Name: Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri come identificare le coppie chinasi-substrato mediante screening ad alto rendimento utilizzando chinasi purificate da cellule mammifero. Questo metodo consente l'analisi rapida dell'attività chinasica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NSERC concessione 386634. Vorremmo ringraziare i membri della Screaton Lab per le discussioni utili.

1. Preparazione dei reagenti, piatti, e celle <ol><li> Rendere 500 ml di tampone di lisi: 25 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 mM beta-glicerofosfato, glicerolo 5%. Conservare a 4 ° C. Immediatamente prima dell&#39;uso, aggiungere 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF), e 1 mM vanadato di sodio. Dopo questo passo, PMSF non è richiesto in ogni buffer di risciacquo. </li><li> Fai 20 ml di 10x Kinase Buffer: Tris 200 mM pH 7.5, 50 mM beta-glicerofosfato (FW 216), 2 mM vanadato di sodio. Aliquota in 1 ml provette e conservare a -20 ° C. Immediatamente prima dell&#39;uso, aggiungere 5 mM DTT. </li><li> Fai 20 ml di 10x tampone di M-ATP: 300 micron adenosina trifosfato (ATP), 66 mM MgCl 2, 33 MnCl mM 2. Aliquotare in 1 ml provette e conservare a -20 ° C. </li><li> Rendere 100 ml di 2x sodio dodecil solfato (SDS) tampone di lisi: 1,5 g base di TRIS, 20 ml di glicerolo, 30 ml di H 2 O. Sciogliere e regolare il pH a 6,8 con HCl. Aggiungere 40ml 10% SDS, regolare il volume a 100 ml. Aggiungere 25 mg di blu di bromofenolo. </li><li> Spot 4 ml di 25 ng / ml plasmide di espressione di mammifero che codificano un GST-chinasi 14 per bene in gruppi di 96 pozzetti e targhette di conseguenza. Seal e congelare le piastre a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> 1-2 giorni prima della trasfezione, le cellule cultura HEK293T in Modified Eagle Medium completo di Dulbecco (DMEM) + 10% siero fetale bovino (FBS) e antibiotici in un 37 ° C incubatore integrato con CO 2 (finale 5%). Passaggio con tripsina e non consentono lo stock di diventare&gt; 80% confluenti durante l&#39;espansione. Un minimo di 6 x 10 7 cellule sono necessari per lo schermo (circa 3 x 15 cm piatti di cellule HEK293T al 80% confluenza). </li></ol> 2. Trasfezione Nota: Vedere la Figura 1 per un diagramma di flusso intero protocollo. <ol><li> Se sono stati congelati piastre contenenti plasmidi chinasi, scongelare a temperatura ambiente unnd centrifugare a 1900 xg per 3 minuti per raccogliere l&#39;umidità al fondo dei pozzetti. </li><li> Mescolare 8,6 ml di mezzo di siero ridotta (ad esempio, OPTI-MEM) con 312,7 ml di base lipidica trasfezione reagente. Lasciate riposare per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzo di siero ridotto a ciascun pozzetto usando un dosatore automatico provvisto di un piccolo volume di cassette. </li><li> Aggiungere 10 ml per pozzetto di riduzione a medio siero / trasfezione miscela reagente dal punto 2.2 utilizzando un dosatore automatico provvisto di un piccolo vassoio di volume. Lasciate riposare per 20 a 45 minuti. </li><li> Risospendere le cellule 293T a 7,5 x 10 5 cellule / ml a 80 ml ​​di DMEM completo. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare (cioè 7,5 x 10 4 cellule) per pozzetto utilizzando un dosatore automatico munito di una cassetta volume standard. </li><li> Controllare pozzi al microscopio per la distribuzione cellulare uniforme e tornare a incubatore per 24 ore. </li></ol> Pulldown 3. GST-chinasi <ol><li> Fai fresh: 4 mm soluzione pervanadate mescolando 60 ml di 0,2 M vanadato di sodio con 540 ml di H 2 O. In una seconda miscela tubo 2,7 ml di perossido di 30% e 1,4 ml di PBS. Aggiungere le due soluzioni insieme e lasciate riposare per 15 