Isolamento e analisi della composizione delle piante cuticola lipidi poliestere monomeri
22 novembre 2015
I poliesteri lipidici costituiscono i componenti strutturali di due modificazioni della parete cellulare, la cuticola vegetale e le barriere di diffusione contenenti suberina. In questo video, descriviamo un metodo per depolimerizzare la cutina da foglie intere delipidate. Il metodo può essere applicato allo studio di mutanti compromessi nella biosintesi della cutina o della suberina.
Le piante vascolari dipendono da strati extracellulari che svolgono la funzione di barriere impermeabili tra i tessuti vegetali e l'ambiente esterno. Queste strutture associate alle cellule lipofile limitano l'infezione da agenti patogeni e regolano il trasporto passivo di gas, acqua e sostanze disciolte all'interno e all'esterno dei tessuti vegetali. Una barriera importante è la cuticola vegetale, una struttura complessa unica delle piante.
La cutina è un poliestere di glicerolo insolubile che costituisce la matrice strutturale della cuticola ed è associata a cere estraibili con solvente. Presentiamo qui una tecnica affidabile per analizzare la composizione dei poliesteri lipidici ed eliminare i lipidi dai tessuti vegetali. In questo protocollo, campioni di tessuto intero vengono raccolti, omogeneizzati e sottoposti a una serie esaustiva di estrazioni con solvente per rimuovere i lipidi solubili nel solvente, inclusi le cere cuticolari ed epicuticolari.
Triglicerolo nei lipidi di membrana. I campioni vengono quindi depolimerizzati nei rispettivi monomeri lipidici mediante metilisi catalizzata da metossido di sodio. Vengono aggiunti reagenti per la simulazione al fine di transmetilare i gruppi idrossilici nei corrispondenti derivati trimetilsililici, adatti all'analisi mediante cromatografia gassosa.
I residui derivati vengono quindi trasferiti in vial per GC e caricati nell'analizzatore A-G-C-M-S per l'analisi, generando un cromatogramma che caratterizza la composizione monomerica dei biopoliesteri presenti nei campioni estratti. In questo caso, raccogliamo campioni di foglie intere da piante di arabidopsis ANA di tipo selvaggio e da due mutanti maturi.
Per l'estrazione e l'analisi, aggiungere 0,5 grammi di tessuto in provette di vetro pulite, precedentemente risciacquate con cloroformio. Versare 100 millilitri di isopropanolo in un matraccio e aggiungere butilidrossi toluene fino a una concentrazione dello 0,01%. Il BHT è un antiossidante aggiunto per proteggere i doppi legami e gli acidi grassi dall'ossidazione durante le estrazioni con solvente. Riscaldare preventivamente il solvente in un bagno d'acqua a circa 85 gradi.
Aggiungere 25 millilitri di isopropanolo riscaldato per grammo di tessuto vegetale e incubare i campioni nel termoagitatatore a 85 gradi per 15 minuti. Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente, indossando protezioni per orecchie e occhi. Infine, frantumare i campioni con un omogeneizzatore per ottenere una dispersione omogenea, sigillare i tubi con tappi a vite e agitare a 100 RPM per uno o due minuti; centrifugare quindi i campioni a 800 G per 10 minuti.
Per separare la fase organica dai materiali di maggiore densità compattati nel pellet, rimuovere e scartare il soprannatante utilizzando una pipetta di Pasteur o una propipetta. Prestare attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo a temperatura ambiente e agitare i campioni durante la notte.
Centrifugare i campioni a 100 giri al minuto e scartare il soprannatante. Aggiungo 25 millilitri di una soluzione in rapporto due a uno di cloroformio e metanolo per grammo di tessuto, e agito i campioni durante la notte; quindi centrifugo e scarto la fase organica. Ripetere quindi questo processo utilizzando una soluzione in rapporto uno a due di cloroformio e metanolo.
Essiccare il pellet durante la notte e trasferire le provette dalla cappa a un essiccatore sotto vuoto contenente solfato di calcio anidro per disidratare i campioni per un periodo di almeno tre giorni o fino al raggiungimento di massa costante. Una volta che i campioni sono completamente essiccati, sono pronti per la deflourazione mediante metanolisi catalizzata da metossido di sodio. Aggiungere alle provette contenenti i tessuti secchi due soluzioni di standard interni utilizzando una siringa di vetro, partendo da 25 microlitri di decanoato di metile HETO e 25 microlitri di omega pentec e lattone.
