Name: Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con lazione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Scopri l'identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con DRaCALA in Escherichia coli. Questo metodo rapido e sensibile consente di studiare le interazioni proteina-ligando nei batteri.

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Il lavoro è supportato da una sovvenzione del progetto NNF (NNF19OC0058331) a YEZ e dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie (Nº 801199) a MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Preparazione di lizzati a cellule intere
<ol><li>Inoculare i ceppi di raccolta E. coli K-12 ASKA ORFeome15 in 1,5 mL di brodo di lisogenia (LB) contenente 25 μg/mL di cloramfenicolo in piastre di pozzetti profondi 96 pozzetti. Crescere durante la notte (O/N) per 18 ore a 30 °C con agitazione a 160 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere isopropil β-d-1-tiogalattosiranoside (IPTG) (0,5 mM finale) alle colture O/N per indurre l'espressione proteica a 30 °C per 6 ore.</li>
	<li>Celle a pellet a 500 x g per 10 min. Congelare il pellet a -80 °C fino all'uso. Per lisi delle cellule, aggiungere 150 μL di tampone di lisi L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, integrato con 2 mM fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 40 μg / mL DNasi 1 e 0,5 mg / mL lisozima) per sospendare il pellet.</li>
	<li>Congelare le celle a -80 °C per 30 minuti, quindi scongelare a 37 °C per 20 minuti. Ripeti questo ciclo tre volte per lisi delle cellule. Conservare i lasati a -80 °C prima dell'uso.</li>
</ol>2. Purificazione di Relseq e GppA
NOTA: Le proteine ricombinanti Relseq di Streptococcus equisimilis e GppA di E. coli K-12 sono utilizzate per sintetizzare rispettivamente pppGpp e ppGpp radiomarcati.
<ol><li>Crescere e raccogliere cellule sovraesprimendo ogni proteina.<ol>
<li>Coltivare il ceppo E. coli BL21 DE3 fino alla fase esponenziale (densità ottica (OD) ~ 0,3-0,4) in brodo LB e girare verso il basso 1 mL di coltura a 6000 x g per 5 minuti. Decantare il surnatante e riconsosciare le cellule con 100 μL di brodo TSB ghiacciato (brodo LB integrato con 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 mL/mL dimetilsolfossido, 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Mescolare i plasmidi con il relseq e il gppAmarcati con istidina, ciascuno 100 ng, con le sospensioni cellulari di cui sopra in TSB, e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Shock termico delle celle a 42 °C per 40 s. Mettere la miscela su ghiaccio per 2 minuti e aggiungere 1 mL di brodo LB a temperatura ambiente per consentire alle cellule di recuperare per 1 ora a 37 °C con agitazione a 160 giri/min.</li>
		<li>Placcare le cellule recuperate su piastre di agar LB integrate con gli antibiotici corrispondenti (Relseq:100 μg/mL di ampicillina; GppA: 30 μg/mL kanamicina). Il giorno successivo, inoculare le colonie in brodo LB per iniziare le precolture O/N di entrambi i ceppi a 37 °C.</li>
		<li>Dopo 18 ore, inoculare 500 mL di LB medium con 10 mL delle colture O/N e gli antibiotici corrispondenti. Coltivare le colture agitando a 160 giri/min a 37 °C. Quando l'OD600nm raggiunge 0,5-0,7, indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,5 mM IPTG e crescendo per 3 ore a 30 °C con agitazione a 160 rpm.</li>
		<li>Raccogliere le cellule ruotando a 6084 x g per 10 minuti a 4 °C. Riconsegregare il pellet in 20 mL di soluzione salina ghiacciata tamponata con 1x fosfato (PBS) e ricentrizzare a 1912 x g per 20 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e congelare il pellet a -20 °C prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione dell'affinità dell'acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA) NOTA: da questo punto in poi, assicurarsi che i campioni siano freddi.<ol>
<li>Aggiungere 40 mL di tampone di lisi ghiacciato L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 10 mM imidazolo, 10 mM β-mercaptoetanolo integrato con inibitori della proteasi (compressa senza EDTA; vedere la tabella dei materiali)per sospendare il pellet. Lisi delle celle tramite sonicazione (ampiezza del 60%, 2 s ON / 4 s OFF per 8 min ON). Eliminare il lisito ruotando a 23.426 x g per 40 minuti a 4 °C e continuare con il surnatante per la purificazione.</li>
