Name: Isolamento e analisi della composizione delle piante cuticola lipidi poliestere monomeri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Scopri un metodo per isolare e analizzare i monomeri di poliesteri lipidici della cuticola vegetale mediante estrazione con solventi, depolimerizzazione catalitica e GC-MS. Questa tecnica consente di studiare la biosintesi della cutina e della suberina in Arabidopsis e altre specie.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NSERC-USRA per la ricerca in scienze naturali e ingegneria a S.J. e da una sovvenzione NSERC-Discovery a I.M. Ringraziamo Richard Bourgault, Meghan Rains e Amanda Fluke per l'assistenza tecnica. I semi dei mutanti att1-1 e att1-2 sono stati gentilmente forniti dal Dr. Jian-Min Zhou, Istituto di Genetica e Biologia dello Sviluppo, Pechino, Cina.

Nota: Questo protocollo è stato adattato da Bonaventura et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Passi 1-5 sono riassunti nella figura 1. 1. Tissue delipidizzazione Nota: Sciacquare sempre la vetreria e cappellini con cloroformio, lasciando asciugare sotto cappa, prima di utilizzare. ATTENZIONE: Eseguire omogeneizzazione dei tessuti e tutte le misure di trasferimento di solvente sotto cappa; indossare sempre camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza iniziale per evitare il contatto diretto con i prodotti chimici e per proteggere i campioni dalla contaminazione. <ol><li> Bagnomaria Preriscaldare e blocco termico a 85 ° C. </li><li> Pesare circa 0,5 g di ciascun campione in foglia 20 mm provette di vetro pre-pesato x 125 mm con politetrafluoroetilene (PTFE) tappi a vite -faced. Include quattro repliche per campione. </li><li> Mettere 2-propanolo in una beuta (circa 125 ml, 25 ml per g di sample). Aggiungere 2,6-di-tert-butil-4-metilfenolo (noto anche come idrossitoluene butilato, BHT) ad una concentrazione finale di 0,01% (w / v). Nota: Aggiungere BHT da un 5% (w / v) di soluzione stock in metanolo (BHT aiuta minimizzare l&#39;ossidazione degli acidi grassi insaturi). </li><li> Preriscaldamento soluzione 2-propanolo a 85 ° C a bagnomaria. </li><li> Aggiungere 12 ml calda 2-propanolo solvente ogni provetta e calore per 15 min a 85 ° C in blocco termico. Questo passaggio inattiva lipasi che possono essere rilasciati dalle cellule distrutte. </li><li> Lasciare raffreddare tubi a temperatura ambiente e macinare accuratamente tessuto con omogeneizzatore fino ad ottenere una sospensione omogenea. </li><li> Mettere i campioni in un agitatore orbitale e agitare per 1-2 ore a 100 giri al minuto e la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 800 xg e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere un volume equivalente di 2-propanolo e agitare per 12 ore a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 800 xg e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 12 ml di CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, v / v) a residuo (25 ml per g di materiale) e agitare per una notte a 100 rpm e la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 800 xg e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, v / v) a residuo e agitare per una notte a 100 rpm e la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 800 xg e rimuovere il solvente. </li><li> Lasciate asciugare i campioni sotto cappa notte a temperatura ambiente. </li><li> Asciugare il residuo e poi posto in un essiccatore sotto vuoto ad anidro CaCl 2 o CaSO 4 fino a peso costante a raggiungere (3-5 giorni). </li></ol> 2. Depolimerizzazione: metanolisi con sodio Methoxide (Figura 2) ATTENZIONE: Eseguire i passaggi 2,3-2,4, 2,7-2,8, 2,10-2,11, 2,13-2,15 e 2,17-2,18 sotto cappa; indossare sempre camice da laboratorio, guanti e occhiali di protezione spruzzi. <ol><li> Blocco termico Preriscaldare a 60 ° C. </li><li> Pesare provette contenenti il ​​residuo secco (importante per ulteriori calcoli). </li><li> Aggiungi standard interni in ogni provetta: 25 ωL heptadecanoate metile (1 mg / ml azione) e 25 ml ω-pentadecalactone (1 mg / ml azione). </li><li> Aggiungere 0,9 ml di acetato di metile, 1,5 ml di sodio metilato, e 3,6 ml di metanolo per ciascuna provetta e tappo. In alternativa, preparare una miscela di reazione con questi tre reagenti e aggiungere aliquote 6 ml per ogni campione. </li><li> Campioni di calore per 2 ore a 60 ° C e vortice periodicamente a intervalli di 15 min. </li><li> Lasciate raffreddare i campioni a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 10 ml di cloruro di metilene (CH 2 Cl 2) e 1,5 ml di acido acetico glaciale per estrarre gli esteri metilici degli acidi grassi. </li><li> Aggiungere