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Usando una pipetta multicanale (non utilizzare un distributore automatico di liquido in quanto crea troppa turbolenza nel pozzo) dispensare 2 ml di 0,25 M CaCl 2 in ogni pozzetto, seguiti da 2,5 ml di pervanadate preparato al punto 3.1. Incubare ogni piastra a 37 ° C per 10 min e poi posto su ghiaccio. </li><li> Preparare 35 ml di tampone di lisi con l&#39;aggiunta di DTT, PMSF e vanadato di sodio come indicato nella Sezione 1 (Preparazione dei reagenti). </li><li> Mantenere le piastre in ghiaccio, rimuovere media da ogni pozzetto usando un aspiratore a vuoto. Aggiungere immediatamente 50 ml / pozzetto di tampone di lisi freddo ghiaccio utilizzando un dosatore automatico munito di una cassetta standard. Lasciare riposare 30 minuti in ghiaccio per Lyse (opzionale: può fermare qui, se necessario, plat di tenutaE e memorizzazione a -80 ° C. Per continuare, piastre disgelo su ghiaccio). </li><li> Piastre far girare a 1900 xg per 3 minuti a 4 ° C. </li><li> Raschiare le cellule da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e trasferire tutti i contenuti per etichettato in modo appropriato piastre 96 e V-bottom. Piastre far girare a 1900 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Durante la rotazione, riempire piastre rivestite glutatione (uno per ogni piastra a 96 pozzetti) con 100 l / pozzetto di ghiaccio tampone di lisi freddo (senza PMSF) come un risciacquo. Mantenere le piastre in ghiaccio. </li><li> Rimuovere piastre V-bottom dalla centrifuga. Uno alla volta, capovolgere le piastre di glutatione su un lavandino per scuotere il tampone di lisi e macchia su un tovagliolo di carta. Trasferire tampone di lisi dalle piastre V-bottom alle piastre glutatione inclinando la piastra e con una pipetta multicanale, facendo attenzione a non disturbare il pellet sul fondo. Coprire e lasciare le piastre in ghiaccio per un minimo di 2 ore per legare. </li><li> Vicino alla fine della fase di legame 2 hr, preparare una workstation radioattività, garantendo tegli necessarie precauzioni di sicurezza sono in atto per il lavoro radioattivo. Impostare fornetto di 30 ° C. </li><li> Preparare 200 ml di tampone di lisi aggiungendo DTT e sodio vanadate come indicato nella Sezione 1. PMSF non è necessario in questa fase. </li><li> Capovolgere le piastre di glutatione su un lavandino per scuotere il tampone di lisi e asciugare su un tovagliolo di carta. Sciacquare pozzi 3x con 100 microlitri tampone di lisi (senza PMSF). Non lasciate che i pozzi si siedono a secco - tenerli in risciacquo fino al momento di procedere. </li><li> Preparare 55 ml di tampone chinasi 1x (KB) diluendo lo stock 10x e l&#39;aggiunta di DTT come indicato nella Sezione 1. placche Sciacquare una volta con 50 ml di 1x KB utilizzando un dosatore automatico dotato di una cassetta volume standard. Lasciare 1x KB in pozzi fino a quando la soluzione A è pronta: <ol><li> Preparare una soluzione aggiungendo 500 a 530 ug del substrato di interesse, 500 mg di proteina basica della mielina (MBP), 2,65 ml di 10x KB, 13.25 ml di 1 M DTT e H 2 O fino a 15,9 ml. </li></ol></li&gt; <li> Uno alla volta, capovolgere le piastre su un lavandino per rimuovere 1x KB risciacquo, asciugare su carta assorbente, e subito aggiungere 30 ml di soluzione A utilizzando un dosatore automatico provvisto di un piccolo volume di cassette. Mantenere le piastre in ghiaccio. </li><li> Preparare Soluzione B nell&#39;area di lavoro radioattività aggiungendo 2,5 ml 10x M-ATP, 500 pCi gamma- 32 P ATP, e H 2 O a 10 ml. <ol><li> Aggiungere 20 ml di soluzione B per bene con una pipetta repeater che aiuta nel mescolare dovuto alla forza di espulsione. Coprire e incubare a 30 ° C ibridazione forno per 30 min. </li></ol></li><li> Dopo 30 minuti, trasferire lastre di nuovo al ghiaccio. Aggiungere 50 ml di tampone di lisi 2x SDS in ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Può procedere a questo punto il passo successivo, o sigillare le piastre con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C fino conveniente. </li></ol> 4. Esecuzione, colorazione, e gel di essiccazione Nota: Tutti i lavori devono essere eseguiti in una zona DESIGNAted per la radioattività. <ol><li> Accendete il forno di ibridazione e impostato a 85 ° C. Piastre scongelare a temperatura ambiente. Una volta che il forno ha raggiunto la temperatura, piastre di trasferimento a forno e incubare per 10 minuti a denaturare campioni. </li><li> Carico di 26 e gel prefabbricati con 15 ml di ogni reazione utilizzando una pipetta multicanale per riempire diversi pozzi in una sola volta. Bisogna fare attenzione che tutti i suggerimenti siano allineati con le corrispondenti bene prima di aggiungere i campioni. Eseguire gel a 150 V. Non lasciate che il colorante inseguimento (linea blu) scappare del fondo del gel come questo contiene il prive di personalità giuridica ATP. </li><li> Smontare i gel e tagliare la prive di personalità giuridica ATP (linea blu) con un bisturi o un bordo dritto come sarà sovraesporre i film. Mettere il gel in contenitori etichettati e coprire con macchia Coomassie per 15 min. </li><li> Rimuovere la macchia Coomassie, sciacquare brevemente il gel con acqua e aggiungere Decolorare soluzione. Decolorare i gel finché le proteine ​​sono chiaramente visibili. Una band per MBP e una banda per il substrato dovrebbevisibile per ogni campione. </li><li> Per asciugare i gel: <ol><li> Tagliare un grande foglio di carta da filtro e posizionarlo sul asciugatrice. </li><li> Bagnate un foglio di cellophane in acqua distillata fino a che non è liscia e ruga libero, e posizionarlo sulla parte superiore del foglio. </li><li> Disporre il gel sulla parte superiore del foglio di cellophane, prendendo nota dell&#39;ordine di gel. Bagnare un secondo foglio di cellophane e posto sulla sommità del gel. </li><li> Stendere tutte le bolle (un rullo di tenuta piatto funziona bene per questo) per una superficie bella uniforme. Chiudere il lembo, attivare il vuoto, ed asciugare il gel per 3 ore a 80 ° C. </li></ol></li><li> Una volta che i gel sono asciutti, esporli a pellicola XAR utilizzando uno schermo per intensificare il segnale. Avvolgere la cassetta con involucro di saran o un sacchetto di plastica e sigillare con nastro adesivo per tenere fuori gelo. Conservare la cassetta a -80 ° C durante la notte. </li></ol> 5. Sviluppare XAR Films <ol><li> Il giorno seguente, rimuovere cassetta dal freezer e lasciare scongelare a temperatura ambiente. Sviluppare il film inuna camera oscura utilizzando un processore pellicola secondo le istruzioni del produttore. Nota: Esaminare i film per la prova di coppie chinasi-substrato. Una seconda esposizione più lunga può anche essere utile per rilevare eventi di fosforilazione più deboli. </li></ol>

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<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Poiché le pubblicazioni originali descrivono l&#39;approccio 14,15, la libreria originale di 180 GST-chinasi è stata ampliata per 420 membri, o ~ 80% della proteina kinome umana. Con la libreria espanso, il protocollo come descritto richiede 4-5 giorni e poi 1-4 giorni per sviluppare film (se ritenuto necessario), che può essere ridotto mediante l&#39;uso di phosphorimaging e valorizzazione segnale digitale. Ci sono diversi passaggi chiave in cui occorre prendere cura (vedi figura 1 per una p...