		<li>Durante la centrifugazione di cui sopra, preparare la resina Ni-NTA.<ol>
<li>Trasferire 500 μL di resina Ni-NTA omogeneizzata in una colonna di cromatografia in polipropilene in piedi e lasciarla depositare per 15 minuti e la soluzione di stoccaggio sgocciola. Lavare la resina con 15 ml di acqua ultrapura due volte, quindi lavare la colonna con 15 ml del tampone di lisi L2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caricare il surnatante eliminato del lisi di cella dal passaggio 1 sulla colonna e lasciarlo scorrere. Lavare la colonna con 30 mL di tampone di lavaggio (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 20 mM imidazolo).</li>
		<li>Eluire le proteine con 400 μL del tampone di eluizione (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 500 mM imidazolo) tre volte. Quindi, ripetere l'eluizione con altri 300 μL del tampone di eluizione. Combinare le proteine eluite ad un volume finale di 700 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtrazione del gel<ol>
<li>Preparare il tampone di filtrazione in gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerolo). Lavare la colonna di esclusione delle dimensioni con un volume di colonna (25 ml) del tampone di filtrazione del gel.</li>
		<li>Caricare il campione di cui sopra di 700 μL utilizzando un anello da 500 μL, eseguire a 0,5 ml / min e raccogliere 2-3 frazioni, ciascuna di 0,5 mL di volume, contenenti le rispettive proteine.</li>
		<li>Combinare e concentrare le frazioni contenenti ciascuna delle proteine utilizzando una colonna di spin e misurare la concentrazione proteica utilizzando il test di Bradford.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sintesi di 32pppGpp e ppGpp con etichetta P
<ol><li>Assemblare una reazione Relseq su piccola scala in un tubo con tappo a vite (vedere Tabella 1). NOTA: Lavorare con reagenti radioattivi solo in un luogo autorizzato e con dispositivi di protezione individuale.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Volume (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Piccola scala</td>
			<td>Grande scala</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua ultrapura</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Relseq buffer*</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP (8 mM finale)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Relseq (4 μM finale)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>
32 anni P-α-Guanosina trifosfato (GTP) (finale 120 nM) (ATTENZIONE)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>totale</td>
			<td>20</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Informazioni di assemblaggio per le reazioni di sintesi su piccola e grande scala di 32pppGpp con etichetta P. *10x tampone Relseq contiene 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Abbreviazione: pppGpp = guanosina pentafosfato.
<ol start="2"><li>Incubare il tubo a 37 °C in un bimbyxer per 1 ora, poi a 95 °C per 5 minuti e metterlo sul ghiaccio per 5 minuti. Abbassare la proteina precipitata a 15.700 x g per 5 minuti e trasferire il surnatante (sintetizzato 32P-pppGpp) in un nuovo tubo a vite.</li>
	<li>Per sintetizzare 32P-ppGpp da 32P-pppGpp, trasferire metà del prodotto 32p-pppGpp in un nuovo tubo con tappo a vite e aggiungere 1 μM GppA. Incubare il tubo a 37 °C per 10 minuti, a 95 °C per 5 minuti, quindi posizionare sul ghiaccio per 5 minuti.</li>
	<li>Abbassare la proteina precipitata a 15.700 x g per 5 minuti e trasferire il surnatante (sintetizzato 32P-ppGpp) in un nuovo tubo a vite.</li>
	<li>Analizzare i 32P-pppGpp e 32P-ppGpp eseguendo 1 μL dei campioni su una piastra di cromatografia a strato sottile (TLC di cellulosa modificata da polietileneimina) utilizzando il 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, come fase mobile. NOTA: Utilizzare il guanosina 5'-trifosfato con etichettaα-32P(32P-α-GTP) come controllo.</li>
