Name: Confrontando laffinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Scopri come confrontare le affinità di legame delle proteine GTPasi Rho usando saggi competitivi con nucleotidi controllati. Questo metodo permette di analizzare interazioni proteiche specifiche in vitro.

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1. Purificazione di GTPase GST-tagged <ol><li> Cultura una E. coli come BL21 trasformato con pGEX-Rac1 O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm, in 500 ml di media autoinduzione (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2 PO 4, 50 mM NH 4 Cl, 5 Na mM 2 SO 4, 2 MgSO mm 4, 2 mM CaCl 2, 0,5% glicerolo, 0,05% di glucosio, lattosio 0,2%, 5 g Triptone, 2,5 g estratto di lievito, 100 mg / ml ampicillina). </li><li> Batteri Harvest per centrifugazione per 10 minuti a 10.000 xg, 4 ° C. </li><li> Risospendere pellet batterico in 20 ml di reagente di estrazione di proteine, inibitore della proteasi 1x e incubare per 20 min a temperatura ambiente con inversione. </li><li> Chiarire il lisato mediante centrifugazione a 40.000 xg per 30 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di glutatione biglie magnetiche, lavati con PBS (PBS: Na 10 mm 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). </li><li> Incubare per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C. </li><li> Lavare perline proteina-caricato quattro volte con 10 ml di PBS, utilizzando un sorter particella magnetica per precipitare le perle ad ogni passo. </li><li> Perline in 2 ml di PBS e conservare risospendere proteina-caricato a -80 ° C in aliquote di 100 microlitri fino a quando necessario. </li></ol> 2. Espressione di proteine ​​GTPasi binding <ol><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, plasmidi transfettare che codificano la proteina fluorescente verde (GFP) -tagged versioni di ogni proteina-GTPasi legame in un pallone da 75 cm 2 separata di HEK293T come segue. Per la convalida di nucleotide carico, transfect GFP-tagged TrioD1 in un terzo di 75 cm 2 fiasco di HEK293T. <ol><li> Diluire polyethylamine a 1 mg / ml in 100 ml di NaCl 150 mM sterile. </li><li> Aggiungere 27 ml polyethylamine diluito a 223 ml ridotti multimediali siero. </li><li> Aggiungere 12 mg plasmide DNA per 250 microlitri ridotti multimediali siero. </li><li> Incubare ogni provetta per 2 minuti a temperatura ambiente. </li&gt; <li> Unire la polyethylamine e DNA mescola in una singola provetta e agitare per 2 min. </li><li> Incubare per 15-20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sostituire i mezzi di crescita (Dulbecco Modified Eagle media, il 10% di siero bovino fetale, 2 mM di L-glutammina, antibiotici), sul 90% confluenti HEK293T con 5 ml di terreni di coltura fresco. </li><li> Aggiungere la miscela polyethylamine / DNA combinato al pallone e incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 3. Purificazione di proteine ​​GTPasi binding <ol><li> Sciacquare fiaschi di cellule trasfettate in PBS e scarico pallone per 5 minuti, aspirando liquido libero. </li><li> Raschiare le cellule in 500 microlitri di buffer di lisi (50 mM Tris-HCl (pH7.8), 1% Nonidet P-40, 1x inibitore della proteasi) in provetta per microcentrifuga. </li><li> Lisare le cellule miscelazione per inversione a 4 ° C per 30 min. </li><li> Durante lisi, lavare due lotti di 40 microlitri GFP-Trappola perle tre volte con tampone di lisi fresco, perline sedimenta a 2.700 xg per 2 minuti tra un lavaggio. </li><li> Chiarire lisati di centrifugazione a 21.000 xg per 10 min. </li><li> Trasferimento chiarito lisato di ciascuna delle proteine ​​concorrenti per separare lavate perline GFP-trappola e che consentono di proteine ​​GFP-fusione di legarsi per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C. Tenere lisato da cellule GFP-TrioD1 sul ghiaccio. </li><li> Lavare caricate perline GFP-trap due volte in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 e due volte in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 , sedimenta perline a 2.700 xg per 2 minuti tra lavaggi. </li><li> Eluire proteine ​​GFP-fusione con l&#39;aggiunta di 40 microlitri 0,2 M glicina (pH 2,5) e pipettando su e giù per 30 sec. Immediatamente perline sedimenti a 21.000 xg per 60 s e trasferimento di liquidi in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 4 ml 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Fate questo in fretta per limitare i danni alla proteina purificata. </li><li> Analizzare 1 ml di ogni proteina purificata mediante Western blot e sonda con un anticorpo anti-GFP stabilire resa relativa utilizzando un blott quantitativaSistema ing secondo il protocollo del produttore. In alternativa, la determinazione delle concentrazioni di proteine ​​di acido bicinconinico (BCA) assay ma questo introduce errori se le proteine ​​non reagiscono con il dosaggio in modo identico o ci sono proteine ​​contaminanti. </li><li> Uguagliare concentrazione proteica molare con l&#39;aggiunta di 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2. </li></ol> 4. Nucleotide caricamento di GTPase <ol><li> Scongelare un&#39;aliquota di GST-Rac1 biglie magnetiche, previste al punto 1. </li><li> Prendere 90 ml di GST-Rac1 perline e lavare tre volte con 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, EDTA 4 mM, utilizzando una selezionatrice particella magnetica per precipitare le perle ad ogni passo. </li><li> Aspirare tampone da perline e aggiungere 100 ml di 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, EDTA 4 mm. </li><li> A seconda che il PIL, GTP o no nucleotide carico è necessario per l&#39;esperimento della concorrenza, aggiungere 12 ml PIL 100 mm, 12 microlitri gu 10 mManosine 5 &#39;- [γ-tio] trifosfato (GTPγS) o nessuna nucleotide a 60 microlitri GST-Rac1 perline. </li><li> Per i controlli nucleotide-caricamento, dividere i restanti perle in tre aliquote di 10 microlitri e aggiungere 2 ml PIL 100 mm, 2 pl 10 GTPγS mM o no nucleotide ad ogni provetta. </li><li> Incubare miscele tallone per 30 minuti a 30 ° C con agitazione. </li><li> Stabilizzare nucleotide-bound Rac1 per aggiunta di 1 M MgCl 2: 3 microlitri al mix sperimentale (passo 4.4), 0,5 microlitri a ciascuna delle miscele di controllo (passo 4.5). </li></ol> 5. Concorrenza vincolante. <ol><li> Impostare 6 tubi microcentrifuga, ciascuna contenente: 200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 10 microlitri sperimentali perline Rac1 nucleotide-caricati (dal punto 4.7) 5 microlitri proteina Rac1-binding A (proteina di legame costante) </li><li> Per ogni tubo, aggiungere 0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 l-Rac1 binding protein B (proteina di legame variabile). Questi volumi assumono unpproximately uguali concentrazioni di magazzino delle proteine ​​di legame costante e variabile e può essere necessario un aggiustamento. <ol><li> Regolare volumi di proteine ​​leganti A e B se ci sono grandi differenze tra le affinità di legame delle due proteine ​​e questo dovrebbe essere determinati empiricamente attraverso le ripetizioni sperimentali. Portare il volume totale della miscela di legame di 235 ml per aggiunta di 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2. </li></ol></li><li> Impostare una provetta da microcentrifuga contenente: 200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 10 microlitri sperimentali perline Rac1 nucleotide-caricati (dal punto 4.7) 10 microlitri proteina Rac1-binding A (proteina di legame costante) </li><li> Impostare il PIL, GTPγS e senza tubi di controllo nucleotide: 200 microlitri 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2 10 microlitri perline Rac1 controllo caricati al passo 4.5 con il PIL, GTPγS o no nucleotidi e stabilizzato al punto 4.7. 180 microlitri HEK293T GFP-TrioD1 lisato, preparata come al punto 3.6 4 microlitri 1 M MgCl 2 </li><li> Incubare la miscela per 2 ore, mescolando per inversione a 4 ° C. </li><li> Lavare le perline tre volte con 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl 2. </li><li> Eluire proteine ​​legate in 20 microlitri riducenti tampone (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glicerolo, 0,02 mg / ml di blu di bromofenolo, 5% β-mercaptoetanolo). </li></ol> 6. Analisi della concorrenza <ol><li> Risolvere 10 ml di proteina legata (passo 5,6) mediante elettroforesi dodecil solfato di sodio gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) e Western Blot. </li><li> Incubare la membrana a 4 ° CO / N in anticorpo anti-GFP diluito 1/1000 in tampone bloccante diluito a 1x in PBS, 0,1% di Tween-20 per rilevare entrambe le proteine ​​GTPasi legame con tag. </li><li> Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti con PBS, 0,1% Tween-20. </li><li> Incubare la membrana per 30 minuti a RT in DyLight 800 sec-coniugato anti-coniglioanticorpo daria, diluito 1 / 10.000 in tampone bloccante diluito a 1x in PBS, 0,1% di Tween-20. </li><li> Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti con PBS, 0,1% Tween-20. </li><li> Scansione la membrana utilizzando un sistema di imaging a raggi infrarossi, utilizzando il software per misurare l&#39;intensità di banda secondo il protocollo del produttore. </li><li> Tracciare la intensità della banda di ciascuna proteina contro il volume del concorrente variabili (Protein B). </li><li> Dividere il volume di concorrente variabile nel punto in cui le linee si intersecano dal volume di concorrente costante (Proteina A, 5 ml) per determinare il rapporto concorrente che è raggiunto l&#39;equilibrio. </li><li> Per la convalida dello stato di nucleotide-caricamento, membrane sonda per p21-chinasi attivata 1 (PAK1) (un&#39;unità di effetti) e GFP-TrioD1 (un GEF), come descritto nei passaggi 6.1-6.6. </li></ol>