Per avviare la polimerizzazione profonda, aggiungere 0,9 millilitri di acetato di metile ai campioni, seguiti da 1,5 millilitri di catalizzatore metossido di sodio e da 3,6 millilitri di metanolo. Incubare i campioni a 60 gradi per due ore con vorticosità periodica all'interno del sistema di reazione; i poliesteri lipidici reagiscono con gli anioni metossido nucleofili formando intermedi tetraedrici instabili, che si dissociano facilmente in acidi grassi, esteri metilici e anioni ossido. Questi ossidi sono basi coniugate e reagiscono con il metanolo rigenerando gli anioni metossido cataliticamente attivi, sostenendo così ulteriori reazioni di polimerizzazione profonda.
Se nell'ambiente è presente acqua, reagirà con il metossido di sodio formando idrossido di sodio, una base forte che converte irreversibilmente i poliesteri in acidi grassi liberi indesiderati. Per evitare l'idrolisi, invece dei gas, viene aggiunto acetato di metile per rimuovere qualsiasi traccia di idrossido di sodio presente nel sistema.
Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, estrarre i monomeri aggiungendo 10 millilitri di diclorometano a ciascun tubo. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di acido acetico glaciale per acidificare i campioni.
Riempire i tubi con soluzione di cloruro di sodio 0,5 molare, vortexare accuratamente e centrifugare per minuti. Sotto cappa. Trasferire con attenzione la fase organica inferiore mediante pipetta in tubi medi puliti e pre-risciacquati.
Lavare nuovamente i campioni con soluzione salina, vortexare e centrifugare per 10 minuti. Rimuovere la fase acquosa superiore, quindi aggiungere solfato di sodio anidro ai campioni come agente essiccante per rimuovere le tracce di acqua rimaste in soluzione; vortexare i campioni, centrifugare e trasferire il solvente in provette piccole e pulite, precedentemente risciacquate. Caricare le provette in un evaporatore ad azoto per evaporare il solvente ed ottenere residui secchi di monomeri. Utilizzando una siringa di vetro, aggiungere 100 microlitri di purina e 100 microlitri di B-S-T-F-A per convertire i gruppi idrossilici in derivati volatili di trimetil silile.
Incubare i campioni a 100 gradi per 10 minuti. Lasciare raffreddare le provette ed evaporare sotto flusso di gas azoto. Aggiungere 500 µL di una soluzione uno a uno di EPTANO e toluene per sciogliere i residui, quindi centrifugare brevemente.
Trasferire i campioni derivatizzati in vial per gascromatografia contenenti inserti da 400 microlitri. Chiudere i vial e caricare i campioni in un gascromatografo, che li inietta in una colonna capillare per l'analisi; gli eluati vengono quindi rilevati da uno spettrometro di massa a quadrupolo. I dati grezzi ottenuti dall'analisi GC-MS vengono elaborati e presentati come cromatogramma per ciascun campione.
I singoli monomeri corrispondenti a diversi picchi cromatografici vengono identificati in base ai rispettivi spettri di massa specifici. Nei tempi di ritenzione in gascromatografia, le quantità dei singoli monomeri vengono determinate mediante il metodo dello standard interno per la quantificazione, consentendo di effettuare confronti tra i campioni per quanto riguarda abbondanza e composizione dei monomeri. Qui vengono mostrati cromatogrammi sovrapposti provenienti da analisi rappresentative di monomeri rilasciati da tessuto fogliare di ascesso di coniglio, corrispondenti al tipo selvaggio e a due alleli mutanti di un gene che codifica un enzima P quattro 50 monoossigenasi, che mostrano profili monomerici distinti.
I nostri risultati dimostrano differenze significative nell'abbondanza di tre monomeri principali del cutina, in piante di arabidopsis wild type e mutanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per analizzare la composizione dei poliesteri lipidici vegetali, mediante l'isolamento, l'identificazione e la quantificazione dei rispettivi monomeri costitutivi. La procedura è scalabile e può essere facilmente adattata per elaborare grandi quantità di diversi materiali vegetali, inclusi radici, semi, foglie e altri tessuti interi.
Questa tecnica è applicabile a studi che indagano la regolazione della biosintesi e la distribuzione di cutina e suberina nelle piante superiori.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la depolimerizzazione della cutina da foglie delipidate, essenziale per lo studio della biosintesi della cuticola vegetale e della suberina. La tecnica consente ai ricercatori di analizzare i poliesteri lipidici e la loro composizione monomerica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Chimica biochimica
- Fisiologia vegetale
Sfondo
- I poliesteri lipidici sono fondamentali per le modifiche della parete cellulare vegetale.
