Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

L'obiettivo generale di questo metodo è etichettare i neuroni e le loro proiezioni assonali al fine di tracciarne le connessioni con nuclei cerebrali bersaglio o di origine di interesse. Questo metodo aiuta a rispondere a domande fondamentali nelle neuroscienze, come ad esempio i modelli di connettività tra diverse aree o sottopopolazioni neuronali del cervello, nonché il loro significato funzionale per un determinato circuito neurale. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'aumentata accuratezza del bersaglio durante le iniezioni del tracciante.

Questo viene ottenuto utilizzando apparecchiature ottiche di base per visualizzare i nuclei cerebrali marcati con fluorescenza. Un altro vantaggio di questo metodo è che consente il genotipaggio non invasivo di popolazioni di topi che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo di promotori neuronali. Durante il genotipaggio dei cuccioli, verificare l'espressione dei rispettivi marcatori fluorescenti utilizzando un puntatore laser con la lunghezza d'onda di eccitazione appropriata.

Nello stesso tempo, indossare occhiali con filtro che bloccano la lunghezza d'onda di eccitazione, ma lasciano passare la lunghezza d'onda di emissione. Puntare il laser sulla parte posteriore della testa o sul midollo spinale del soggetto in esame. Fare attenzione a non puntare il laser negli occhi del soggetto e mantenere breve l'esposizione al laser.

I marcatori fluorescenti eccitati dovrebbero essere visibili attraverso la pelle. Quando il topo è più anziano, i singoli neuroni dei tessuti prelevati possono essere identificati. Dopo aver anestetizzato il topo e verificato l'assenza di riflessi, rimuovere la pelle dal cranio e tagliare la pelle lungo la parte posteriore della testa fino alla metà del cranio.

In topi ancora più anziani di oltre un mese, la fluorescenza può essere osservata attraverso gli occhi dell'animale. Successivamente, utilizzando PBS ghiacciato, eseguire una perfusione transcardiaca dell'animale positivo al marcatore mediante un ago da 30 gauge; dopo cinque-dieci minuti, la maggior parte del sangue sarà stata rimossa. Quindi rimuovere il cervello ed estrarre la regione di interesse.

Qui, il corpo trapezoide, costituito da due bulbi prominenti nella regione ventrale del cervello, contiene la regione di interesse. I nuclei ventrali del corpo trapezoide o VNTB hanno inizio trasferendo la regione cerebrale di interesse espiantata in una piastra contenente soluzione di dissezione ossigenata. Quindi, fissare l'espianto con aghi da siringa da 30 gauge in modo che l'area da iniettare sia accessibile nella parte superiore.

Per l'iniezione, utilizzare pipette di vetro borosilicato tirate, prodotte in tre o quattro cicli di trazione. Caricare la pipetta con la seguente soluzione: sottounità B della tossina colerica coniugata con Alexa FLUORA 4 5 55, principalmente per il trasporto retrogrado.

Con il puntatore laser e le pipette di iniezione, tutti montati e pronti all'uso, procedere allineando il fascio sulla regione cerebrale o sulle cellule etichettate da iniettare. Osservare il campo attraverso gli occhiali con filtro passa-banda per individuare i neuroni su cui effettuare l'iniezione con la pipetta. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare la pipetta nell'area di interesse.

Quindi, utilizzando un iniettore a pressione impostato per erogare impulsi di 50 millisecondi a 15 PS, inietto la sostanza tracciante in due o dieci impulsi. Attendere da 10 a 15 secondi tra un impulso e l'altro in modo che il colorante iniettato possa diffondersi. Durante l'iniezione della tetraetilrodamina, stimolare elettricamente la regione mediante l'elettrodo di stimolazione che eroga impulsi TTL.

Assicurarsi che l'elettrodo sia messo a terra nella soluzione del bagno. Erogare otto impulsi TTL a otto volt ciascuno, della durata di 50 millisecondi, con intervalli di 50 millisecondi. Stimolare la regione con 10-20 ripetizioni di impulsi nell'arco di diversi minuti.

I nuclei cerebrali variano per dimensione, densità neuronale e tipi cellulari. Ciò significa che la durata e il numero di impulsi di pressione o elettrici potrebbero dover essere regolati per ottenere risultati ottimali di marcatura per una determinata regione cerebrale. Utilizzando il laser e gli occhiali protettivi, verificare il segnale del tracciante fluorescente.

Il colorante deve essere assorbito dalle cellule e diffondersi nell'area iniettata. Dopo l'iniezione, incubare i bulbi encefalici in liquido cerebrospinale artificiale ossigenato a temperatura ambiente per uno a quattro ore. Mantenere l'ossigenazione durante l'incubazione, quindi fissare il tessuto in paraformaldeide al 4%.

Il giorno successivo, in PBS durante la notte a quattro gradi Celsius, il tessuto può essere tagliato e montato per un'iniezione intermedia nel nucleo ventrale del corpo trapezoide, o VNTB. Utilizzando tetraetilrodina dextrina, si osserva che le proiezioni dal VNTB si estendono fino al nucleo mediale del corpo trapezoide, o MNTB. Successivamente, il MNTB è stato iniettato con colerite, subunità B, che ha marcato retrogradamente in modo evidente il VNTB.

In maggior dettaglio, i corpi cellulari dei neuroni enterici glicinergici del VNTB sembravano essere marcati successivamente. Il MNTB è stato iniettato con il marcatore retrogrado dextrina tri. A differenza del modello puntiforme della marcatura con CTB, la marcatura con dextrina tri era densa e simile a GOGI.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare i neuroni e i loro prolungamenti con un'accuratezza aumentata. La tecnica dimostrata ti aiuta a identificare le aree cerebrali e le sottopopolazioni neuronali coinvolte in un determinato circuito neurologico; una volta padroneggiata, la procedura di iniezione può essere eseguita in circa 30 minuti se effettuata correttamente. Questa procedura può essere facilmente combinata con altri metodi, come l'immunochimica o la chiarificazione del cervello, per rispondere ad ulteriori domande riguardanti la morfologia, la direzionalità o la funzionalità delle proiezioni neuronali e di altre strutture neuronali.