<ol><li>Burridge, K., Rho Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Rac+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">and Rac take center stage.</a> Cell. 116 (2), 167-179 (2004).</li>
<li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+Rho+GTPases+lead+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEF+means+go%3A+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).</li>
<li>Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+Rac1+in+complex+with+the+guanine+nucleotide+exchange+region+of+Tiam1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1.</a> Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).</li>
<li>Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPase+activating+proteins%3A+structural+and+functional+insights+18+years+after+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery.</a> Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).</li>
<li>Del Pozo,, A, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+GTP-Rac+localized+effector+interactions+through+dissociation+of+Rho-GDI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI.</a> Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).</li>
<li>Williamson, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1C+and+RCC2+guide+mesenchymal+migration+by+trafficking+Rac1+and+controlling+GEF+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).</li>
<li>Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+DH-PH+domain+of+Trio+induces+cell+spreading+and+migration+by+regulating+lamellipodia+dynamics+in+a+Rac1-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion.</a> PLoS. 7 (1), e29912(2012).</li>
<li>Self, A. J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intrinsic+nucleotide+exchange+and+GTP+hydrolysis+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates.</a> Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo per confrontare le affinità relative di coppie di piccole proteine leganti la GTPasi. I passaggi chiave sono la preparazione di proteine leganti la GTPasi purificate e il caricamento nucleotidico della GTPasi. L'uso di proteine leganti la GTPasi con lo stesso tag GFP, consente di determinare con precisione le concentrazioni alle quali si legano quantità simili di ciascun concorrente. L'uso della GTPasi ricombinante caricata con nucleotidi consente l'interrogazione delle proprietà di legame della GTPasi in specifiche condizioni di attività. Questo passaggio è anche il più sensibile, in quanto i nucleotidi si idrolizzano e si staccano dalla GTPasi se le condizioni di magnesio non vengono mantenute con precisione.
Nella cellula, il gran numero di proteine leganti la GTPasi combinato con il rapido turnover nucleotidico rende tali percorsi difficili da interpretare. La semplicità di questo metodo nel confrontare solo coppie di proteine leganti e nell'utilizzare condizioni di carico nucleotidico attentamente controllate consente di chiarire le vie di segnalazione. Tuttavia, il maggior punto di forza del protocollo è anche la più grande debolezza in quanto si tratta di una semplificazione della situazione in vivo . I saggi di competizione possono essere utilizzati per costruire un'ipotesi robusta, ma questa dovrebbe poi essere testata nelle cellule mediante esperimenti di knockdown.
Ci sono tre caratteristiche che devono essere considerate quando si selezionano le proteine leganti la GTPasi marcate con GFP da utilizzare nell'esperimento. In primo luogo, le proteine di fusione devono esprimersi bene nelle cellule di mammifero, come HEK293T, poiché i saggi di competizione richiedono una quantità ragionevole di proteine. In secondo luogo, deve essere possibile purificare la proteina ricombinante senza una degradazione significativa e, laddove ciò non sia possibile, dovrebbe essere preso in considerazione il clonaggio di un frammento legante la GTPasi. In terzo luogo, le due proteine leganti la GTPasi devono risolversi l'una dall'altra su SDS-PAGE per consentire l'analisi nella sezione 6.
Ci sono una serie di potenziali avvertimenti all'esperimento che devono essere considerati e possibilmente affrontati:
Possibile denaturazione delle proteine leganti la GTPasi purificate durante la fase di eluizione acida o impedimento sterico da parte del tag GFP. Nelle nostre mani, questi non sono stati un problema, ma devono essere messi alla prova. Le proteine purificate possono essere testate in saggi funzionali 10. Esistono ora kit commerciali per testare l'attività di GEF o GAP senza la necessità di nucleotidi marcati con isotopi. Le proteine sequestranti, per loro natura, proteggono le GTPasi dall'attività di GEF o GAP, quindi possono essere utilizzate come inibitori competitivi nei saggi commerciali di GEF o GAP, come abbiamo fatto nella nostra recente pubblicazione 7. La caratteristica rilevante delle proteine che trasportano la GTPasi è la capacità di legare la GTPasi, e questo può essere facilmente testato in un saggio di pull down. Un approccio alternativo per testare l'integrità proteica applicabile a tutte le proteine leganti consiste nel titolare la proteina eluita da perle GFP-trappola con glicina con la stessa proteina rimossa dalle perle GFP-trappola mediante scissione enzimatica. L'esperimento sarebbe stato analizzato sondando sia la proteina marcata con GFP che quella scissa con un anticorpo contro la proteina stessa. Se la proteina non viene danneggiata dall'eluizione, l'equilibrio dovrebbe essere raggiunto con un rapporto 1:1. Questo approccio indicherebbe anche se la presenza del tag GFP stesso compromette le proprietà di legame della proteina candidata, sebbene ciò richieda la produzione di un costrutto con un sito di scissione enzimatica tra il tag e la proteina legante. Indipendentemente dal fatto che la proteina sia compromessa dal tag o dalla fase di eluizione, il problema potrebbe essere affrontato modificando il protocollo per utilizzare un metodo di purificazione alternativo. Piuttosto che GFP, le proteine leganti potrebbero essere marcate con His, purificate con Ni-NTA e analizzate con un anticorpo contro l'His-tag. La caratteristica importante è che entrambe le proteine leganti devono condividere un tag comune anche se, se necessario, potrebbero essere aggiunti due tag a una proteina, uno per la purificazione e l'altro per il rilevamento.
Il protocollo è progettato per studiare la competizione tra le interazioni con i domini I/II dello switch. Sebbene la maggior parte delle interazioni GTPasi siano mediate da questo motivo, ci sono alcune eccezioni, in particolare le interazioni dei GDI che si legano alla coda del prenile, oltre a oscurare i domini di commutazione. In linea di principio, il protocollo potrebbe essere adattato per utilizzare la GTPasi purificata da cellule di mammifero, in modo che la GTPasi sia prenilata, tuttavia, la presenza di più siti di legame o effetti allosterici complicano l'interpretazione dei dati di legame della competizione. Ulteriori problemi associati a tale modifica sono che i GDI co-purificano con la GTPasi da cellule di mammifero, compromettendo la purezza delle proteine isolate e la natura idrofobica dei gruppi prenilici significa che le GTPasi prenilate sono associate al GDI o alla membrana lipidica e tali fattori dovrebbero essere considerati nell'esperimento.
La quantità di GST-Rac1 utilizzata nel saggio. La proteina legante la GTPasi costante deve essere a una concentrazione maggiore rispetto alla Rac1, altrimenti quando viene aggiunta la concorrente, si legherà semplicemente alla Rac1 libera. Sarà immediatamente ovvio se ciò è accaduto poiché il legame del concorrente, senza una perdita della proteina costante, sarà rilevato più o meno allo stesso modo di quando le due proteine concorrenti si legano l'una all'altra, come mostrato nella Figura 3B. Come controllo aggiuntivo (Fase 5.3), deve essere inclusa una reazione di legame contenente il doppio della quantità di proteina a legame costante e nessuna proteina a legame variabile (Fase 5.3). Se il Rac1 nell'esperimento di titolazione è saturo, il raddoppio della quantità di proteina a legame costante non avrà alcun effetto sull'output. I volumi suggeriti nel protocollo dovrebbero essere appropriati, ma la quantità di Rac1 può essere facilmente ridotta. Se si osserva il legame del concorrente senza la perdita del partner di legame costante, si dovrebbe tentare di ridurre la quantità di Rac1 prima di provare a mappare i siti di legame per evitare la formazione di complessi ternari.
Interazione non specifica delle proteine leganti la GTPasi con la GST o la perlina, nonché specificamente con Rac1. Questo problema si manifesterebbe con il legame residuo della proteina legante la GTPasi costante, anche quando la proteina legante la GTPasi variabile ha raggiunto un plateau ad alta concentrazione. L'identificazione di questo problema sarà facilitata dalla conduzione di esperimenti reciproci in cui le proteine costanti e variabili che legano la GTPasi vengono scambiate. Gli esperimenti reciproci miglioreranno anche notevolmente l'accuratezza della stima del punto di equilibrio, quindi dovrebbero essere sempre inclusi. Nei casi di legame non specifico, le concentrazioni relative alle quali viene raggiunto l'equilibrio possono ancora essere calcolate confrontando l'intensità della banda tra i massimi e i minimi per ciascuna proteina, o misurando l'entità del legame non specifico utilizzando perle GST come esca, piuttosto che GST-Rac1.
I saggi di pull down che utilizzano diverse condizioni di carico nucleotidico devono essere utilizzati per integrare il test di competizione descritto in questo protocollo. Determinare la preferenza nucleotidica dei partner è importante sia per comprendere gli eventi di competizione che per comprendere la via di segnalazione in cui è coinvolta la proteina legante la GTPasi. Nella Figura 2B analizziamo il legame di proteine con preferenza stabilita per la GTPasi caricata con GTP o priva di nucleotidi come mezzo per convalidare il carico nucleotidico. Tuttavia, è sensato studiare l'effetto del carico nucleotidico anche su ciascuno dei concorrenti. Se gli ipotetici concorrenti mostrano preferenze diverse, la competizione darà un contributo minore alla via di segnalazione, e in effetti il turnover nucleotidico è probabilmente il meccanismo che dirige lo scambio delle proteine leganti.

