Name: Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Impara a tracciare le connessioni neuronali in espianti cerebrali di topo usando traccianti anterogradi e retrogradi con guida laser. Questa tecnica migliora la precisione di targeting e consente lo studio dei circuiti neurali.

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Supportato da NIH / NIDCD R01 DC esperimenti 011582. imaging sono stati effettuati presso l&#39;Università del Colorado Anschutz Medical Campus avanzata Luce Microscopia core supportato in parte dal NIH / NCRR Colorado CTSI Concessione Numero UL1 RR025780 e Disturbi Rocky Mountain Neurlogical Core Center sovvenzione NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac del Salk Institute ci ha fornito i topi GlyT2-GFP.

1. genotipizzazione ottico 1. Optical genotipizzazione del mouse Pups <ol><li> Controllare espressione del marcatore fluorescente rispettivo usando un puntatore laser di adeguata lunghezza d&#39;onda di eccitazione (405 nm negli esperimenti qui descritti) e corrispondenti occhiali filtro di blocco alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione, ma passando la lunghezza d&#39;onda di emissione (450-700 nm negli esperimenti qui descritti) . Puntare il puntatore laser sul retro della testa o del midollo spinale del cucciolo mouse (vedi Figura 1). Evitare che splende il laser negli occhi e lunga esposizione della pelle alla luce laser. </li></ol> 2. ottica genotipizzazione degli anziani animali <ol><li> Profondamente anestetizzare il mouse (di età compresa tra P14 a P138 negli esperimenti qui descritti), con una overdose di pentobarbital attraverso un&#39;iniezione intraperitoneale (120 mg / kg di peso corporeo). Confermare anestesia corretta verificando i riflessi degli animali (brevemente pizzicare la punta di the orecchio o una delle zampe posteriori per suscitare il riflesso retrazione dell&#39;orecchio o della gamba). </li><li> Nota: Nonostante l&#39;uso di una dose eccessiva di pentobarbital (120 mg / kg di peso corporeo) si fa riferimento alla procedura di iniezione come &quot;profonda anestesia&quot; invece di eutanasia, perché l&#39;animale è idealmente ancora vivo (cioè il suo cuore batte ancora), quando la chirurgia e la perfusione cominciano. Questo assicura una più efficiente perfusione degli organi interni compreso il cervello. </li><li> Una volta che l&#39;animale non mostra riflessi, rimuovere con attenzione la pelle sovrastante il cranio (Figura 2A) facendo un&#39;incisione nella pelle che copre la parte posteriore della testa e taglio al tronco del cranio. Esporre il cranio scoperto alla luce laser e osservare la fluorescenza attraverso gli occhiali filtro come descritto sopra. Se un segnale GFP positivo viene osservato, passare al punto 2, se non, sacrifica l&#39;animale attraverso decapitazione (secondo / garantendo forma di eutanasia seguendo il nostroRegolamenti IACUC). </li></ol> Nota: Nei topi, anche più grandi (&gt; 1 mese) la fluorescenza può essere osservata attraverso gli occhi dell&#39;animale. 2. transcardial Perfusione e Cervello Preparazione <ol><li> Profumato transcardiaca con tampone fosfato salino ghiacciata (PBS; NaCl: 137 mm, KCl 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1.76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mm) con una siringa ago da 30 G per rimuovere gran parte del sangue da l&#39;animale. <ol><li> Innanzitutto, aprire con cautela la gabbia toracica con forbici affilate e poi spingere l&#39;ago nel ventricolo sinistro del cuore. Avviare il pompaggio PBS nel cuore e l&#39;aorta e immediatamente dopo questa fase aprire nell&#39;atrio destro del cuore con le forbici per consentire al sangue di uscire dal corpo. Nota: perfusione richiede 5 - 10 min a seconda della taglia dell&#39;animale. </li></ol></li><li> Dopo dissanguamento mediante perfusione, decapitare il animali, garantire la sua testa con il perno needles (o 30 G aghi delle siringhe) da loro penetrante attraverso le orbite in un piatto preparato e rimuovere il cervello dal cranio. <ol><li> Innanzitutto, utilizzare forbici affilate per tagliare la pelle sovrapponendo cranio: fare una piccola incisione nella parte posteriore della testa, poi tagliare lungo la linea mediana sul lato dorsale della testa, tagliati