Proteina modificazioni post-traduzionali (PTM) sono essenziali per la comunicazione intracellulare. Forse il più studiato di tutti PTM è fosforilazione, catalizzata da proteina chinasi, che regolano una miriade di funzioni proteiche, compresa la loro attività biochimica, localizzazione subcellulare, conformazione e stabilità. L&#39;individuazione dei siti di fosforilazione di proteine ​​bersaglio può essere eseguito la mappatura fosfopeptide trittico o mediante tecniche di proteomica ormai standard che utilizzano i campioni arricchito da peptidi fosforilati 1,2. Mentre tre quarti del proteoma espresso dovrebbero essere fosforilata 3 e identificate 200.000 siti di fosforilazione 5, con stime fino a 1 milione 6, molti di questi non hanno biologia assegnato, percorso di segnalazione, o proteine ​​chinasi. Mentre individuazione dei siti fosforilazione è relativamente semplice, una sfida comparativamente più grande è quella diidentificare la chinasi affine (s) che gli obiettivi di questi siti, un processo che chiamiamo mappatura chinasi: coppie di substrato. Diversi approcci per identificare chinasi: coppie di substrato sono stati descritti, sia partendo con una chinasi di interesse e cerchi suoi substrati o iniziare con un substrato di interesse e il tentativo di trovare una chinasi modificante sperimentalmente 7-11 o computazionalmente 12. Per identificare chinasi per un noto substrato fosforilato, bioinformatica possono essere utilizzate per identificare le proteine ​​che contengono una breve sequenza di amminoacidi conservati che fiancheggiano il residuo fosforilato (sito consensus), nonché individuare chinasi che formano un complesso precipitable con il substrato. Tuttavia, questi approcci sono in termini di tempo e spesso non hanno successo. Abbiamo sviluppato un approccio funzionale sistematica di individuare rapidamente chinasi che può fosforilare un determinato substrato 13. Il saggio schermo produce eccellente specificolità, con molto chiara selezione di potenziali chinasi affini. Data la centralità della fosforilazione di segnalazione biologica, lo schermo è utile per la scoperta in quasi tutti i cellulari vie di segnalazione 14-16. Lo schermo comporta l&#39;esecuzione di un test chinasi larga scala con una libreria di proteine ​​chinasi umani. Le chinasi sono state contrassegnate con glutatione batterica S-transferasi (GST) proteine ​​e sono purificato da estratti cellulari di mammifero, il che significa che gli enzimi ricombinanti - a differenza di quelli preparati da batteri - sono generati in presenza delle proteine ​​chinasi a monte spesso necessari per la enzimi ricombinanti hanno attività in vitro. Infatti, mentre l&#39;attività della chinasi serina, treonina e tirosina per l&#39;attivazione della chinasi a valle sono presenti nel lievito 10, il genoma di lievito codifica 122 protein chinasi, indicando che il kinome mammiferi, con oltre 500 geni 17, è diventato molto più complesso per regulaTE i processi unici per gli organismi di ordine superiore. Inoltre, l&#39;effetto di diversi stimoli rilevanti alla biologia cellulare e malattie umane (quali piccole molecole, fattori di crescita, ormoni, ecc) può essere utilizzato per attività chinasica 14,15 modulate in un contesto appropriato.

<table><tbody><tr><td>Tampone di lisi</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td>Vedi Protocollo fase 1.1</td></tr><tr><td>10x tampone chinasi</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td>Vedi Protocollo fase 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td>Vedi Protocollo fase 1.3</td></tr><tr><td>Plasmidi chinasi umani</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-taged in house</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>integratore con 100&nbsp; U/ml penicillina, 100&nbsp; &#956; g/ml di streptomicina, 10% siero fetale di vitello.</td></tr><tr><td>Incubatore CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari da 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di siero ridotto</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione a base lipidica</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Distributore automatico di liquidi</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Attacco cassetta piccola</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Attacco cassetta standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM di pervanadato</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td>Vedere il passaggio del protocollo 3.1</td></tr><tr><td>0,25 M CaCl2</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale (20-200 &#956; l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale (1-10 &#956; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti con fondo a V</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti rivestite in glutatione</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>Substrato marcato GST</td><td>Proteina</td> basica della mielina (MBP) prodotta internamente <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta ripetitiva (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x tampone di lisi SDS (100&nbsp; ml)</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td>Vedere il protocollo fase 1.4</td></tr><tr><td>Gel TGX prefabbricati a 26 pozzetti</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td> La <td>percentuale di gel richiesta dipende dal peso molecolare del substrato di interesse</td></tr><tr><td>Colorazione Coomassie</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td>0,1% Coomassie R250, 10% acido acetico, 40% metanolo</td></tr><tr><td>Colorazione Coomassie</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td>10% acido acetico, 20% metanolo</td></tr><tr><td>Coperchi</td><td></td><td></td><td>di plastica usati da scatole di puntali vuote, abbastanza grandi da contenere un gel</td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Fogli di cellophane (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore di gel</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola per autoradiografia a doppia emulsione</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per film</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Schermo intensificatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Rullo in gomma sigillante per piastre</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione delle coppie kinase-substrato usando high throughput screening

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Abbiamo sviluppato una piattaforma di screening per identificare proteine ​​chinasi dedicati umani per substrati fosforilati che possono essere utilizzati per delucidare nuovi percorsi di trasduzione del segnale. Il nostro approccio è caratterizzato dall&#39;uso di una libreria di purificate protein chinasi umana GST-tag e una proteina ricombinante di interesse substrato. Abbiamo utilizzato questa tecnologia per identificare MAP / microtubuli affinità regolazione chinasi 2 (MARK2) come chinasi per un sito di glucosio-espresso nelle CREB-regolato trascrizionale coattivatore 2 (CRTC2), una proteina necessaria per la proliferazione delle cellule beta, nonché la famiglia di tirosina chinasi Axl come regolatori di metastasi delle cellule di fosforilazione della proteina dell&#39;adattatore ELMO. Descriviamo questa tecnologia e discutiamo come può aiutare a stabilire una mappa completa di come le cellule rispondono agli stimoli ambientali.