Il citoscheletro di actina che determina la forma, la polarità e le proprietà migratorie delle cellule di mammifero è regolato dalla famiglia Rho delle piccole GTPasi. Le GTPasi della famiglia Rho includono RhoA che stimola la contrazione del citoscheletro, Rac1 che stimola la ramificazione dell'actina e la protrusione della membrana e Cdc42 che ha effetti simili sulla polimerizzazione dell'actina a Rac1 e provoca la formazione di filopodi 1,2. L'attività di segnalazione della GTPasi è determinata dal legame di un nucleotide, che controlla la contrazione e il rilassamento dei loop switch I e switch II che mediano le interazioni proteina-proteina sia con i regolatori che con gli effettori. Le GTPasi legate alla guanosina 5'-trifosfato (GTP) attivano gli effettori a valle, mentre la forma legata alla guanosina 5'-difosfato (GDP) è inattiva. Nella cellula, i cicli di idrolisi del GTP e di scambio nucleotidico consentono un rapido turnover dei segnali della GTPasi necessari per la dinamica del citoscheletro. Il turnover nucleotidico è regolato da tre meccanismi. I fattori di scambio nucleotidico guanina (GEF) stabilizzano la GTPasi libera da nucleotidi, catalizzando lo scambio di GDP per GTP e quindi stimolando l'attività di segnalazione della GTPasi 3,4. Le proteine attivanti la GTPasi (GAP) catalizzano l'idrolisi del GTP in GDP, inibendo così l'attività di segnalazione della GTPasi 5. Molecole sequestranti come il regolatore della condensazione della cromatina 2 (RCC2) e gli inibitori della dissociazione nucleotidica guanina (GDI) oscurano i circuiti di commutazione e, nel caso dei GDI, rimuovono la GTPasi dalla membrana interagendo con la coda di prenile 6,7. Ciascuna delle tre classi di molecole regolatorie interagisce con i loop di commutazione, così come gli effettori a valle e alcuni regolatori del traffico come la coronina-1C 7. Lo scopo di questo protocollo è misurare la competizione per il sito di legame dell'interruttore I/II tra regolatori putativi e molecole di segnalazione a valle. Va notato che i saggi di competizione testano il legame a un sito di legame condiviso, quindi questo protocollo non è adatto per testare le interazioni con altri siti, come il legame dei GDI alla coda di prenile.
La sottigliezza delle differenze di conformazione tra forme attive e inattive, combinata con la natura labile del nucleotide legato, ha reso difficile lo studio degli eventi di legame con GTPasi. Il ruolo del nucleotide legato significa che i saggi di legame convenzionali come l'immunoprecipitazione o la risonanza plasmonica di superficie non sono adatti per l'indagine, poiché il nucleotide non può essere controllato. Questo ostacolo è aggravato dalla sovrapposizione nei siti di legame di GEF, GAP, effettori, molecole sequestranti e molecole di traffico, che rendono difficile interpretare i dati di legame per una singola interazione nel contesto della competizione che si verificherà nella cellula. L'immunoprecipitazione, in particolare, è compromessa dalla competizione tra i partner di legame, poiché in determinate condizioni cellulari, un partner di legame potrebbe essere identificato a spese di tutti gli altri, mentre in altre condizioni, un altro partner potrebbe dominare. La natura dinamica della segnalazione della GTPasi è essenziale per la funzione della GTPasi e deve essere considerata quando si analizzano le relazioni tra le interazioni di legame di diversi regolatori. Infatti, di recente abbiamo descritto un percorso che si basava fortemente sul vincolo competitivo. Abbiamo identificato la coronina-1C come una molecola di traffico che si lega agli anelli di commutazione di GDP-Rac1 7. Nelle aree a bassa attività GEF, il traffico dominerebbe il traffico, rimuovendo il Rac1 da quelle regioni. Tuttavia, quando Rac1 viene consegnato alle regioni della cellula in cui l'attività del GEF è elevata, il GEF supererebbe la coronina-1C, attivando così sia Rac1 che impedendo la rimozione di Rac1 mediata dalla coronina-1C da quell'area. Il modello va oltre, perché l'azione del GEF scambia il PIL vincolato per il GTP, spostando l'equilibrio ancora più lontano dalla coronina-1C. Di conseguenza, l'attività di Rac1 potrebbe essere spiegata interamente in termini di competizione e affinità relativa.
In questo protocollo, descriviamo un metodo per confrontare le affinità relative di diversi partner di legame per piccole GTPasi, utilizzando Rac1 come esempio. Utilizzando un approccio proteico purificato, è possibile mettere insieme una catena di eventi di segnalazione mediante confronto a coppie, in un esperimento in cui il nucleotide legato può essere strettamente controllato.