ai lati appena caudalmente degli occhi dell&#39;animale e infine tagliato in direzione caudale rimuovere completamente i lembi di pelle nella parte posteriore della testa. </li><li> Successivamente, ripetere lo stesso schema di taglio per il cranio stesso, assicurarsi di rimuovere due coclee nel processo, perché questo semplifica notevolmente la rimozione del tronco cerebrale alla fine. Dopo questa procedura, la parte caudale del cervello dovrebbe giacciono completamente esposto. </li><li> Nella fase successiva, utilizzare una lama di rasoio affilata o un bisturi per tagliare attraverso tutta proencefalo ad un angolo di circa 45 ° e circa 2 mm rostrale dal cervelletto. Scoop fuori la metà anteriore separata del cervello con abspatola ent. </li><li> Utilizzare la spatola per elevare la parte caudale del cervello alla sua estremità rostrale e successivamente tagliare i nervi cranici che sono ancora collegate al tronco cerebrale sul lato ventrale. Come risultato finale, la parte caudale del cervello incluso il tronco cerebrale deve cadere liberamente fuori il resto della testa di animale preparato. </li><li> Capovolgere la parte caudale rimosso del cervello per esporre il suo lato ventrale e tagliare lungo il piano coronale solo rostrale (per le iniezioni anterograda) o semplicemente caudale (per le iniezioni retrogradi) delle &quot;lampadine&quot; ventrale situati contenenti il ​​corpo trapezoidale (vedere il passaggio 2.3). <ol><li> Utilizzare sempre una lama di rasoio affilata o un bisturi per la procedura di taglio per ridurre al minimo la morte cellulare causata da eccessiva sollecitazione meccanica sul tessuto. Come risultato finale, un espianto cervello attraversa circa 1 cm di lunghezza e contenente la completa oliva pontina lungo altre regioni del cervello avrebbe dovuto essere ottenuta. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Nota: Questo protocollo illustra la procedura di iniezione tracciante nel corpo trapezoidale situato nel tronco cerebrale uditivo. Adattare la posizione e l&#39;orientamento dei piani di taglio e siti di iniezione come necessario. Se le regioni cerebrali fluorescenti di interesse si trovano abbastanza vicino alla superficie del cervello, in modo che possano essere identificati e iniettati senza tagliare il cervello (vedere la Figura 2B), allora la fase di taglio coronale può essere omesso. <ol start="3"><li> Identificare il corpo trapezoidale come due ventrali &quot;lampadine&quot; di spicco che contengono il nucleo ventrale del corpo trapezoidale (VNTB). </li></ol> Nota: per ulteriori riferimenti anatomici per quanto riguarda la localizzazione stereotassica approssimativa di questi piani di taglio, vedere Franklin &amp; Paxinos, 2008. Panel 78 dell&#39;atlante, Bregma ~ -5.7 mm mostra il nucleo mediale del corpo trapezoidale (= MNTB) etichettato come &quot;Tz &quot;. Panel 69 mostra il nucleo ventrale del bo trapeziody (VNTB) etichettato come &quot;MVPO&quot; (medioventral nucleo periolivary) 19. 3. anterograda / retrograda Tracing Nota: Eseguire tutte le procedure di seguito a temperatura ambiente (25 ° C). <ol><li> Dopo il taglio, posizionare l&#39;espianto tronco cerebrale in un piatto preparato contenente ossigenata (95% O 2, CO 2 5%) dissezione soluzione (NaCl: 125 mm, KCl: 2,5 mm, MgCl 2: 1 mm, CaCl 2: 0,1 mm, il glucosio : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, acido ascorbico: 0.4 mM, mio-inositolo: 3 mM, acido piruvico: 2 mM), fissandolo con 30 aghi siringa G. Assicurarsi che la zona di iniezione è rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Tirare pipette iniezione da vetro borosilicato e riempirli con uno dei seguenti tre soluzioni: a) una soluzione di 1,0 mg / ml di choleratoxin subunità b coniugato ad un fluoroforo Alexa 555 in PBS 12-13 (utilizzato principalmente per il trasporto retrogrado), b ) un -d 1%ilution in soluzione fisiologica 0,9% di destrano tetramethylrhodamine 555 (3.000 MW, utilizzato principalmente per il trasporto retrogrado) oppure c) una diluizione, 1% in soluzione fisiologica 0,9% di 10.000 MW-destrano TRITC 555 (utilizzato principalmente per il trasporto anterogrado). <ol><li> Assicurarsi che le resistenze gamma pipetta di iniezione 2,5-3,5 MOhm e che sono fabbricati in 3 - 4 cicli di