	<li>Asciugare completamente la piastra TLC, posizionarla tra una cartella di plastica trasparente ed esporla a uno schermo al fosforo per 5 minuti. Visualizza e quantifica i segnali utilizzando un fosforimmager. NOTA: Quando i rapporti di 32P-pppGpp e 32P-ppGpp sono superiori all'85%, una reazione su larga scala (500 μL, sufficiente per lo screening di 20 piastre a 96 pozzetti) potrebbe essere assemblata e sintetizzata utilizzando la Tabella 1.</li>
</ol>4. Screening DRaCALA delle proteine bersaglio di (p)ppGpp
<ol><li>Scongelare e trasferire 20 μL di lizzati a cellule intere in una piastra microtitolato a V a 96 pozzetti. Aggiungere 2,5 U/well di endonucleasi da Serratia marcescense incubare a 37 °C per 15 minuti per ridurre la viscosità del lsato. Mettere i lasati sul ghiaccio per 20 min.</li>
	<li>Mescolare i 32P-pppGpp e i 32P-ppGpp in un rapporto 1:1 e aggiungere 1x tampone di lisi L1 per rendere la concentrazione finale di (p)ppGpp pari a 4 nM. NOTA: Data la somiglianza chimica tra pppGpp e ppGpp, un mix di entrambe le sostanze chimiche semplificherà il processo di screening.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta multicanale e punte di pipetta filtrate per aggiungere e miscelare 10 μL della miscela (p)ppGpp con il l'alleato cellulare. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.</li>
	<li>Lavare lo strumento a 96 x pin inserendo una soluzione allo 0,01% di detergente non ionico per 30 s e asciugare su carta velina per 30 s. Ripetere il lavaggio dello strumento pin 3x.</li>
	<li>Posizionare lo strumento pin nelle piastre campione a 96 pozzetti sopra e attendere 30 s. Sollevare l'utensile pin verso l'alto e posizionarlo direttamente su una membrana di nitrocellulosa per 30 s. NOTA: se manca un punto, individuare 2 μL dei campioni corrispondenti con una pipetta e punte filtrate. Si consiglia di creare un punto duplicato dello stesso campione come indicato di seguito.</li>
	<li>Asciugare la membrana per 5 minuti a RT. Posizionare la membrana tra una cartella di plastica trasparente ed esporla a uno schermo di fosforo di stoccaggio per 5 minuti. Visualizza utilizzando un fosforiger.</li>
</ol>5. Quantificazione e identificazione di potenziali proteine bersaglio
<ol><li>Utilizzare il software di analisi associato al phosphorimager per aprire il file .gel delle piastre visualizzate. Utilizzare la funzione di analisi array per definire i 96 punti impostando una griglia di 12 colonne x 8 righe.</li>
	<li>Definite grandi cerchi per circoscrivere il bordo esterno dell'intero punto (consultate la Figura 1B). Esporta Volumn+Sfondo e Area dei cerchi grandi definiti e salva in un foglio di calcolo. NOTA: se necessario, riposizionare ogni singolo cerchio in modo che si sovrapponga perfettamente ai punti e ridimensionare ogni singolo cerchio per renderlo leggermente più grande del punto effettivo.</li>
	<li>Ridimensiona i cerchi definiti per circoscrivere i piccoli punti interni. Esportare Volumn+Sfondoe Area dei piccoli cerchi definiti e salvarli in un foglio di calcolo.</li>
	<li>Calcolare le frazioni di associazione nel foglio di calcolo utilizzando l'equazione nella Figura 1Be tracciare i dati. Identificare le potenziali proteine leganti nei pozzi che mostrano elevate frazioni di legame rispetto alla maggior parte degli altri pozzi.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro complessivo del processo di screening DRaCALA. La produzione di proteine da una raccolta di Escherichia coli ASKA è indotta e le cellule vengono lizzate. Nel frattempo, le proteine ricombinanti Relseq-His e GppA-His sono purificate e utilizzate per sintetizzare 32pppGpp e ppGpp etichettati con P da 32P-α-GTP. Le molecole (p)ppGpp etichettate radioattivamente vengono quindi mescolate con i lisati e uno strumento a 96 pin viene utilizzato per individuare le miscele su una membrana di nitrocellulosa per la successiva esposizione a uno schermo di stoccaggio del fosforo, imaging e quantificazione dei segnali radioattivi. Abbreviazioni: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosina penta- e tetrafosfati; RT = temperatura ambiente; IPTG = isopropil β-d-1-tiogalatopiranoside; GTP = guanosina 5'-trifosfato; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di dodecilsolfato-poliacrilammide di sodio; TLC = cromatografia su strato sottile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.