I risultati rappresentativi di uno schermo sono illustrati nella Figura 2. 180 chinasi sono stati proiettati utilizzando un peptide substrato GST-tag corrispondenti a aa 268-283 da CRTC2 così come la proteina basica classico saggio di chinasi substrato mielina (MBP). Solo due chinasi, MARK2 e altamente connessi MARK3 chinasi fosforilate il peptide CRTC2. MBP è incluso come controllo interno in tutti i saggi, in quanto contiene molti residui fosforilabili e funziona a 18 kDa, verso il fo...

La fosforilazione delle proteine è una caratteristica centrale del modo in cui le cellule interpretano e rispondono alle informazioni nel loro ambiente extracellulare. Qui, presentiamo un protocollo di screening ad alto rendimento che utilizza chinasi purificate da cellule di mammifero per identificare rapidamente le chinasi che fosforilano uno o più substrati di interesse.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le chinasi che fosforilano un substrato di interesse mediante metodi di screening ad alto rendimento. Questo viene ottenuto innanzitutto trasfettando cellule con plasmidi che esprimono chinasi FU come glutathione S-transferasi o GST. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire un'analisi di pulldown della chinasi GST.Successivamente, i campioni vengono caricati sui gel, che vengono quindi eseguiti e colorati con il colorante kumasi brilliant blue. L'ultimo passaggio consiste nell'essiccare i gel ed esporli a una pellicola di autoradiografia. Sviluppando e interpretando infine le pellicole ottenute, è possibile identificare coppie chinasi-substrato, poiché ogni corsia rappresenta un saggio di chinasi distinto.I metodi esistenti per identificare una chinasi per un substrato fosforilato noto includono l'utilizzo di approcci bioinformatici per cercare un sito consenso nel substrato, il rilevamento di complessi tra chinasi e substrati mediante tecniche biochimiche e un approccio basato su tentativi ed errori, e la ricerca di substrati consenso in base alla loro funzione biologica nota. Questi approcci sono lunghi e non sempre portano al successo. Il nostro metodo permette l'identificazione rapida di coppie chinasi-substrato sulla base degli esiti funzionali.Quando abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo, temevamo che la specificità in vitro fosse insufficiente. In realtà, la specificità del substrato è eccellente e spesso riscontriamo che soltanto le chinasi appartenenti alla stessa famiglia sono in grado di fosforilare un determinato substrato nell'analisi. Ciò è particolarmente evidente quando eseguiamo analisi multiplex utilizzando più substrati in ciascun esperimento, dimostrando che la procedura sarà eseguita da Courtney, un'assistente del mio laboratorio. Iniziare la procedura preparando reagenti, piastre e cellule come descritto nel protocollo testuale.Se le piastre contenenti i plasmidi della chinasi sono state congelate, scongelarle a temperatura ambiente e centrifugare a 1900 volte G per tre minuti per raccogliere qualsiasi umidità sul fondo dei pozzetti. Mescolare 8,6 millilitri di mezzo con siero ridotto con 312,7 microlitri di reagente di trasfezione a base lipidica e lasciare riposare la miscela per cinque minuti in ciascun pozzetto. Della piastra a 96 pozzetti contenente i plasmidi della chinasi, aggiungere 10 microlitri di mezzo con siero ridotto.Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di una cassetta per piccoli volumi, aggiungere quindi 10 microlitri di mix del reagente per la trasfezione in mezzo con siero ridotto per ogni pozzetto, impiegando un distributore automatico di liquidi munito di una cassetta per piccoli volumi, e lasciare riposare la piastra per 20-45 minuti. Successivamente, risospendere 2 93 T cells a 0,75 milioni di cellule per millilitro in 80 millilitri di mezzo completo modificato delcos, noto come DMEM, distribuendo 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di una cassetta per volumi standard, verificare al microscopio una distribuzione uniforme delle cellule nei pozzetti prima di reinserire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore.Per iniziare l'esperimento di immunoprecipitazione con GST kinase. Preparare una soluzione di vanadato 4 millimolare mescolando 60 microlitri di vanadato di sodio 0,2 molare con 540 microlitri di acqua; in un secondo tubo, mescolare 2,7 microlitri di perossido al 30% e 1,4 millilitri di soluzione salina fosfato o PBS. Unire le due soluzioni e lasciare riposare la miscela per 15 minuti prima dell'uso.