trazione. Per gli esperimenti qui descritti, ottenere ciò selezionando un algoritmo tirando preprogrammato sul estrattore pipetta. </li></ol></li><li> Illuminare l&#39;espianto del cervello utilizzando un puntatore laser montato in modo statico della lunghezza d&#39;onda appropriata (punto n ° 2 nella figura 3A; 405 nm di lunghezza d&#39;onda negli esperimenti qui descritti). Utilizzare il puntatore laser come guida per le iniezioni, e puntare il fascio laser verso il nucleo cerebrale fluorescente o cellule di interesse che verrà iniettato. </li><li> Trovare e osservare il fascio luminoso attraverso un microscopio binoculare mentre indossa gli occhiali filtranti compatibili (450 - 700 nm filtro passa banda negli esperimenti qui descritti). Inserire l&#39;elettrodo di iniezione tramite micromanipolatore nella zona di interesse. </li><li> Iniettare la sostanza tracciante. Le iniezioni sono composti da 2 - 10 impulsi di pressione a 15 psi per 50 msec ciascuno, utilizzando un dispositivo di iniezione a pressione, diretto perpendicolarmente nella regione di interesse (ROI) all&#39;interno della sezione cervello. Somministrare ogni impulso di pressione ad intervalli di 10 - 15 secondi per consentire il colorante di diffondersi. </li><li> Nel caso delle iniezioni tetramethylrhodamine (TRITC), inoltre stimolare elettricamente per migliorare l&#39;assorbimento di colorante attraverso elettroporazione con l&#39;elettrodo posto nella zona del cervello di interesse (MNTB e VNTB negli esperimenti qui descritti). <ol><li> Utilizzare 8 impulsi TTL di 8 volt per 50 msec con 50 msec inter intervalli, guidati da uno stimolatore e amplificati a 55 V con una unità di isolamento di stimolazione (articoli n ° 7 e 9 nella Figura 3B). Usare 10 - 20 ripetizioni di questo protocollo, amminitrato per diversi minuti 7,8. Assicurati di massa l&#39;elettrodo correttamente - il filo di terra deve essere collegato al soluzione del bagno! </li></ol></li><li> Controllare successo dell&#39;iniezione. Dal momento che un tracciante fluorescente con una lunghezza d&#39;onda di emissione è più anche emettendo un segnale fluorescente su eccitazione laser con lunghezza d&#39;onda più corte, per controllare visivamente il colorante captazione / diffondersi nella zona di destinazione iniettata mentre illuminando la zona con il laser e osservando attraverso gli occhiali del filtro. </li></ol> 4. Incubazione <ol><li> Dopo l&#39;iniezione, incubare le brainstems nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucosio 25 mM, NaH 2 PO 4: 1.25 mM, NaHCO 3: 25 mM, acido ascorbico: 0.4 mM, myo-inositolo: 3 mM, acido piruvico: 2 mM, bollito con 95% O 2 - 5% 2) a temperatura ambiente CO (RT, 25 ° C) per 1 - 4 ore, mentreil colorante viene trasportato. Bubble soluzione durante l&#39;intero periodo di incubazione. </li><li> Successivamente, trasferire i brainstems in 4% paraformaldeide (PFA) disciolto in PBS (circa 100 ml;. PH 7 per il mix PFA / PBS) e incubate a 4 ° C per consentire post-fissazione overnight (O / N). </li></ol> 5. Tessuto affettare e di montaggio <ol><li> Il giorno dopo, lavare il tronco cerebrale per tre volte in PBS (5 minuti per ogni fase di lavaggio), coprire nel 4% agar e poi tagliata a 50 - 80 micron di spessore fette su un vibratomo. Montare le fette con un mezzo di montaggio su un vetrino e coprioggetto. </li><li> Facoltativamente, etichettare le sezioni con Nissl fluorescente per 25 min (per esempio blu Nissl ad una diluizione 1: 100 in AB media). <ol><li> Per preparare AB media, mescolare 250 ml di 0,2 M tampone fosfato (PB; 51 KH MM 2 PO 4, 150 mm Na 2 HPO 4), 15 ml di 5 M di NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml DDH 2 O e 5 g albumina di siero bovino. </li><li> Precede e avere successo l&#39;etichettatura Nissl passo da 3 fasi di lavaggio in PBS (10 minuti ciascuno). </li></ol></li></ol> Nota: Nei casi in cui devono essere montati e analizzato sezioni più spesse (in esperimenti descritti qui tali fette erano 100 - 500 micron di spessore per mantenere i collegamenti assonale su distanze più grandi), la tecnica può essere combinata con compensazione dei tessuti. Abbiamo trovato il ClearT2 12 per avere successo 20. Quando un passo di compensazione tessuto è incluso, eseguire prima di montare sezioni.