<table><tbody><tr><td>Bugbuster</td><td>Novagen</td><td>70584-3</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore completo della proteasi</td><td>Roche</td><td>05 056 489 001</td><td></td></tr><tr><td>Perle magnetiche di glutatione</td><td>Pierce</td><td>88821</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, ramificata, media Mw ~25.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>OPIMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino Life</td><td>Technologies</td><td>10270-1-6</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotec</td><td>gta-20</td><td></td></tr><tr><td>GDP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7127</td><td>Altamente instabile. Aliquotare e conservare a -80 immediatamente dopo la ricostituzione</td></tr><tr><td>GTP&gamma; S</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8634</td><td>Altamente instabile. Aliquotare e conservare a -80 immediatamente dopo la ricostituzione</td></tr><tr><td>Tampone bloccante</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6429</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Living Colors</td><td>632592</td><td>Utilizzare a 1/1000 di diluizione</td></tr><tr><td>DyLight 800 coniugato capra anti-coniglio anticorpo</td><td>secondario Fisher Scientific 10733944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo PAK1</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2602S</td><td>Utilizzo a diluizione 1/1000</td></tr> Sistema di <tr><td>imaging a infrarossi Odyssey SA</td><td>Li-cor</td><td>9260-11PC</td><td></td></tr></tbody></table>