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere due microlitri di cloruro di calcio 0,25 M in ogni pozzetto, seguiti da 2,5 microlitri della soluzione di datazione provata. Incubare ogni piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti, quindi posizionarla sul ghiaccio, mantenendo le piastre sul ghiaccio. Rimuovere il mezzo da ogni pozzetto, utilizzando immediatamente il vuoto con 50 microlitri per pozzetto di tampone di lisi freddo.Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato della cassetta standard, lasciare la piastra in ghiaccio per 30 minuti. Dopo aver centrifugato le piastre a 1900 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius, raschiare le cellule da ogni pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e trasferire tutti i contenuti in vbo opportunamente etichettati. Per le piastre a 96 pozzetti, centrifugare a 1900 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius; durante la centrifugazione, aggiungere alle piastre rivestite con glutathione 100 µL per pozzetto di buffer di lisi freddo di ghiaccio.Come operazione di risciacquo, mantenere le piastre sul ghiaccio. Dopo la centrifugazione delle piastre a fondo V, capovolgere le piastre contenenti glutathione sopra un lavello per eliminare il buffer di lisi e asciugare delicatamente su un tovagliolo di carta. Trasferire il buffer di lisi dalle piastre a fondo V alle piastre contenenti glutathione inclinando la piastra e utilizzando una pipetta multicanale, avendo cura di non disturbare il pellet sul fondo.Quindi coprire le piastre e lasciarle sul ghiaccio per almeno due ore. Poco prima della fine dei due ore di legame, preparare una postazione per lavori con radioattività, assicurandosi che siano state adottate le necessarie precauzioni di sicurezza per manipolazioni con sostanze radioattive. Impostare il forno di ibridazione a 30 gradi Celsius.Rovesciare le piastre con glutathione su un lavello per eliminare il buffer di lisi e tamponare con un tovagliolo di carta. Risciacquare i pozzetti tre volte con 100 microlitri di buffer di lisi senza PMSF. Non lasciare asciugare i pozzetti.Tenerli nella soluzione di lavaggio fino al momento dell'utilizzo. Successivamente, preparare 55 millilitri di un buffer chinasico 1X o un x kb come descritto nel protocollo testuale. Aggiungere 50 microlitri di x kb 1X in ciascun pozzetto della piastra utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di cassetta a volume standard.Quindi preparare la soluzione A creando una soluzione contenente il substrato di interesse e la proteina basica della mielina o MVP, come specificato nel protocollo testuale, una alla volta. Capovolgere le piastre su un lavandino per rimuovere la soluzione di lavaggio XKB e asciugarle su un tovagliolo di carta, quindi aggiungere immediatamente 30 microlitri della soluzione A utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di cassetta per volumi ridotti. Mantenere le piastre sul ghiaccio.Successivamente, preparare la soluzione B nell'area di lavoro con sostanze radioattive come descritto nel protocollo testuale, utilizzando 20 microlitri di soluzione B per pozzetto. Utilizzando una pipetta ripetitrice, che facilita la miscelazione grazie alla forza di espulsione, coprire e incubare la piastra in un forno di ibridazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Trascorsi 30 minuti, trasferire nuovamente le piastre sul ghiaccio.Quindi aggiungere 50 microlitri di due x tampone di lisi in sodio eccle solfato o SDS a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Tutti i lavori in questa sezione devono essere eseguiti in un'area designata per l'attività radioattiva. Accendere il forno di ibridazione e impostarlo a 85 gradi Celsius.Una