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<li>Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235(2007).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Una forza generale in vitro tracciante elettroporazione, al contrario di studi in vivo tracciamento, è che dà ricercatori migliore accesso alla zona del cervello di interesse e quindi non comporta stereotassica costose (e spesso elettrofisiologico) attrezzature. Inoltre, il periodo di sopravvivenza richiesto per gli espianti cerebrali estende solo poche ore (1 - 4) invece di giorni o settimane nel caso di vivo iniezioni traccianti in (vedere una recensione dettagliata sull&#39;uso di ...

Per definire un certo (micro) circuito neuronale, si deve avviare da trovare vari partecipanti di detto circuito, e il loro modello di connessione. Da quando la pubblicazione di Waller su neurofiber rintracciare attraverso la lesione 1 una grande varietà di tecniche di tracciamento neuroanatomiche è stata stabilita. Alcune di queste tecniche possono essere applicate in tessuto fissato post mortem 2-4, altri si basano sul trasporto attivo del colorante nei neuroni vivi, come scoperto nel 1971 5-6. Quest&#39;ultimo può essere ulteriormente suddiviso in due gruppi discriminano tra metodi sfruttando retrograda attiva (dalla zona iniettata alla sorgente di sporgenze, cioè. Somata di neuroni che sono sporgenti da detta area) e anterograda attiva (dal iniettato zona al target di una data di proiezione, cioè. le proiezioni assonale ei terminali assonale dei neuroni marcati) di trasporto. Inoltre, in alcuni casi di tramateriale cer viene iniettato in animali vivi che poi sopravvivono l&#39;iniezione di diversi giorni o settimane (a iniezioni vivo tracciante), mentre in altri casi cervelli espiantati vengono iniettati e incubare per diverse ore dopo l&#39;iniezione di liquido cerebrospinale artificiale (in vitro iniezioni tracciante) . In questo protocollo abbiamo modificato uno esistente in vitro tecnica elettroporazione 7-8 per etichettare somata e processi neuronale nel anterograda e tracciamento retrogrado esperimenti usando choleratoxin subunità-b e tetramethylrhodamine destrano le sostanze tracciamento. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire neuroscienziati con uno strumento efficiente per tracciare modelli di connettività tra i diversi nuclei neuronali del cervello, usufruendo di linee disponibili topo transgenico ed apparecchiature ottiche di base al fine di aumentare la precisione di mira durante le iniezioni traccianti. Sebbene il metodo di anterograda e retrograda usando tracingcholeratoxin e ammina destrano e rispettivi coniugati fluorescente non è nuova 9-13 (come è il metodo di elettroporazione, per es. Haas et al. 14), la combinazione di iniezioni traccianti con elettroporazione in una preparazione in vitro coinvolgono blocchi di tessuto cerebrale è uno sviluppo più recente 7. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche di tracciatura neuronali utilizzando lo stesso tipo di coloranti traccianti di animali vivi è la maggiore intensità di etichettatura, a causa della maggiore efficienza con cui il colorante elettroporate viene ripreso dai neuroni. Un ulteriore vantaggio è il termine abbreviato di incubazione (necessario per il trasporto di colorante) e la sua maggiore accuratezza bersaglio durante l&#39;iniezione tracciante, perché lo sperimentatore ha il controllo visivo sull&#39;area bersaglio di iniezione. Quest&#39;ultimo significa anche che non costose apparecchiature stereotassica è richiesto per trovare il nucleo o il cervello area di interesse. Per addizionale aumentare la precisione di mira, abbiamo approfittato di una linea di topi transgenici, che esprime GFP nella sottopopolazione glicinergica di neuroni 15 ed apparecchiature ottiche di base che consistono di un puntatore laser portatile di 405 nm occhiali passa-banda di lunghezze d&#39;onda e la congruenza di filtraggio (450 - 700 nm). Così, abbiamo ottenuto un ulteriore significativo aumento di targeting