Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di marcare i neuroni e le loro proiezioni assonali al fine di tracciare le loro connessioni con i nuclei cerebrali bersaglio o sorgente di interesse. Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze come i modelli di connettività tra diverse aree o sottopopolazioni neuronali del cervello, nonché il loro significato funzionale per un dato circuito neuronale. Il vantaggio principale di questa tecnica è la maggiore precisione del bersaglio durante le iniezioni del tracciante.

Ciò si ottiene utilizzando apparecchiature ottiche di base per visualizzare nuclei cerebrali marcati in fluorescenza. Un altro vantaggio di questo metodo è che consente la genotipizzazione non invasiva di pop di topo che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo di promotori neuronali. Durante la genotipizzazione, i cuccioli controllano l'espressione dei rispettivi marcatori fluorescenti utilizzando un puntatore laser con la lunghezza d'onda di eccitazione appropriata.

Allo stesso tempo, indossare occhiali filtranti che bloccano la lunghezza d'onda di eccitazione, ma superano la lunghezza d'onda di emissione. Punta il laser verso la parte posteriore della testa o il midollo spinale del cucciolo in questione. Fare attenzione a non puntare il laser negli occhi dei P e mantenere l'esposizione laser breve.

I marcatori fluorescenti eccitati dovrebbero essere visibili attraverso la pelle. Quando il topo è più grande, è possibile identificare i singoli neuroni dei tessuti raccolti. Dopo aver anestetizzato il topo e verificato l'assenza di riflessi, rimuovere la pelle sopra il cranio, tagliare la pelle lungo la parte posteriore della testa fino alla parte centrale del cranio.

Nei topi più anziani di oltre un mese, la fluorescenza può essere osservata attraverso gli occhi dell'animale. Successivamente, utilizzando il ghiaccio PBS trans Cardi perfondere il marcatore positivo dell'animale utilizzando un ago da 30 gauge, dopo 5-10 minuti, la maggior parte del sangue verrà rimossa. Quindi rimuovi il cervello e seziona la regione di interesse.

Qui, il corpo trapezoidale, che è costituito da due bulbi prominenti nella regione ventrale del cervello, contiene la regione di interesse. I nuclei ventrali dei corpi trapezoidali o VNTB iniziano con il trasferimento della regione cerebrale espiantata di interesse in un piatto di soluzione di dissezione ossigenata. Lì. Fissare l'explan con aghi per siringa da 30 gauge in modo che l'area per l'iniezione sia accessibile dalla parte superiore.

Per l'iniezione utilizzare pipette per iniezione in vetro silicato Bo prodotte in tre o quattro cicli di estrazione. Caricare la pipetta con la seguente soluzione. Subunità B della tossina del colera coniugata ad Alexa FLUORA 4 5 55, che è principalmente per il trasporto retrogrado.

Con il puntatore laser e le pipette per iniezione, tutti montati e pronti per l'uso, procedere puntando il raggio verso la regione cerebrale marcata o le cellule da iniettare. Osservare il campo attraverso gli occhiali filtranti passa-banda per vedere quali neuroni colpire con la pipetta per iniezione. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare la pipetta nell'area di interesse.

Quindi, utilizzando un iniettore a pressione impostato per erogare impulsi di 50 millisecondi a 15 PS, inietto la sostanza tracciante in due o 10 impulsi. Lasciare passare da 10 a 15 secondi tra un impulso e l'altro in modo che il colorante iniettato possa diffondersi. Quando si inietta la rumina tetraetile, stimolare elettricamente la regione con l'elettrodo stimolante che eroga impulsi TTL.

Assicurarsi che l'elettrodo sia collegato a terra nella soluzione del bagno. Eroga otto impulsi TTL a otto volt ciascuno della durata di 50 millisecondi con intervalli di 50 millisecondi. Stimola la regione con 10-20 ripetizioni di impulsi nell'arco di diversi minuti.

I nuclei cerebrali variano in dimensioni, densità neuronale e tipi di cellule. Ciò significa che potrebbe essere necessario regolare la durata e il numero di impulsi di pressione e/o elettrici per ottenere risultati di marcatura ottimali per una determinata regione del cervello. Utilizzando il laser e gli occhiali, controllare il segnale del tracciante fluorescente.

Il colorante deve essere assorbito dalle cellule e distribuito intorno all'area iniettata. Dopo l'iniezione, incubare il tronco encefalico in liquido cerebrospinale artificiale ossigenato a temperatura ambiente per un periodo compreso tra una e quattro ore. Mantenere l'ossigenazione durante l'incubazione, quindi fissare il tessuto in aldeide paraforme al 4%.

Nella PBS durante la notte a quattro gradi Celsius del giorno successivo, il tessuto può essere tagliato e montato un'iniezione intergrado nel nucleo ventrale del corpo trapezoidale o VNTB. L'uso della destrina tetraetilrodina mostra che le proiezioni del VNTB si estendono al nucleo mediale del corpo trapezoidale, o MNTB. Quindi l'MNTB è stato iniettato con chole toin, subunità B, che ha etichettato notevolmente il VNTB.

Più in dettaglio, i somati delle cellule VNTB gliche enteriche sembravano essere marcati successivamente. L'MNTB è stato iniettato con l'etichetta retrograda destrina tri. A differenza del modello punteggiato dell'etichettatura CTB, l'etichettatura del trit con destrina era densa e simile a GOGI.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare i neuroni e i loro processi con maggiore precisione. La tecnica dimostrata ti aiuta a identificare le aree cerebrali e le sottopopolazioni neuronali che partecipano a un determinato circuito neuronale una volta padroneggiata, la procedura di iniezione può essere eseguita in circa 30 minuti se eseguita correttamente. Questa procedura può essere facilmente combinata con altri metodi come l'immunochimica o la pulizia del cervello per rispondere a ulteriori domande riguardanti la morfologia, la direzionalità o la funzionalità delle proiezioni neuronali e di altre strutture neuronali.