Uno dei passaggi critici nell'esecuzione dello screening DRaCALA è quello di ottenere buoni lasati a cellule intere. In primo luogo, le proteine testate dovrebbero essere prodotte in grandi quantità e in forme solubili. In secondo luogo, la lisi delle cellule dovrebbe essere completa e la viscosità del lizzate deve essere minima. L'inclusione del lisozima e l'uso di tre cicli di congelamento-disgelo sono spesso sufficienti per far lisi completamente le cellule. Tuttavia, il DNA cromosomico rilasciato rende viscoso il lis...

I batteri utilizzano diverse piccole molecole di segnalazione per adattarsi ad ambienti in costante cambiamento1,2. Ad esempio, gli autoindoduttori, i lattoni N-acilomoserina e i loro oligopeptidi modificati, mediano la comunicazione intercellulare tra i batteri per coordinare il comportamento della popolazione, un fenomeno noto come quorum sensing2. Un altro gruppo di piccole molecole di segnalazione sono gli NSM, tra cui l'adenosina monofosfato ciclico (cAMP), il di-AMP ciclico, il monofosfato ciclico di di-guanosina (di-GMP ciclico) e i guanosina penta- e tetra fosfati (p)ppGpp1. I batteri producono questi NSM come risposta a una varietà di diverse condizioni di stress. Una volta prodotte, queste molecole si legano alle loro proteine bersaglio e regolano diverse vie fisiologiche e metaboliche per far fronte agli stress incontrati e migliorare la sopravvivenza batterica. Pertanto, l'identificazione delle proteine bersaglio è un prerequisito inevitabile per decifrare le funzioni molecolari di queste piccole molecole.
L'ultimo decennio ha visto un boom di conoscenza di queste piccole molecole di segnalazione, principalmente a causa di diverse innovazioni tecniche che hanno svelato le proteine bersaglio di queste piccole molecole. Questi includono la tecnica del composto di cattura3,4,5e l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando (DRaCALA)6 da discutere in questo articolo.
Inventato da Vincent Lee e colleghi nel 20116,DRaCALA utilizza la capacità di una membrana nitrocellulosa di sequestrare in modo differenziale ligandi liberi e legati alle proteine. Molecole come le proteine non possono diffondersi su una membrana nitrocellulosa, mentre piccoli ligandi, come gli NSM, sono in grado di farlo. Mescolando l'NSM(ad esempio,ppGpp) con la proteina da testare e individuandoli sulla membrana, ci si possono aspettare due scenari (Figura 1): Se (p)ppGpp si lega alla proteina, il (p)ppGpp radiomarcato sarà trattenuto al centro dello spot dalla proteina e non si diffonderà verso l'esterno, dando un piccolo punto intenso (cioè., forte segnale radioattivo) sotto un fosforiger. Tuttavia, se (p)ppGpp non si lega alla proteina, si diffonderà liberamente verso l'esterno per produrre una grande macchia con segnale radioattivo di fondo uniforme.
Inoltre, DRaCALA può rilevare l'interazione tra una piccola molecola e una proteina nonpurata in un intero lisi cellulare se la proteina è presente in quantità sufficiente. Questa semplicità consente l'uso di DRaCALA nell'identificazione rapida di bersagli proteici utilizzando una libreria di espressioni ORFeome. Infatti, le proteine bersaglio di cAMP7, di-AMPciclico 8, ciclico di-GMP9,10e (p) ppGpp11,12,13 sono state sistematicamente identificate utilizzando DRaCALA. Questo articolo video utilizza (p)ppGpp come esempio per dimostrare e descrivere i passaggi critici e le considerazioni per eseguire uno screening DRaCALA di successo. Da notare, una descrizione più approfondita di DRaCALA14 è altamente raccomandata da leggere in combinazione con questo articolo prima di eseguire DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figura 1: Il principio di DRaCALA. (A) Schema del saggio DRaCALA. Vedi il testo per i dettagli. (B) Quantificazione e calcolo della frazione vincolante. Vedi il testo per i dettagli. In breve, le macchie DRaCALA saranno analizzate disegnando due cerchi che circoscrivono l'intero punto e il punto scuro interno(cioèil (p)ppGpp trattenuto a causa del legame della proteina testata). Il segnale di legame specifico è il segnale radioattivo del cerchio interno (S1) dopo aver sottratto il segnale di fondo non specifico (calcolato da A1 × ((S2-S1)/(A2-A1))). La frazione di legame è il segnale di legame specifico diviso per il segnale radioattivo totale (S2). Abbreviazioni: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = guanosina penta- e tetrafosfati; RT = temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>32P-&alpha;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 x strumento a perno</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 Bolt Replicator, su 9 mm di interasse, 4,2 mm di diametro del bullone, 24 mm di lunghezza</td></tr><tr><td>96 pozzetti V-bottom</td><td>micropiastra Sterilin</td><td>MIC9004</td><td>Sterilin Micropiastra V Well 611V96</td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>LP0011</td><td>Agar n. 1</td></tr><tr><td>ASKA collection ceppo</td><td>NBRP, SHIGEN, GIAPPONE</td><td></td><td>Rif: Ricerca sul DNA, Volume 12, Numero 5, 2005, Pagine 291-299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU</td><td>endonucleasi geneticamente modificata da Serratia marcescens</td></tr><tr><td>Bradford Protein Assay Dye</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>5000006 Reagent Concentrate</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&ge; 99,9%</td></tr><tr><td>DNasi 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>filtrazione su gel colonna 10x300</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>contiene il 20% di etanolo come conservante</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>Glicerolo 87% per analisi</td></tr><tr><td>Ipercassetta</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>puriss. &ge; 99,5% (GC)</td></tr><tr><td>Schermo al fosforo di archiviazione IP</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td><td>Isopropil &beta;-D-tiogalattoside</td></tr><tr><td>Brodo di lisogenia (LB)</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher</td><td>12795027</td><td>Miller's LB Brodo Base</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>dall'albume d'uovo di gallina; BioUltra, polvere liofilizzata, &ge; 98%</td></tr><tr><td>MgCl2 (Cloruro di magnesio)</td><td>SIGMA</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ acqua</td> pipetta multicanale per acqua <td></td><td></td><td>ultrapura</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>4661110</td><td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x canali</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarosio</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Membrana assorbente nitrocellulosica</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>Premium 0,45 um 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>BR0014G</td><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco A), Compresse</td></tr><tr><td>PEG3350 (Polietilenglicole 3350)</td><td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonile fluoruro (PMSF)</td><td>SIGMA</td><td>93482</td><td>Soluzione di fluoruro di fenilmetanosulfonile - 0,1 M in etanolo (T)</td></tr><tr><td>Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager</td></tr><tr><td>Puntali per pipette, filtrati</td><td>Thermo Scientific</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12.5 &mu; l</td></tr><tr><td>colonna per cromatografia Poly-Prep</td> non sterile <td>Colonna per cromatografia in polipropilene</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi Mini</td><td>Pierce</td><td>A32955</td> Compresse, tubo con tappo a vite <td>senza EDTA</td></tr><tr><td></td><td>Provette per</td> microcentifugo Thermo Scientific <td>3488</td>, <td>2,0 ml con tappo a vite, non sterile</td></tr><tr><td>SLS Piastre a 96 pozzetti profonde</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom,</td></tr><tr><td>colonna di centrifuga</td> naturale <td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0,5 ml Filtri centrifughi</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer C</td></tr><tr><td>Piastra TLC (PEI-cellulosa F Piastre TLC)</td><td>Merck Millipore</td><td>105579</td><td>DC PEI-cellulosa F (20 x 20 cm)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>Tris Base per Biologia Molecolare</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>detergente viscoso non ionico</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>99% (GC/titolazione)</td></tr></tbody></table>

identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando assay (dracala)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

L'ultimo decennio ha visto enormi progressi nella comprensione di piccole molecole di segnalazione nella fisiologia batterica. In particolare, le proteine bersaglio di diversi messaggeri secondari derivati da nucleotidi (NSM) sono state sistematicamente identificate e studiate in organismi modello. Questi risultati sono dovuti principalmente allo sviluppo di diverse nuove tecniche tra cui la tecnica del composto di cattura e l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando (DRaCALA), che sono state utilizzate per identificare sistematicamente le proteine bersaglio di queste piccole molecole. Questo documento descrive l'uso di NSM, guanosina penta- e tetrafosfati (p)ppGpp, come esempio e dimostrazione video della tecnica DRaCALA. Utilizzando DRaCALA, 9 su 20 note e 12 nuove proteine bersaglio di (p)ppGpp sono state identificate nell'organismo modello, Escherichia coli K-12, dimostrando la potenza di questo test. In linea di principio, DRaCALA potrebbe essere utilizzato per studiare piccoli ligandi che possono essere etichettati da isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti. I passaggi critici, i pro e i contro di DRaCALA sono discussi qui per un'ulteriore applicazione di questa tecnica.

Seguendo il protocollo sopra descritto si produrranno in genere due tipi di risultati (Figura 3).
La Figura 3A mostra una piastra con segnali di legame di fondo relativamente bassi (frazioni di legame &lt; 0,025) dalla maggior parte dei pozzi. Il segnale di legame positivo dal pozzo H3 dà una frazione di legame di ~0,35 che è molto più alta di quella osservata per gli altri pozzi. Anche senza quantificazione, beh H3 è notevole, sugger...

Il Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) può essere utilizzato per identificare piccole proteine leganti il ligando di un organismo utilizzando una libreria ORFeome.

Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Piccole molecole di segnalazione prendono di mira varie proteine emozionali per controllare la virulenza batterica e la biologia umana. Tuttavia, queste proteine emozionali sono difficili da identificare. Come strumento di biologia dei sistemi, DRaCALA consente un'identificazione fattibile, rapida e altamente sensibile delle proteine emozionali sconosciute utilizzando una libreria OVium.DRaCALA potrebbe essere usato per studiare qualsiasi piccola molecola di segnalazione purché possa essere etichettata con isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti. Inizia inoculando E.coli in 1,5 millilitri di LB integrati con 25 microgrammi per millilitro cloramfenicolo in ogni pozzetto di piastre di pozzo profonde 96 pozzetti per un'incubazione notturna a 30 gradi Celsius e 160 rotazioni al minuto. La mattina successiva, trattare le colture notturne con 500 IPTG micromolari per sei ore a 30 gradi Celsius per indurre l'espressione proteica.Alla fine dell'incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione, rimuovere il surnatante e congelare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Per avviare la lisi, risuscidere i pellet in 150 microlitri di tampone di lisi uno per pozzetti per un'incubazione di 30 minuti a meno 80 gradi Celsius prima di scongelare le cellule per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Il lisirato deve quindi essere conservato a meno 80 gradi Celsius prima dell'uso.Per completare la lisi delle cellule con proteine sovraespresse, risospendare i campioni in 40 millilitri di tampone di lisi ghiacciata due e sonicare i campioni a un'ampiezza del 60% a due secondi su quattro secondi per otto minuti, quindi eliminare i lasati mediante centrifugazione. Mentre i campioni vengono centrifugati, aggiungere 500 microlitri di resina nichel-NTA omogeneizzata a una colonna di cromatografia in polipropilene in piedi. Dopo 15 minuti, lavare la resina depositata due volte con 15 millilitri di acqua ultrapura e una volta con 15 millilitri di tampone di lisi due.Al termine della centrifugazione, caricare il surnatante di lisi eliminato sulla colonna. Quando tutto il lisiato è fluito attraverso la colonna, lavare la colonna con 30 millilitri di tampone di lavaggio. Per eluire le proteine, aggiungere un volume di 400 microlitri di tampone di eluizione alla colonna e ripetere l'eluizione tre volte.Un altro volume di 300 microlitri del tampone di eluizione per ripetere l'eluizione tre volte e combinare le proteine eluite in un volume finale di 700 microlitri. Per la filtrazione su gel del campione eluito, dopo aver lavato una colonna di esclusione dimensionale con 25 millilitri di tampone di filtrazione in gel appena preparato, caricare l'intero volume di proteine eluite sulla colonna utilizzando un anello da 500 microlitri. Eseguire a 500 microlitri al minuto e raccogliere da due a tre frazioni di volume da 500 microlitri delle rispettive proteine.Quindi utilizzare singole colonne di spin per concentrare ciascuna proteina e utilizzare il kit di analisi Bradford per misurare le concentrazioni proteiche secondo protocolli standard. Per sintetizzare il fosforo 32 etichettato guanosina pentafosfato, assemblare una reazione di Relseq su piccola scala in un tubo con tappo a vite come indicato nella tabella e incubare la reazione in un Bimbyer per un'ora a 37 gradi Celsius e cinque minuti a 95 gradi Celsius, seguita da cinque minuti sul ghiaccio. Alla fine delle incubazioni, far girare la proteina precipitata per centrifugazione e trasferire il fosforo sintetizzato 32 etichettato guanosina pentafosfato contenente surnatante in un nuovo tubo tappo a vite.Per la sintesi di fosforo 32 guanosina tetrafosfato, aggiungere un GppA micromolare a metà del prodotto di guanosina pentafosfato etichettato fosforo 32 in un nuovo tubo tappo a vite e incubare la reazione per 10 minuti a 37 gradi Celsius, cinque minuti a 95 gradi Celsius e cinque minuti sul ghiaccio. Alla fine dell'incubazione, ruotare il precipitato per centrifugazione e trasferire il fosforo 32 etichettato guanosina tetrafosfato contenente surnatante in un nuovo tubo. Per analizzare le