Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le chinasi che fosforilano un substrato di interesse mediante metodi di screening ad alto rendimento. Questo viene ottenuto innanzitutto trasfettando cellule con plasmidi che esprimono chinasi FU come glutathione S-transferasi o GST. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire un'analisi di pulldown della chinasi GST.

Successivamente, i campioni vengono caricati sui gel, che vengono quindi eseguiti e colorati con il colorante kumasi brilliant blue. L'ultimo passaggio consiste nell'essiccare i gel ed esporli a una pellicola di autoradiografia. Sviluppando e interpretando infine le pellicole ottenute, è possibile identificare coppie chinasi-substrato, poiché ogni corsia rappresenta un saggio di chinasi distinto.

I metodi esistenti per identificare una chinasi per un substrato fosforilato noto includono l'utilizzo di approcci bioinformatici per cercare un sito consenso nel substrato, il rilevamento di complessi tra chinasi e substrati mediante tecniche biochimiche e un approccio basato su tentativi ed errori, e la ricerca di substrati consenso in base alla loro funzione biologica nota. Questi approcci sono lunghi e non sempre portano al successo. Il nostro metodo permette l'identificazione rapida di coppie chinasi-substrato sulla base degli esiti funzionali.

Quando abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo, temevamo che la specificità in vitro fosse insufficiente. In realtà, la specificità del substrato è eccellente e spesso riscontriamo che soltanto le chinasi appartenenti alla stessa famiglia sono in grado di fosforilare un determinato substrato nell'analisi. Ciò è particolarmente evidente quando eseguiamo analisi multiplex utilizzando più substrati in ciascun esperimento, dimostrando che la procedura sarà eseguita da Courtney, un'assistente del mio laboratorio. Iniziare la procedura preparando reagenti, piastre e cellule come descritto nel protocollo testuale.

Se le piastre contenenti i plasmidi della chinasi sono state congelate, scongelarle a temperatura ambiente e centrifugare a 1900 volte G per tre minuti per raccogliere qualsiasi umidità sul fondo dei pozzetti. Mescolare 8,6 millilitri di mezzo con siero ridotto con 312,7 microlitri di reagente di trasfezione a base lipidica e lasciare riposare la miscela per cinque minuti in ciascun pozzetto. Della piastra a 96 pozzetti contenente i plasmidi della chinasi, aggiungere 10 microlitri di mezzo con siero ridotto.

Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di una cassetta per piccoli volumi, aggiungere quindi 10 microlitri di mix del reagente per la trasfezione in mezzo con siero ridotto per ogni pozzetto, impiegando un distributore automatico di liquidi munito di una cassetta per piccoli volumi, e lasciare riposare la piastra per 20-45 minuti. Successivamente, risospendere 2 93 T cells a 0,75 milioni di cellule per millilitro in 80 millilitri di mezzo completo modificato delcos, noto come DMEM, distribuendo 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di una cassetta per volumi standard, verificare al microscopio una distribuzione uniforme delle cellule nei pozzetti prima di reinserire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Per iniziare l'esperimento di immunoprecipitazione con GST kinase. Preparare una soluzione di vanadato 4 millimolare mescolando 60 microlitri di vanadato di sodio 0,2 molare con 540 microlitri di acqua; in un secondo tubo, mescolare 2,7 microlitri di perossido al 30% e 1,4 millilitri di soluzione salina fosfato o PBS. Unire le due soluzioni e lasciare riposare la miscela per 15 minuti prima dell'uso.

Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere due microlitri di cloruro di calcio 0,25 M in ogni pozzetto, seguiti da 2,5 microlitri della soluzione di datazione provata. Incubare ogni piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti, quindi posizionarla sul ghiaccio, mantenendo le piastre sul ghiaccio. Rimuovere il mezzo da ogni pozzetto, utilizzando immediatamente il vuoto con 50 microlitri per pozzetto di tampone di lisi freddo.

Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato della cassetta standard, lasciare la piastra in ghiaccio per 30 minuti. Dopo aver centrifugato le piastre a 1900 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius, raschiare le cellule da ogni pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e trasferire tutti i contenuti in vbo opportunamente etichettati. Per le piastre a 96 pozzetti, centrifugare a 1900 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius; durante la centrifugazione, aggiungere alle piastre rivestite con glutathione 100 µL per pozzetto di buffer di lisi freddo di ghiaccio.

Come operazione di risciacquo, mantenere le piastre sul ghiaccio. Dopo la centrifugazione delle piastre a fondo V, capovolgere le piastre contenenti glutathione sopra un lavello per eliminare il buffer di lisi e asciugare delicatamente su un tovagliolo di carta. Trasferire il buffer di lisi dalle piastre a fondo V alle piastre contenenti glutathione inclinando la piastra e utilizzando una pipetta multicanale, avendo cura di non disturbare il pellet sul fondo.

Quindi coprire le piastre e lasciarle sul ghiaccio per almeno due ore. Poco prima della fine dei due ore di legame, preparare una postazione per lavori con radioattività, assicurandosi che siano state adottate le necessarie precauzioni di sicurezza per manipolazioni con sostanze radioattive. Impostare il forno di ibridazione a 30 gradi Celsius.

Rovesciare le piastre con glutathione su un lavello per eliminare il buffer di lisi e tamponare con un tovagliolo di carta. Risciacquare i pozzetti tre volte con 100 microlitri di buffer di lisi senza PMSF. Non lasciare asciugare i pozzetti.

