Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le chinasi che fosforilano un substrato di interesse utilizzando metodi di screening ad alto rendimento. Ciò si ottiene sezionando prima le cellule con plasmidi che esprimono le chinasi FU in glutatione come transferasi o GST. Il secondo passo consiste nell'eseguire un pulldown della chinasi GST.

Successivamente, i campioni vengono caricati in gel, che vengono poi analizzati e colorati con colorante blu brillante kumasi. Il passaggio finale consiste nell'asciugare i gel ed esporli alla pellicola per autoradiografia. In definitiva, sviluppando e interpretando i film risultanti, si è in grado di identificare le coppie di substrati chinasici poiché ogni corsia è rappresentativa di un saggio chinasico distinto.

I metodi esistenti per identificare una chinasi per un substrato fosforilato noto includono l'uso di approcci bioinformatici per la ricerca di un sito di consenso nel substrato, la rilevazione di complessi tra chinasi e substrati utilizzando tecniche biochimiche e un approccio per tentativi ed errori, la ricerca di substrati di consenso conte sulla base della loro funzione biologica nota. Questi approcci richiedono molto tempo e non sempre hanno successo. Il nostro approccio consente una rapida identificazione di coppie di substrati chinasici sulla base dei risultati funzionali.

Quando abbiamo avuto l'idea di questo metodo, eravamo preoccupati che la specificità in vitro sarebbe stata insufficiente. A quanto pare, la specificità del substrato è eccellente e spesso scopriamo che solo le chinasi dei membri della famiglia sono in grado di fosforilare un dato substrato nello schermo. Ciò è particolarmente evidente quando multiplexiamo utilizzando più substrati in ogni schermo, a dimostrare la procedura sarà Courtney, un tecnico del mio laboratorio Iniziare la procedura con la preparazione di reagenti, piastre e cellule come descritto nel protocollo di testo.

Se le piastre contenenti plasmidi chinasi sono state congelate, scongelarle a temperatura ambiente e centrifugarle a 1900 volte G per tre minuti per raccogliere l'umidità sul fondo dei pozzetti. Mescolare 8,6 millilitri di terreno sierico ridotto con 312,7 microlitri di reagente di trasfezione a base di lipidi e lasciare riposare la miscela per cinque minuti per ciascun pozzetto. Della piastra a 96 pozzetti contenente i plasmidi chinasi a 10 microlitri del terreno sierico ridotto.

Utilizzando un dosatore automatico di liquidi dotato di una cassetta di piccolo volume, aggiungere quindi 10 microlitri della miscela di reagenti di trasfezione del siero ridotto per pozzetto, utilizzando un dosatore automatico di liquidi dotato di una cassetta di piccolo volume e lasciare riposare la piastra per 20-45 minuti. Successivamente, sospendere 2 cellule T da 93 a 0,75 milioni di cellule per millilitro in 80 millilitri di delcos completo modificato uguale a terreno o DMEM a 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di una cassetta di volume standard, controllare i pozzetti al microscopio per verificarne l'uniformità della distribuzione cellulare prima di rimettere la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Per iniziare l'esperimento di pull down della chinasi GST. Preparare una soluzione di quattro millimolari per vanadato mescolando 60 microlitri di vanadato di sodio 0,2 molare con 540 microlitri di acqua in una seconda provetta miscelata 2,7 microlitri di perossido al 30% e 1,4 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Aggiungere le due soluzioni insieme e lasciare riposare il composto per 15 minuti prima dell'uso.

Utilizzando una pipetta multicanale, erogare due microlitri di cloruro di calcio 0,25 molare in ciascun pozzetto, seguiti da 2,5 microlitri della soluzione di dattero collaudata. Incubare ogni piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti, quindi posizionarla sul ghiaccio, mantenendo le piastre sul ghiaccio. Rimuovere il terreno da ogni pozzetto, utilizzando immediatamente un vuoto a 50 microlitri per pozzetto di tampone di lisi ghiacciata.

Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato della cassetta standard, lasciare riposare il piatto per 30 minuti sul ghiaccio per i pidocchi. Dopo aver fatto girare le piastre a 1900 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius, raschiare le cellule da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e trasferire tutto il contenuto in vbo opportunamente etichettato. Le piastre a 96 pozzetti fanno girare le piastre a 1900 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius durante la centrifuga, riempiono le piastre rivestite di glutatione con 100 microlitri per pozzetto di tampone di lisi ghiacciata.

Come risciacquo, tenere i piatti sul ghiaccio. Dopo la centrifugazione delle piastre inferiori, capovolgere le piastre di glutatione su un lavandino per scuotere il tampone di lisi e tamponare su un tovagliolo di carta. Trasferire il tampone di lisi dalle piastre inferiori a V alle piastre in glutatione inclinando la piastra e utilizzando una pipetta multicanale, facendo attenzione a non disturbare il pellet sul fondo.

Quindi coprire i piatti e lasciare in ghiaccio per un minimo di due ore. Per rilegare in prossimità della fine della fase di rilegatura di due ore, preparare una stazione di lavoro per la radioattività assicurandosi che siano in atto le necessarie precauzioni di sicurezza per il lavoro radioattivo. Impostare il forno di ibridazione a 30 gradi Celsius.

Capovolgere le piastre di glutatione su un lavandino per scuotere il tampone di lisi e tamponare su un tovagliolo di carta. Sciacquare i pozzetti tre volte con 100 microlitri di tampone di lisi senza PMSF. Non lasciare i pozzetti asciutti.