proteine bersaglio isolate, eseguire un microlitro di ciascun campione su una piastra cromatografica a strato sottile utilizzando 1,5 fosfato monopotassico molare come fase mobile.Dopo l'analisi, posizionare la piastra essiccata in una cartella di plastica trasparente ed esporre la piastra a uno schermo di fosforo di stoccaggio per cinque minuti prima di visualizzare e quantificare i dati su un imager al fosforo. Per lo screening DRaCALA delle proteine bersaglio, aggiungere 20 microlitri dei lasati all'ingrosso scongelati ai singoli pozzetti di una piastra di microtitolato a V a 95 pozzetti e aggiungere 2,5 unità di endonucleasi Serratia marcescens a ciascun pozzetto. Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, posizionare i lasati sul ghiaccio per 20 minuti.Quindi, mescolare volumi uguali di fosforo 32 guanosina pentafosfato e guanosina tetrafosfato etichettati e aggiungere 1X tampone di lisi uno alla miscela per ottenere una soluzione di guanosina pentafosfato a quattro nanomolari. Utilizzando una pipetta multicanale e punte di pipette filtrate, mescolare 10 microlitri della miscela di guanosina pentafosfato con il lisato cellulare per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare tre volte uno strumento a perno 96X in una soluzione allo 0,01% di detergente non ionico per 30 secondi, seguito da 30 secondi di asciugatura su un asciugamano di carta per lavaggio prima di posizionare lo strumento pin nella piastra campione a 96 pozzetti.Dopo 30 secondi, sollevare l'utensile pin verso l'alto e posizionarlo direttamente su una membrana di nitrocellulosa per 30 secondi. Dopo cinque minuti di essiccazione, posizionare la membrana di nitrocellulosa in una cartella di plastica trasparente per l'esposizione allo schermo al fosforo di stoccaggio e la visualizzazione mediante imaging al fosforo, come dimostrato. Per quantificare e identificare potenziali proteine bersaglio, nel software di analisi associato all'imager del fosforo, aprire il file gel delle piastre visualizzate.Per definire i punti da analizzare, utilizzare la funzione di analisi della matrice per impostare una griglia di 12 colonne per otto righe. Per circoscrivere il bordo esterno dei punti del foro, definite cerchi grandi, esportate il volume più lo sfondo e l'area dei grandi cerchi definiti in un foglio di calcolo. Per circoscrivere i piccoli punti interni, ridimensionare i cerchi definiti, esportare il volume più lo sfondo e l'area dei piccoli cerchi definiti e salvare tutti i dati nel foglio di calcolo.Posiziona i cerchi in modo che si sovrappongano ai punti se necessario, ridimensionando i punti leggermente più grandi di quelli effettivi. Utilizzare l'equazione per calcolare le frazioni di associazione nel foglio di calcolo e tracciare i dati. Quindi identificare le potenziali proteine leganti nei pozzi che mostrano elevate frazioni di legame rispetto alla maggior parte degli altri pozzi.In questa analisi rappresentativa, si può osservare una piastra con segnali di legame di fondo relativamente bassi nella maggior parte dei pozzi. Il segnale di legame positivo nel pozzo H3 ha mostrato una frazione di legame molto più alta di quella osservata per gli altri pozzetti a causa della sovraespressione della proteina legante la guanosina pentafosfato Hpt. Nelle placche rappresentative, diversi pozzi hanno mostrato segnali di legame di fondo relativamente più alti, come indicato dai punti interni relativamente forti osservati in molti pozzi, così come le frazioni di legame costantemente elevate osservate dopo la quantificazione.In particolare, alcuni target hanno anche fornito frazioni di legame variabili, come i falsi positivi. Per chiarire ulteriormente, i ricercatori hanno utilizzato proteine purificate per testare nuovamente il legame. Una volta identificate le proteine bersaglio, è possibile purificarle in omogeneità e confermare la forza e la specificità dell'interazione utilizzando DRaCALA, calorimetria di titolazione isotermica o altri metodi.L'identificazione delle proteine bersaglio di piccole molecole di segnalazione apre la strada a una comprensione approfondita dei ruoli che emergono dalla virulenza batterica alla biologia umana.