accuratezza individuando la zona di iniezione attraverso il suo segnale fluorescente e fornendo un modo più fine di controllare per la diffusione di colorante all&#39;interno dell&#39;area di iniezione attraverso l&#39;osservazione dell&#39;interazione tra il segnale GFP indigena e il tracciante fluorescenza. La nostra tecnica permette anche di scoprire la funzionalità di un circuito con la sua connettività identificando neuroni inibitori GFP-positive (o eccitatorio in altre linee di topo), che sono stati riempiti con il tracciante. In sintesi, abbiamo ulteriormente migliorato un potente strumento per studiare la neuroscientifica connettoma del cervello dei vertebrati e valutare tha diverse caratteristiche neuroanatomiche di un determinato neurocircuit. Utilizzando topi transgenici con apparecchiature ottiche economico e largamente disponibile siamo stati in grado di aumentare significativamente la precisione di mira dei nostri iniezioni. Inoltre, i topi transgenici ha permesso di identificare il tipo di connessioni tracciate, che hanno contribuito scoprire la funzionalità di un microcircuito inibitorio nel tronco cerebrale uditivo.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tutti i prodotti chimici provengono da Sigma-Aldrich, se non diversamente specificato.</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio&nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio dibasico</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di</td><td></td> magnesio <td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di</td><td></td> calcio <td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td></td> di sodio <td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Acido</td><td></td> ascorbico <td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Mio-inositolo</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td></td> di sodio <td>P2256</td><td></td></tr><tr>Albumina <td></td><td>sierica bovina</td><td>A2153</td><td>opzionale, per ulteriore (immuno)istochimica</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>opzionale, per ulteriore (immuno)istochimica</td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico), 8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>opzionale, per la pulizia del cervello</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>opzionale, per la pulizia del cervello</td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td> della<td>subunità-b della coleratossina</td><td>C-34776 (Alexa 555)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td> <td>di destrane tetrametil-rodamina</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (blu)</td><td></td></tr><tr><td>opzionale Paraformaldeide</td> Fisher <td>Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>Fatal-Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filamenti di vetro borosilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore</td> per <td>pipette Zeitz Instruments, Germania</td><td>DMZ Estrattore</td><td></td>universale</tr><tr><td>Configurazione della perfusione</td><td>Puntatore laser su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td>Filtri/<td></td></tr><tr><td>occhiali di sicurezza</td><td>Dragon Lasers, China</td><td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio bionoculare&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, Svizzera</td><td>Wild M3</td><td>Dotato di illuminatore ad alta intensità (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>PC con installato il software MC Stimulus</td><td>Sistemi multicanale, Germania (software)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore a 2 canali</td><td>Sistemi multicanale, Germania</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Unità di isolamento per stimolazione</td><td>A.M.P.I., Israele</td><td>Micromanipolatore Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige, Giappone</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Germania</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal tracing negli espianti cerebrali a guida laser