confrontando l&#39;affinità delle proteine-gtpasi legame con saggi concorso

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In questo protocollo dimostriamo un metodo per confrontare la competizione tra le proteine leganti la GTPasi. Un tale approccio è importante per determinare le capacità di legame delle GTPasi per due motivi: il fatto che tutte le interazioni coinvolgano la stessa faccia delle GTPasi significa che gli eventi di legame devono essere considerati nel contesto dei concorrenti, e il fatto che il nucleotide legato debba anche essere controllato significa che gli approcci convenzionali come l'immunoprecipitazione non sono adatti per la biochimica delle GTPasi. Il test si basa sull'uso di proteine purificate. Il Rac1 purificato immobilizzato su perline viene utilizzato come proteina esca e può essere caricato con GDP, una versione non idrolizzabile di GTP o lasciato libero da nucleotidi, in modo da poter controllare lo stadio di segnalazione da studiare. Le proteine leganti da studiare vengono purificate da cellule di mammifero, per consentire il corretto ripiegamento, mediante un tag GFP. L'uso dello stesso tag su entrambe le proteine è importante perché non solo consente una rapida purificazione ed eluizione, ma consente anche il rilevamento di entrambi i concorrenti con lo stesso anticorpo durante l'eluizione. Ciò significa che le quantità relative delle due proteine legate possono essere determinate con precisione.