Conservateli nel risciacquo fino al momento di procedere. Quindi, preparare 55 millilitri di un tampone chinasi X o un x kb come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 50 microlitri di un x kb a ciascun pozzetto della piastra utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di una cassetta di volume standard.

Quindi preparare la soluzione A realizzando una soluzione contenente il substrato di interesse e la proteina basica della mielina o MVP come dettagliato nel protocollo di testo uno alla volta. Capovolgere le piastre su un lavandino per rimuovere l'unico risciacquo XKB su un tovagliolo di carta e aggiungere immediatamente 30 microlitri di soluzione A.Utilizzando un distributore automatico di liquidi dotato di una cassetta di piccolo volume. Mantieni i piatti sul ghiaccio.

Successivamente, preparare la soluzione B nell'area di lavoro della radioattività come descritto nel protocollo di testo a 20 microlitri di soluzione B per pozzetto. Utilizzando una pipetta a ripetizione, che aiuta nella miscelazione grazie alla forza di espulsione, coprire e incubare la piastra in un forno di ibridazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, trasferire nuovamente i piatti nel ghiaccio.

Quindi aggiungere 50 microlitri di due x solfato di sodio eccle o tampone di lisi SDS a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Tutti i lavori in questa sezione devono essere eseguiti in un'area designata per l'attività radio. Accendete il forno di ibridazione e impostatelo a 85 gradi Celsius.

Una volta che il forno ha raggiunto la temperatura, trasferire le piastre nel forno e incubare per 10 minuti per denaturare i campioni. Carico successivo. 26 gel prefabbricati a pozzetti con 15 microlitri di ogni reazione.

Utilizzando una pipetta multicanale per riempire più pozzetti contemporaneamente, è necessario prestare attenzione che tutti i puntali siano allineati con i pozzetti corrispondenti. Prima di aggiungere i campioni, far funzionare il gel a 150 volt. Non lasciare che la linea blu scorra dal fondo del gel poiché questo contiene l'A TP non incorporato. Quindi smontare i gel e rimuovere il TP non incorporato in quanto scurirà l'esposizione del gel sulle pellicole.

Mettere i gel in contenitori etichettati e coprire con la macchia di kumasi per 15 minuti. Quindi, rimuovi la macchia di kumasi. Sciacquare brevemente i gel con acqua e aggiungere la soluzione di contenimento.

Trattenere i gel fino a quando le proteine non sono chiaramente visibili. Per ogni campione devono essere visibili una banda per l'MVP e una banda per il substrato. Per asciugare i gel, tagliare un grande foglio di carta da filtro e posizionarlo sull'essiccatore.

Bagnare un foglio di cellophane in acqua distillata fino a renderlo liscio e senza pieghe e posizionarlo sopra la carta. Stendere i gel sopra il foglio di cellophane prendendo nota dell'ordine dei gel. Inumidire un secondo foglio di cellophane e posizionarlo sopra i gel.

Stendete tutte le bolle per ottenere una superficie bella e uniforme. Chiudi lo sportello, accendi l'aspirapolvere e guida i gel per tre ore a 80 gradi Celsius. Una volta che i gel sono asciutti, esporli a una pellicola per autoradiografia a doppia emulsione utilizzando uno schermo per intensificare il segnale.

Avvolgere la cassetta con pellicola trasparente o un sacchetto di plastica e sigillarla con del nastro adesivo per tenere fuori la brina prima di riporre la cassetta a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, togliete la cassetta dal congelatore e lasciatela scongelare a temperatura ambiente. Sviluppare la pellicola in una camera oscura utilizzando un processore per pellicole secondo le istruzioni del produttore mostrate.

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi di uno screening: 180 chinasi sono state sottoposte a screening utilizzando un substrato peptidico marcato con GST corrispondente agli amminoacidi da 268 a 283 dal coattivatore trascrizionale regolato da kreb due o C RTC due, nonché la proteina basica della mielina del substrato del saggio chinasico classico o MBP solo due. Le chinasi marcano due e la chinasi altamente correlata, segna tre fosforilate. L'MBP a due peptidi CRTC è incluso come controllo interno in tutti i saggi in quanto contiene molti residui fosforici riconducibili e funziona a 18 kilodalton verso il fondo del gel.

Ciò consente un'interpretazione della specificità. Alcune chinasi fosforilano in modo robusto un substrato e un MVP. Da notare che i pozzetti contenenti GST da soli purificano sempre una certa attività chinasica endogena.

Pertanto, c'è sempre una fosforilazione di fondo nel saggio. Sebbene ciò non escluda che la fosforilazione del substrato sia reale, suggerisce che nel contesto in vitro, la chinasi potrebbe essere meno selettiva. È particolarmente istruttivo includere più substrati di diverso peso molecolare per trarre conclusioni sulla specificità del substrato chinasico.

Poiché lo screening è in vitro e si verificano ulteriori livelli di complessità in vivo, una chinasi candidata deve essere convalidata nelle cellule. Ad esempio, una chinasi candidata può avere la capacità di fosforilare un substrato in vitro non essere espressa nello stesso tipo di cellula o nelle stesse sottocellule di un compartimento del substrato. Questo viene tipicamente fatto utilizzando il silenziamento mediato dall'RNAi del candidato.

È anche possibile eseguire uno screening secondario utilizzando un mutante non correlato al fosforile del substrato per confermare la specificità.