Tenerli nella soluzione di lavaggio fino al momento dell'utilizzo. Successivamente, preparare 55 millilitri di un buffer chinasico 1X o un x kb come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere 50 microlitri di x kb 1X in ciascun pozzetto della piastra utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di cassetta a volume standard.

Quindi preparare la soluzione A creando una soluzione contenente il substrato di interesse e la proteina basica della mielina o MVP, come specificato nel protocollo testuale, una alla volta. Capovolgere le piastre su un lavandino per rimuovere la soluzione di lavaggio XKB e asciugarle su un tovagliolo di carta, quindi aggiungere immediatamente 30 microlitri della soluzione A utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di cassetta per volumi ridotti. Mantenere le piastre sul ghiaccio.

Successivamente, preparare la soluzione B nell'area di lavoro con sostanze radioattive come descritto nel protocollo testuale, utilizzando 20 microlitri di soluzione B per pozzetto. Utilizzando una pipetta ripetitrice, che facilita la miscelazione grazie alla forza di espulsione, coprire e incubare la piastra in un forno di ibridazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Trascorsi 30 minuti, trasferire nuovamente le piastre sul ghiaccio.

Quindi aggiungere 50 microlitri di due x tampone di lisi in sodio eccle solfato o SDS a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Tutti i lavori in questa sezione devono essere eseguiti in un'area designata per l'attività radioattiva. Accendere il forno di ibridazione e impostarlo a 85 gradi Celsius.

Una volta raggiunta la temperatura, trasferire le piastre nel forno e incubare per 10 minuti per denaturare i campioni. Successivamente, caricare gel preformati da 26 pozzetti con 15 microlitri di ogni reazione.

Utilizzando una pipetta multicanale per riempire contemporaneamente diverse pozzette, è necessario prestare attenzione affinché tutte le punte siano allineate correttamente con le rispettive pozzette. Prima di aggiungere i campioni, far correre il gel a 150 volt. Non permettere alla linea blu di uscire dal fondo del gel, poiché contiene l'ATP non incorporato. Smontare quindi i gel e rimuovere l'ATP non incorporato, poiché potrebbe scurire l'esposizione del gel sui film.

Posizionare i gel in contenitori etichettati e coprirli con il colorante kumasi per 15 minuti. Successivamente, rimuovere il colorante kumasi. Sciacquare brevemente i gel con acqua e aggiungere la soluzione di decolorazione.

Trattenere i gel fino a quando le proteine sono chiaramente visibili. Per ogni campione, devono essere visibili una banda per MVP e una banda per il substrato. Per asciugare i gel, tagliare un foglio grande di carta filtrante e posizionarlo sull'essiccatore.

Inumidire un foglio di carta cellophane con acqua distillata fino a quando risulta liscio e privo di pieghe, quindi posizionarlo sopra il foglio di carta. Disporre i gel sopra il foglio di cellophane, annotando l'ordine dei gel. Inumidire un secondo foglio di cellophane e posizionarlo sopra i gel.

Ruotare per eliminare tutte le bolle e ottenere una superficie uniforme. Chiudere la linguetta, attivare il vuoto e asciugare i gel per tre ore a 80 gradi Celsius. Una volta che i gel sono asciutti, esporli a una pellicola per autoradiografia a doppia emulsione utilizzando uno schermo per intensificare il segnale.

Avvolgere la cassetta con pellicola trasparente o un sacchetto di plastica e sigillare con nastro adesivo per proteggerla dalla formazione di brina prima di conservarla nella cassetta a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere la cassetta dal congelatore e lasciarla scongelare a temperatura ambiente. Sviluppare la pellicola in una stanza oscura utilizzando un processore per pellicole seguendo le istruzioni del produttore indicate.

Di seguito sono riportati risultati rappresentativi di un'analisi in cui sono state testate 180 chinasi utilizzando un substrato peptidico marcate con GST corrispondente agli amminoacidi da 268 a 283 del coattivatore trascrizionale regolato da kreb, noto come CRTC2, nonché il classico substrato per saggio chinasi nota come proteina basica della mielina (MBP). Le chinasi MARK2 e la chinasi strettamente correlata MARK3 sono risultate attive. Il peptide CRTC2 e MBP sono inclusi come controllo interno in tutti i saggi poiché contengono numerosi residui fosforilabili e migrano a 18 chilodalton, in prossimità del fondo del gel.

Questo consente un'interpretazione della specificità. Alcune chinasi fosforilano in modo robusto un substrato e la MVP. È importante notare che le pozzette contenenti solo GST purificano sempre una certa attività chinasi endogena.

Pertanto, nell'assay è sempre presente una fosforilazione di fondo. Sebbene ciò non escluda che la fosforilazione del substrato sia reale, suggerisce che in condizioni in vitro la chinasi potrebbe essere meno selettiva. È particolarmente utile includere multipli substrati con diversi pesi molecolari per trarre conclusioni riguardo alla specificità della chinasi verso i substrati.

Poiché lo schermo è in vitro e ulteriori livelli di complessità si verificano in vivo, una chinasi candidata deve essere convalidata nelle cellule. Ad esempio, una chinasi candidata potrebbe avere la capacità di fosforilare un substrato in vitro, ma non essere espressa nello stesso tipo cellulare o nelle stesse sottocellule di un compartimento in cui è presente il substrato. Questo viene tipicamente effettuato mediante silenziamento mediato da RNAi del candidato.

È inoltre possibile eseguire uno schermo secondario utilizzando un mutante non fosforilabile del substrato per confermare la specificità.