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Presentiamo una tecnica che combina un protocollo in vitro iniezione tracciante, che utilizza una serie di impulsi elettrici, di pressione per aumentare colorante assorbimento attraverso elettroporazione in espianti cerebrali con illuminazione laser mirati e congrui occhialini filtro durante la procedura. La tecnica descritta di elettroporazione in vitro per sé produce relativamente buon controllo visivo rivolti determinate aree del cervello. Attraverso la combinazione con il laser di eccitazione di marcatori genetici fluorescenti e la loro lettura attraverso gli occhiali di filtro a banda passante, che possono raccogliere le emissioni dei geneticamente etichettati cellule / nuclei e il colorante tracciamento fluorescente, un ricercatore può aumentare notevolmente la precisione delle iniezioni trovando l&#39;area di interesse e di controllo per il colorante diffuso / assorbimento nella zona di iniezione molto più efficiente. Inoltre, la tecnica di illuminazione laser consente di studiare la funzionalità di un dato neurocircuit dal provIding informazioni sul tipo di neuroni che proiettano una certa area in casi in cui l&#39;espressione della GFP è legata al tipo di trasmettitore espressa da una sottopopolazione di neuroni.

Figure 1 e 2 mostrano come il puntatore laser e occhiali laser può essere usato al genotipo modo rapido ed economico GFP animali risultati positivi da una cucciolata. In caso di cuccioli di topo, la tecnica può essere utilizzata per identificare in maniera non invasiva etichetta GFP nel cervello dell&#39;animale attraverso il cranio e la pelle sovrastante (Figura 1A - D). Fluorescenza emessa può essere visto attraverso la pelle e il cranio del mouse cuccioli almeno fino al giorno postna...

Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura.

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

L'obiettivo generale di questo metodo è etichettare i neuroni e le loro proiezioni assonali al fine di tracciarne le connessioni con nuclei cerebrali bersaglio o di origine di interesse. Questo metodo aiuta a rispondere a domande fondamentali nelle neuroscienze, come ad esempio i modelli di connettività tra diverse aree o sottopopolazioni neuronali del cervello, nonché il loro significato funzionale per un determinato circuito neurale. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'aumentata accuratezza del bersaglio durante le iniezioni del tracciante.Questo viene ottenuto utilizzando apparecchiature ottiche di base per visualizzare i nuclei cerebrali marcati con fluorescenza. Un altro vantaggio di questo metodo è che consente il genotipaggio non invasivo di popolazioni di topi che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo di promotori neuronali. Durante il genotipaggio dei cuccioli, verificare l'espressione dei rispettivi marcatori fluorescenti utilizzando un puntatore laser con la lunghezza d'onda di eccitazione appropriata.Nello stesso tempo, indossare occhiali con filtro che bloccano la lunghezza d'onda di eccitazione, ma lasciano passare la lunghezza d'onda di emissio

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Questo video descrive la manipolazione di colture di neuroni utilizzando pinzette laser in vitro.

Utilizzando pinzette laser per manipolare i neuroni isolato in vitro

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

Fonte: Muto, A., et al. Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un laser a due fotoni e sua valutazione utilizzando l'imaging del calcio e la registrazione comportamentale nelle larve di zebrafish. J. Vis. Exp. (2018) In questo video,  Viene dimostrata una procedura di ablazione laser a due fotoni, che consente la distruzione selettiva dei neuroni fluorescenti in larve di zebrafish immobilizzate con agarosio. L'imaging ad alta risoluzione prima e dopo la procedura conferma...

Ablazione neuronale mirata mediante microscopia a due fotoni in una larava di pesce zebra

Cellule neuroprogenitor umane (NPC) sono stati ampliati in condizioni proliferanti. NPC sono stati differenziati in colture ricche di neuroni in presenza di una combinazione di neurotrofine. Marcatori neuronali sono state rilevate mediante immunofluorescenza. Per isolare una popolazione pura di neuroni, NPC sono stati differenziati sulla penna scivoli di membrana e cattura microdissezione laser è stata eseguita.

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Descriviamo un metodo per caratterizzare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti del proencefalo utilizzando un approccio optogenetico per fotostimolare popolazioni neuronali in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

Due fotoni di imaging, accoppiato ad nanodissection laser, sono strumenti utili per studiare processi degenerativi e rigenerativi nel sistema nervoso centrale con risoluzione subcellulare. Questo protocollo viene illustrato come etichetta, immagine e sezionare singole fibre di arrampicata nella corteccia cerebellare in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Descriviamo il trapianto intraparenchimale di cellule progenitrici neurali umane trasdotte con un doppio vettore reporter che esprime la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP) nel cervello del topo. Dopo il trapianto, il segnale della luciferasi viene ripetutamente misurato utilizzando bioluminescenza in vivo e cellule innestate che esprimono GFP identificate in sezioni cerebrali utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo

Impara a tracciare le connessioni neuronali in espianti cerebrali di topo usando traccianti anterogradi e retrogradi con guida laser. Questa tecnica migliora la precisione di targeting e consente lo studio dei circuiti neurali.

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

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