volta raggiunta la temperatura, trasferire le piastre nel forno e incubare per 10 minuti per denaturare i campioni. Successivamente, caricare gel preformati da 26 pozzetti con 15 microlitri di ogni reazione.Utilizzando una pipetta multicanale per riempire contemporaneamente diverse pozzette, è necessario prestare attenzione affinché tutte le punte siano allineate correttamente con le rispettive pozzette. Prima di aggiungere i campioni, far correre il gel a 150 volt. Non permettere alla linea blu di uscire dal fondo del gel, poiché contiene l'ATP non incorporato. Smontare quindi i gel e rimuovere l'ATP non incorporato, poiché potrebbe scurire l'esposizione del gel sui film. Posizionare i gel in contenitori etichettati e coprirli con il colorante kumasi per 15 minuti. Successivamente, rimuovere il colorante kumasi. Sciacquare brevemente i gel con acqua e aggiungere la soluzione di decolorazione.Trattenere i gel fino a quando le proteine sono chiaramente visibili. Per ogni campione, devono essere visibili una banda per MVP e una banda per il substrato. Per asciugare i gel, tagliare un foglio grande di carta filtrante e posizionarlo sull'essiccatore.Inumidire un foglio di carta cellophane con acqua distillata fino a quando risulta liscio e privo di pieghe, quindi posizionarlo sopra il foglio di carta. Disporre i gel sopra il foglio di cellophane, annotando l'ordine dei gel. Inumidire un secondo foglio di cellophane e posizionarlo sopra i gel.Ruotare per eliminare tutte le bolle e ottenere una superficie uniforme. Chiudere la linguetta, attivare il vuoto e asciugare i gel per tre ore a 80 gradi Celsius. Una volta che i gel sono asciutti, esporli a una pellicola per autoradiografia a doppia emulsione utilizzando uno schermo per intensificare il segnale.Avvolgere la cassetta con pellicola trasparente o un sacchetto di plastica e sigillare con nastro adesivo per proteggerla dalla formazione di brina prima di conservarla nella cassetta a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere la cassetta dal congelatore e lasciarla scongelare a temperatura ambiente. Sviluppare la pellicola in una stanza oscura utilizzando un processore per pellicole seguendo le istruzioni del produttore indicate.Di seguito sono riportati risultati rappresentativi di un'analisi in cui sono state testate 180 chinasi utilizzando un substrato peptidico marcate con GST corrispondente agli amminoacidi da 268 a 283 del coattivatore trascrizionale regolato da kreb, noto come CRTC2, nonché il classico substrato per saggio chinasi nota come proteina basica della mielina (MBP). Le chinasi MARK2 e la chinasi strettamente correlata MARK3 sono risultate attive. Il peptide CRTC2 e MBP sono inclusi come controllo interno in tutti i saggi poiché contengono numerosi residui fosforilabili e migrano a 18 chilodalton, in prossimità del fondo del gel.Questo consente un'interpretazione della specificità. Alcune chinasi fosforilano in modo robusto un substrato e la MVP. È importante notare che le pozzette contenenti solo GST purificano sempre una certa attività chinasi endogena.Pertanto, nell'assay è sempre presente una fosforilazione di fondo. Sebbene ciò non escluda che la fosforilazione del substrato sia reale, suggerisce che in condizioni in vitro la chinasi potrebbe essere meno selettiva. È particolarmente utile includere multipli substrati con diversi pesi molecolari per trarre conclusioni riguardo alla specificità della chinasi verso i substrati.Poiché lo schermo è in vitro e ulteriori livelli di complessità si verificano in vivo, una chinasi candidata deve essere convalidata nelle cellule. Ad esempio, una chinasi candidata potrebbe avere la capacità di fosforilare un substrato in vitro, ma non essere espressa nello stesso tipo cellulare o nelle stesse sottocellule di un compartimento in cui è presente il substrato. Questo viene tipicamente effettuato mediante silenziamento mediato da RNAi del candidato.È inoltre possibile eseguire uno schermo secondario utilizzando un mutante non fosforilabile del substrato per confermare la specificità.

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