- La cuticola vegetale funge da barriera impermeabile e regola il trasporto.
- La cutina è un componente chiave della cuticola, composto da poliesteri lipidici glicerolici.
- Comprendere la composizione lipidica aiuta nello studio delle risposte delle piante allo stress ambientale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per analizzare i poliesteri lipidici nei tessuti vegetali.
- Studiare la composizione della cutina e il suo ruolo nella fisiologia vegetale.
- Facilitare la ricerca su mutanti con biosintesi alterata della cutina o della suberina.
Metodi Utilizzati
- Raccolta e omogeneizzazione di campioni interi di foglie.
- Estrazioni con solventi in sequenza per rimuovere i lipidi solubili.
- Depolimerizzazione dei poliesteri lipidici mediante metossido di sodio.
- Cromatografia gassosa-spettrometria di massa (GC-MS) per l'analisi della composizione monomerica.
Risultati principali
- Estrazione e analisi con successo di monomeri lipidici da tessuti vegetali.
- Caratterizzazione della composizione monomerica dei biopoliestri.
- Identificazione delle differenze nei profili lipidici tra piante di tipo selvatico e piante mutanti.
- Dimostrazione dell'affidabilità del metodo per studi futuri.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficace per lo studio dei poliesteri lipidici nelle piante.
- Le informazioni ottenute possono migliorare la comprensione delle funzioni del cuticolo e della suberina vegetali.
- Questa tecnica può essere applicata a diverse specie vegetali e a mutanti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi composizionale dei poliesteri lipidici della cuticola vegetale consente un'indagine precisa delle vie biosintetiche e della validazione funzionale dei geni nei sistemi vegetali. Questo metodo fornisce dati quantitativi solidi, essenziali per la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nei processi biotecnologici agricoli. La sua scalabilità e adattabilità supportano lo screening su tutta la linea di prodotti di modifiche genetiche che influenzano la biosintesi di cutina e suberina.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente la validazione funzionale di geni candidati coinvolti nella biosintesi di cutina e suberina.
- Supporta la riduzione dei rischi meccanicistici quantificando le variazioni nei monomeri in linee geneticamente modificate.
- Facilita la chiarificazione del percorso metabolico attraverso l'analisi comparativa di tessuti wild type e mutanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce flussi di lavoro standardizzati e riproducibili per l'isolamento e la quantificazione di monomeri di poliestere lipidico.
- Genera risultati quantitativi adatti per lo screening ad alto rendimento di linee vegetali.
- Permette lo sviluppo di saggi per studi genetici diretti e inversi volti a modifiche della parete cellulare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla scoperta traslazionale di biomarcatori collegando i profili dei monomeri a caratteristiche fenotipiche.
- Supporta la continuità dalla manipolazione genetica alla validazione del fenotipo biochimico.
- Fornisce indicazioni per l'avanzamento mirato al rischio di linee vegetali ingegnerizzate con proprietà di barriera modificate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro analitico collega la fase iniziale della scoperta, il screening genetico e la validazione traslazionale nella ricerca e sviluppo di biotecnologie vegetali.
- Biologia della scoperta: Il profilo quantitativo dei monomeri supporta la verifica delle ipotesi e l'elucidazione dei percorsi metabolici.
- Screening: I risultati standardizzati di GC/MS consentono confronti riproducibili tra diversi genotipi e trattamenti.
- Analisi: La quantificazione mediante standard interno fornisce dati robusti e confrontabili per l'analisi incrociata dei campioni.
- Ricerca traslazionale: I dati sulla composizione dei monomeri guidano la selezione dei tratti successivi e la valutazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo è adattabile a diverse specie vegetali e tipi di tessuto, sostenendo ampie iniziative di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella funzione genica e nell'ingegneria dei percorsi metabolici.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro analitici scalabili, riproducibili e quantitativi.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di avanzamento o interruzione per le linee vegetali ingegnerizzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio di bersagli genetici e programmi di sviluppo di caratteri.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biochimica vegetale e chimica analitica.
- Richiede l'accesso a strumentazione GC/MS e standard interni validati.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi per la preparazione dei campioni e l'analisi dei dati.
- Adattabile a diverse specie vegetali e tipi di tessuto con un'ottimizzazione del protocollo.
- La capacità di elaborazione dei campioni e la sicurezza nella manipolazione dei solventi devono essere gestite per l'ingrandimento della scala.