Questo protocollo è progettato per calcolare le relative affinità di legame per i partner Rac1, senza la necessità di conoscere la precisa concentrazione dei concorrenti (Figura 1). Determinazione della concentrazione proteica introduce errori e quando si considera la concorrenza tra le molecole in un percorso di segnalazione non è necessaria. Tuttavia, è importante sapere che i due concorrenti hanno la stessa concentrazione molare nelle soluzioni madre a consentire rapporti semplici da calcolare quando si aggiungono volumi diversi per il saggio. 40 ml di perline GFP-trap hanno una capacità di legame di ~ 300 pmol così un confluente 75 centimetri 2 fiaschi di altamente cellule che esprimono saturerà le perline, con il risultato che i preparativi delle due diverse proteine ​​di legame saranno simili prima della regolazione (figura 2A). Se una delle proteine ​​esprime male, questo problema può essere superato purificando quella proteina da più di un pallone di cellule. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Il legame di maggior effettori GTPasi e regolatori dipende dal nucleotide-caricamento della GTPasi esca, quindi è importante verificare se il carico ha avuto successo. Caricamento in corso può essere verificata precipitando proteine ​​di legame conosciute da lisati cellulari. Proteine ​​effettrici, quali PAK1 legano a GTP-Rac1 e possono essere facilmente precipitati da lisati e rilevati mediante Western blotting 8 (Figura 2B). GEFs legano preferenzialmente al nucleotide-liberi GTPasi per stabilizzare lo stato di transizione. Come GEFs sono di bassa abbondanza, solitamente inattivo e spesso asciugare bene male, è meglio iperespressione di un GEF o GEF frammento di prova GTPasica senza nucleotide. Usiamo spesso la prima omologia Dbl di Trio, espresso come una fusione GFP (GFP-TrioD1 9) (Figura 2B), ma qualsiasi GEF avrebbe funzionato. Le proteine ​​che si legano al GTPasi PIL-caricati sono più rari. Recentemente abbiamo riportato RCC2 come una di queste proteine ​​7, o PIL di carico può essere convalidato semplicemente come binding né alla GEF né effettrici. L&#39;uscita dal esperimento sarà una macchia occidentale raffigurante i due partner di legame GFP-tagged legati alla GTPasi. Utilizzando un singolo anticorpo per rilevare entrambe le proteine, le concentrazioni alle quali simili quantità di entrambi i concorrenti legano può essere determinato e quindi le relative affinità presupposta. In questa competizione esempio, tra il dominio propulsore della proteina Rac1-tratta, Coronin-1C (Rac1-binding protein A), e la proteina Rac1-sequestro, RCC2 (Rac1-binding protein B), è dimostrato (Figura 3A). Utilizzando un volume costante di Coronin-1C elica (5 ml), e l&#39;aggiunta di crescenti volumi di RCC2, possiamo vedere dalla GFP macchia che l&#39;equilibrio è raggiunto a 1,25-2,5 ml di RCC2 (asterisco), dimostrando che ha una forte RCC2 affinità per Rac1 di Coronin-1C. Misurando l&#39;intensità delle bande utilizzando Western blotting quantitativa, e riportando i valori medi per ogni competitoR, il punto di equilibrio può essere calcolata con precisione identificando i volumi in cui le curve si intersecano (Figura 3B). Uno dei possibili ostacoli ad un dosaggio competere con successo è se il partner di legame si legano l&#39;uno all&#39;altro così come legame Rac1. Nella Figura 3A + B dimostriamo concorrenza tra RCC2 e il dominio propulsore di Coronin-1C, piuttosto che full-length Coronin-1C. La ragione per usare la Coronin troncato è che Coronin-1C si lega anche RCC2 attraverso il dominio di coda. Quando full-length Coronin-1C è titolato con RCC2, legame di entrambe le proteine ​​viene rilevato, a causa della formazione del complesso ternario, piuttosto che la concorrenza (Figura 3C). Se la concorrenza è in corso, legame di una proteina aumenta mentre l&#39;altra diminuisce, e totale legato GFP-fusione rimarrà costante. Nei casi in cui un complesso ternario forma è necessario troncare una delle proteine ​​GTPasi vincolanti, talché la competmodifiche ai contenuti interagire non più. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig1.jpg" /> Figura 1. Flusso di lavoro. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per determinare l&#39;affinità delle proteine ​​GTPasi legame con saggi di concorrenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig2.jpg" /> Figura 2. La convalida di proteine ​​purificate. (A) purificato GFP-tagged proteine ​​analizzate mediante Western blot vincolante, sondando con anti-GFP per determinare la resa relativa delle due proteine ​​Rac1. Questo tipo di equalizzazione durante l&#39;esperimento permette la concentrazione delle due proteine ​​di essere regolata in modo che corrispondano nell&#39;esperimento vincolante. (B) GDP, GTPγS e non nucleotide-caricato GST-Rac1 è stata incubata con lisato da HEK293T esprimono GFP-TrioD1 e proteine ​​rilevate tracciando per PAK1 endogena o sovraespresso GFP-TrioD1 legate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53254/53254fig3.jpg" /> Figura 3. Western blot di proteine ​​relativo vincolante. Uscite esempio da saggi di concorrenza vincolante. (A) GDP-caricato Rac1 è stato mescolato con 5 microlitri GFP-Coronin-1C dominio elica e volumi crescenti di GFP-RCC2 stati titolato in. Per Western blotting proteine ​​legate per GFP, problemi con rilevamento differenziale delle due proteine ​​vengono evitati e il segnale GFP riporta il rapporto molare tra i due proteine ​​di fusione. Gli asterischi indicano i rapporti di concorrenza in eithelato r il punto di equilibrio. (B) Banda intensità rilegati proteine ​​GFP fusione di tre esperimenti indipendenti sono stati misurati mediante Western blotting quantitativa, utilizzando fluoroforo-coniugato anticorpi secondari e le medie complottato per calcolare la quantità di RCC2 necessaria per raggiungere l&#39;equilibrio. (C ) Esempio di output da un esperimento in cui proteine ​​Rac1 vincolanti legano fra loro e formano un complesso ternario, invece di competere. PIL-caricato Rac1 è stato mescolato con 5 microlitri GFP-RCC2 e volumi crescenti di GFP-Coronin-1C full-length sono stati titolati in. L&#39;aumento del limite GFP-Coronin-1C senza perdita di limite GFP-RCC2 indica ternario formazione complessa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig3large.jpg" target="_blank">Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo confronta le affinità relative dei partner di legame per le GTPasi della famiglia Rho, incluso Rac1. In vivo, le proteine leganti Rac1 competono per una singola interfaccia di legame, la cui conformazione è dettata da un nucleotide legato. Il nucleotide è importante e difficile da controllare sperimentalmente, a causa dell'alto tasso di idrolisi.