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Questo video descrive il metodo per analizzare l'interazione proteina-ligando mediante elettroforesi capillare di affinità di spostamento della mobilità. Questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare il comportamento di legame di una proteina con vari ligandi carichi.

Elettroforesi capillare con affinità di spostamento di mobilità: un metodo per analizzare le interazioni campione-ligando in base alla migrazione differenziale dei complessi proteina-ligando

Questo video dimostra l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando, una tecnica per lo screening sistematico ad alto rendimento delle proteine leganti il secondo messaggero nucleotidico intracellulare. Questa tecnica consente il legame diretto dei messaggeri con la proteina bersaglio sovraespressa nel lisato cellulare, bypassando la necessità di purificazione delle proteine.

Azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando: una tecnica ad alto rendimento per identificare le proteine intracellulari leganti il secondo messaggero nucleotidico batterico

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

I protocolli presentati descrivono due tecniche basate su enzimoimmunosaggio (ELISA) per l'indagine rapida delle interazioni ligando-recettore: Il primo dosaggio permette la determinazione della costante di dissociazione tra ligando e recettore. Il secondo dosaggio consente una rapida analisi di screening dei peptidi di bloccaggio per le interazioni ligando-recettore.

Un ELISA Based rilegatura e metodo concorrenza di determinare con rapidità interazioni ligando-recettore

Descriviamo qui un metodo per l'identificazione di proteine che legano piccole molecole utilizzando l'etichettatura di fotoaffinità. Il vantaggio di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare vivo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Il protocollo qui descrive le interazioni della proteina canale dello ione di hEAG1 purificato con la piccola molecola lipidica ligando fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato (PIP2). La misurazione dimostra che BLI potrebbe essere un metodo potenziale per lo screening di romanzo della piccolo-molecola ioni canale ligando.

Catturare la cinetica di interazione di una proteina di canale ionico con piccole molecole mediante il saggio di interferometria di Bio-strato

Un protocollo dettagliato per eseguire una titolazione ELISA è descritto. Inoltre, un algoritmo di romanzo è presentato per valutare titolazione ELISAs e ottenere una costante di dissociazione di legame di un ligando solubile ad un recettore di immobilizzato piastra di microtitolo.

Titolazione ELISA come un metodo per determinare la costante di dissociazione dell'interazione ligando del recettore

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione e purificazione di proteine che sono etichettati con isotopi stabili e successiva caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala Esperimenti di Termoforesi (MST).

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

Il metodo di autoradiografia è ordinariamente utilizzato per studiare l'associazione di radioligands per sezioni di tessuto per la determinazione qualitativa o quantitativa farmacologia.

Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

Scopri l'identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con DRaCALA in Escherichia coli. Questo metodo rapido e sensibile consente di studiare le interazioni proteina-ligando nei batteri.

Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con lazione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA) (Video) | JoVE Journal

Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA)

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