo 2 microlitri di GDP 100 millimolare, 2 microlitri di GTP gamma S 10 millimolare o nessun nucleotide. Incubare le sospensioni di perle per 30 minuti a 30 gradi Celsius con agitazione.

Stabilizzare il complesso formato dal nucleotide e dal rack, aggiungendo un equivalente molare di cloruro di magnesio alla miscela sperimentale e alle miscele di controllo per eseguire il saggio di competizione per il legame. Preparare sei provette microcentrifuga, ciascuna contenente 200 microlitri di tampone per il saggio di competizione del legame.

Ogni provetta dovrebbe contenere anche 10 microlitri del rack di nucleotidi caricati, una perla e cinque microlitri del rack. Aggiungere a ogni provetta 0, 1, 2, 0,55, 10 o 20 microlitri del rack contenente la proteina legante A come proteina legante costante e la proteina legante B come proteina legante variabile. Questi volumi presuppongono concentrazioni di stock approssimativamente uguali per le proteine leganti costante e variabile e potrebbero necessitare di essere regolati.

Portare il volume totale della miscela di legame a 235 microlitri aggiungendo il buffer di competizione per il legame. Successivamente, preparare un tubo da microcentrifuga contenente 200 microlitri di buffer di competizione. Aggiungere 10 microlitri di nucleotide sperimentale caricato su rack, una perla e 10 microlitri di proteina di legame A del rack uno. Quindi preparare i tubi di controllo con G-D-P-G-T-P gamma S e senza nucleotide come descritto nel protocollo testuale.

Incubare le provette per due ore, mescolando per inversione a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione. Lavare le perle tre volte con il buffer di legame competitivo. Infine, eluire le proteine legate in 20 microlitri di buffer campione riducente.

Il western blot quantitativo del marcatore GFP di GFP RCC due e GFP Corona in un dominio C-Propeller purificati rivela che la proteina nella banda superiore, GFP RCC due, è 1,4 volte più abbondante rispetto alla banda inferiore e dovrebbe essere diluita per ottenere un rapporto molare uno a uno per l'esperimento di competizione. Un esperimento di controllo dimostra che lo stato di carico del nucleotide di rack uno determina la specificità di legame, titolando volumi crescenti di GFP RCC due contro un volume fisso di GFP Corona in un dominio C-Propeller equimolare e analizzando mediante blot. Le proteine che si legano a rack uno permettono di visualizzare il cambiamento relativo della proteina legata riportando su un grafico le intensità delle bande GFP di entrambi i competitori, e identificando il punto in cui le linee si intersecano, è possibile determinare il volume della proteina di legame variabile all'equilibrio.

Tuttavia, è necessario prestare attenzione per garantire che problemi come l'interazione tra i concorrenti o un eccesso di GTPa esca non compromettano l'esperimento. Un aumento di un concorrente senza la corrispondente riduzione dell'altro, come mostrato qui, indica un problema durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di verificare che esista una relazione reciproca tra l'abbondanza dei partner leganti in competizione.

Esistono diversi problemi che possono alterare i risultati e che possono essere risolti purché vengano identificati mediante l'analisi dei dati.