Confrontando l&#39;affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare le affinità relative dei partner di legame proteici per le GTPasi della famiglia Row in condizioni di carico del nucleotide attentamente controllate. Questo viene ottenuto innanzitutto purificando i presunti partner di legame competitivi, ciascuno marcato con lo stesso tag, ad esempio la proteina verde fluorescente o GFP. Il secondo passaggio consiste nella purificazione della GTPA di interesse.Ad esempio, RAC uno viene caricato con il nucleotide appropriato per raggiungere lo stato di segnalazione GTPA desiderato. Successivamente, il GTPA caricato con nucleotide viene incubato con una quantità fissa di un competitore di legame e quantità crescenti dell'altro competitore di legame, al fine di ottenere una curva di legame di titolazione. L'ultimo passaggio consiste nel risolvere le proteine legate alla GTpasi immobilizzata mediante blotting western e sondare la membrana per il marcatore GFP condiviso tra i due partner di legame.In definitiva, il Western blot viene utilizzato per identificare le concentrazioni relative alle quali vengono catturate quantità simili di ciascun partner di legame marcato con GFP dalla GTPasi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la co-precipitazione, è che le proprietà di legame proteico della GTPasi sono determinate dal nucleotide legato all'interno della cellula. Il nucleotide legato è labile, rendendo difficile l'interpretazione dei dati sul legame proteico.Iniziare questa procedura con la purificazione della proteina G tpa marcatra con GST e con l'espressione delle proteine che legano gtpa, come descritto nel protocollo testuale. Lavare i flaconi delle cellule trasfettate con soluzione salina fosfato tampone o PBS e lasciare defluire il flacone per cinque minuti. Aspirare il liquido in eccesso, quindi raschiare le cellule in 500 microlitri di buffer di lisi in un tubo microcentrifuga, quindi mescolare le cellule per lisarle mediante inversione a quattro gradi Celsius per 30 minuti.Durante la lisi, lavare due volte 40 microlitri di perle GFP trap tre volte con buffer di lisi fresco, centrifugando le perle a 2.700 × g per due minuti tra un lavaggio e l'altro. Dopo la lisi, chiarificare i lisati mediante centrifugazione a 21.000 × g per 10 minuti.Trasferire il lisato chiarito di ciascuna delle proteine competitrici su perle GFP trap separate e precedentemente lavate. Lasciare legare le proteine di fusione GFP per due ore, mescolando mediante inversione a quattro gradi Celsius. Lavare le perle GFP trap caricate due volte con buffer di lisi e due volte con tampone di competizione.Sedimentare le perle nel buffer di legame a 2.700 ×g per due minuti tra un lavaggio e l'altro. Eluire le proteine fuse a GFP aggiungendo 40 microlitri di glicina 0,2 M ed eseguendo pipettaggi su e giù per 30 secondi; sedimentare immediatamente le perle a 21.000 ×g per 60 secondi e trasferire il liquido in un nuovo tubo da centrifuga contenente quattro microlitri di Tris HCl 1 M. Eseguire questo passaggio rapidamente per limitare i danni alla proteina purificata. Analizzare un microlitro di ciascuna proteina purificata mediante western blot e sottoporre a sonda con un anticorpo anti-GFP per determinare il rendimento relativo, utilizzando un sistema di blot quantitativo secondo il protocollo del produttore.Equalizzare la concentrazione molare delle proteine aggiungendo il buffer per il legame competitivo. Prelevare 90 microlitri dei microsfera GST preparati del rack uno e lavarli tre volte con il buffer di caricamento dei nucleotidi, utilizzando un separatore magnetico per precipitare le microsfere a ogni passaggio. Aspirare il buffer dalle microsfere e aggiungere 100 microlitri di buffer di caricamento dei nucleotidi, a seconda che sia richiesto il caricamento con G-D-P-G-T-P o senza nucleotide.Per l'esperimento di competizione, aggiungere 12 microlitri di GDP 100 millimolare, 12 microlitri di GTP gamma S 10 millimolare o nessun nucleotide a 60 microlitri di perle GST-RACK1 per i controlli di carico del nucleotide. Dividere le perle rimanenti in tre aliquote da 10 microlitri e aggiungere a ciascun tubo 2 microlitri di GDP 100 millimolare, 2 microlitri di GTP gamma S 10 millimolare o nessun nucleotide. Incubare le sospensioni di perle per 30 minuti a 30 gradi Celsius con agitazione.Stabilizzare il complesso formato dal nucleotide e dal rack, aggiungendo un equivalente molare di cloruro di magnesio alla miscela sperimentale e alle miscele di controllo per eseguire il saggio di competizione per il legame. Preparare sei provette microcentrifuga, ciascuna contenente 200 microlitri di tampone per il saggio di competizione del legame.Ogni provetta dovrebbe contenere anche 10 microlitri del rack di nucleotidi caricati, una perla e cinque microlitri del rack. Aggiungere a ogni provetta 0, 1, 2, 0,55, 10 o 20 microlitri del rack contenente la proteina legante A come proteina legante costante e la proteina legante B come proteina legante variabile. Questi volumi presuppongono concentrazioni di stock approssimativamente uguali per le proteine leganti costante e variabile e potrebbero necessitare di essere regolati.Portare il volume totale della miscela di legame a 235 microlitri aggiungendo il buffer di competizione per il legame. Successivamente, preparare un tubo da microcentrifuga contenente 200 microlitri di buffer di competizione. Aggiungere 10 microlitri di nucleotide sperimentale caricato su rack, una perla e 10 microlitri di proteina di legame A del rack uno. Quindi preparare i tubi di controllo con G-D-P-G-T-P gamma S e senza nucleotide come descritto nel protocollo testuale.Incubare le provette per due ore, mescolando per inversione a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione. Lavare le perle tre volte con il buffer di legame competitivo. Infine, eluire le proteine legate in 20 microlitri di buffer campione riducente.Il western blot quantitativo del marcatore GFP di GFP RCC due e GFP Corona in un dominio C-Propeller purificati rivela che la proteina nella banda superiore, GFP RCC due, è 1,4 volte più abbondante rispetto alla banda inferiore e dovrebbe essere diluita per ottenere un rapporto molare uno a uno per l'esperimento di competizione. Un esperimento di controllo dimostra che lo stato di carico del nucleotide di rack uno determina la specificità di legame, titolando volumi crescenti di GFP RCC due contro un volume fisso di GFP Corona in un dominio C-Propeller equimolare e analizzando mediante blot. Le proteine che si legano a rack uno permettono di visualizzare il cambiamento relativo della proteina legata riportando su un grafico le intensità delle bande GFP di entrambi i competitori, e identificando il punto in cui le linee si intersecano, è possibile determinare il volume della proteina di legame variabile all'equilibrio.Tuttavia, è necessario prestare attenzione per garantire che problemi come l'interazione tra i concorrenti o un eccesso di GTPa esca non compromettano l'esperimento. Un aumento di un concorrente senza la corrispondente riduzione dell'altro, come mostrato qui, indica un problema durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di verificare che esista una relazione reciproca tra l'abbondanza dei partner leganti in competizione.Esistono diversi problemi che possono alterare i risultati e che possono essere risolti purché vengano identificati mediante l'analisi dei dati.

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Questo protocollo utilizza un pull down di analisi per determinare i livelli di attivo GTPasi RhoC all'interno delle cellule.

RhoC GTPasi attivazione di analisi

Il metodo qui presentato descrive un saggio per seguire l'attivazione di specifici RhoA PIL / GTP Fattori di cambio (GEFs) in cellule coltivate facendo uso di una proteina di fusione GST RhoA mutante che ha un'elevata affinità per GEFs attivati. GEFs vengono precipitati da lisati cellulari, rilevati da Western blotting e quantificato mediante densitometria.

Affinità Precipitazioni di Active Rho-GEFs Utilizzo di un GST-tagged Mutant proteina Rho (GST-RhoA (G17A)) da lisati di cellule epiteliali

Questo video mostra un test di competizione per studiare i partner proteici leganti GTPasi. Utilizzando la proteina GTPasi legata ai nucleotidi immobilizzata su sfere magnetiche, il legame competitivo tra due partner proteici interagenti per lo stesso sito di legame sulla GTPasi può essere studiato per valutare le affinità di legame dei partner proteici.

Saggio di legame della competizione per studiare i partner proteici leganti la GTPasi in competizione

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

La fosforilazione delle proteine è una caratteristica centrale del modo in cui le cellule interpretano e rispondono alle informazioni nel loro ambiente extracellulare. Qui, presentiamo un protocollo di screening ad alto rendimento che utilizza chinasi purificate da cellule di mammifero per identificare rapidamente le chinasi che fosforilano uno o più substrati di interesse.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

Il legame di guanosina trifosfato (GTP) è uno degli eventi più iniziali nell'attivazione del GCR-Receptor (GPCR). Questo protocollo descrive come caratterizzare farmacologicamente interazioni specifiche GPCR-ligand monitorando il legame dell'analogo GTP radio-etichettato, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) Risposta a un ligando di interesse.

Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

Questo protocollo descrive un metodo per testare la capacità di una proteina a co-sedimentare con l'actina filamentosa (F-actina) e, se si osserva il legame, per misurare l'affinità dell'interazione.

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

Qui descriviamo un protocollo per studiare la prenilazione e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-caricamento di Rho GTPasi. Questo protocollo è costituito da due metodi dettagliati, vale a dire del kit membrana frazionamento e un GTPase-collegata dell'immunosorbente. Il protocollo può essere utilizzato per misurare la prenilazione e GTP caricamento di diverse altre piccole GTPasi.

Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

Un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) è stato adattato allo screening semi-alto flusso di inibitori della miosina. Questo saggio cinetico viene eseguito in un formato a microplacca 384 pozzetti con volumi di reazione totali di soli 20 l per pozzo. La piattaforma dovrebbe essere applicabile praticamente a qualsiasi enzima che produce ADP.

Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

Dato che i GPCR sono interessanti obiettivi drogabili, lo screening dei ligandi GPCR è quindi indispensabile per l'identificazione dei composti di piombo e per gli studi di deorfanotrizzazione. A fronte di questi sforzi, descriviamo PRESTO-Tango, una piattaforma di risorse open source utilizzata per la profilazione simultanea del reclutamento transitorio di z-arrestin2 a circa 300 GPCR utilizzando un test reporter basato su TEV.

Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

Questo protocollo descrive l'uso di biosensori basati su BRET per la misurazione in tempo reale dell'attivazione della proteina G nelle cellule HEK293 viventi dopo stimolazione del ligando del recettore accoppiato alla proteina G. Qui, il recettore β2-adrenergico e il recettore dei cannabinoidi di tipo 1 servono come esempi per dimostrare l'efficienza dei sensori per diversi sottotipi di proteine G e in vari GPCR.

Biosensori a base di proteine G basati su BRET per la misurazione dell'attività del recettore accoppiato a proteine G in cellule vive

Scopri come confrontare le affinità di legame delle proteine GTPasi Rho usando saggi competitivi con nucleotidi controllati. Questo metodo permette di analizzare interazioni proteiche specifiche in vitro.

Confrontando l'affinità delle proteine-GTPasi legame con saggi Concorso

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