la soluzione salina (0,5 M NaCl) per riempire ogni provetta e tappo. </li><li> Campioni vortex per 1 min e centrifugare per 10 min a 800 x g. </li><li> Trasferire la fase organica (inferiore) per pulire i tubi di medie dimensioni (16 x 125 mm, provette di vetro con politetrafluoroetilene (PTFE) tappo a vite -faced). </li><li> Aggiungere la soluzione salina (0,5 M NaCl) per riempire ogni provetta e tappo. </li><li> Campioni vortex per 1 min e centrifugare per 10 min a 800 x g. </li><li> Rimuovere fase acquosa (superiore) e ripetere i passaggi 2,11-2,12. </li><li> Rimuovere tutti i fase acquosa (superiore). </li><li> Aggiungere solfato di sodio anidro (Na 2 SO 4) al solvente, tappare i tubi e vortex per 1 min; campioni possono ora essere lasciati fino al giorno successivo. A questo punto i campioni possono essere lasciati durante la notte sotto la cappa. </li><li> Centrifugare per 2 min a 800 xg per compattare il Na 2 SO 4 sale nel fondo. </li><li> Trasferire la fase organica in una provetta monouso bicchiere piccolo (13 x 100 mm provette di vetro con politetrafluoroetilene (PTFE) tappo a vite -faced). </li><li> Far evaporare il solvente a secco sotto azoto e procedere con il passo derivatizzazione. Se non vengono trasformati subito, negozio evaporato a -20 ° C (campioni possono essereLSO immagazzinato prima della fase di evaporazione). </li></ol> 3. Preparazione dei derivati ​​per gascromatografia ATTENZIONE: Eseguire i passi 3.1.2 e 3.1.5 - 3.1.8 sotto una cappa; indossare sempre camice da laboratorio, guanti e occhiali di protezione spruzzi. <ol><li> Derivati ​​trimetilsilil <ol><li> Preriscaldare il blocco termico a 100 ° C. </li><li> Aggiungere 100 ml di piridina e 100 ml di BSTFA (N, O Bis-trimetilsilil-trifluoroacetammide) per ogni tubo e cappuccio. </li><li> Campioni di calore a 100 ° C per 10 min. </li><li> Lasciate raffreddare i campioni a temperatura ambiente. </li><li> Evaporare campioni sotto azoto a temperatura ambiente. Evitare l&#39;applicazione di calore per campioni, monomeri sono altamente volatili, in questa fase. </li><li> Aggiungere 500 ml di 1: 1 (v / v) eptano: toluene. </li><li> Campioni vortex per 1 minuto e centrifugare per 2 min a 800 x g. </li><li> Aggiungere esempi di fiale GC e procedere dell&#39;analisi GC / MS. </li></ol></li><li> Acetilderivati Nota: Per acetilazione, modificare passaggi 3.1.1-3.1.3 sopra come segue (non mostrato in video); passi 3.1.4-3.1.8 sono gli stessi: <ol><li> Blocco termico Preriscaldare a 60 ° C. </li><li> Aggiungere 100 ml di piridina e 100 ml di anidride acetica (At 2 O) ai tubi. </li><li> Campioni di calore 1 ora a 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS Analysis <ol><li> Utilizzare una capillare colonna HP-5 (30 mx 0,25 mm x 0,25 di spessore micron film) o equivalenti (es., 5% difenil, il 95% dimetilpolisilossano). Programma il GC con gas di trasporto elio flusso fissato a 1,5 ml / min e la temperatura del forno programmata da 150 a 300 ° C a 3 ° C / min. </li><li> Utilizzare iniezione split (divisione rapporto 1:10) e impostare spettrometro di massa modalità per eseguire la scansione su 40-600 amu (impatto elettronico di ionizzazione). </li><li> Creare una tabella di sequenza inclusi solventi (in bianco), WT e repliche mutanti, ciascuno utilizzando il metodo di analisi cutina indicato. </li><li> Carico di solventee fiale di campione sulla giostra, aggiungere esano per fiale-siringa risciacquo nel campionatore automatico, se necessario, e avviare la sequenza. Dopo la sequenza è completata, tracce di ioni totali cromatogramma sono disponibili per tutti i campioni. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Identificare monomeri lipidi poliestere confrontando spettro di massa di ogni picco di spettri di massa pubblicato oppure cercando una libreria commerciale, se disponibile. </li><li> Per ogni picco individuati nel totale cromatogramma corrente ionica, utilizzare i rispettivi tempi di ritenzione per trovare le aree sul tavolo risultati di integrazione dal software GC / MS (Supplemental Figura 1). </li><li> Per ogni monomero (colonne AB), aggiungere i valori dell&#39;area trovano nella tabella integrazione (riferimento figura 1, colonna D) alla colonna corrispondente per ogni replicare campione nella tabella Excel di monomeri (File di riferimento 2, colonne CF), che è un foglio di calcolo per quantificare Arabidopsisderivati ​​cutina TMSI. Utilizzare file supplementare 3 se derivati ​​acetilati si preparano invece. </li><li> Aggiungere le aree delle norme interne (IS) alle colonne IS (HK). Per quei monomeri che non sono derivatizzata, esteri metilici cioè grassi acidi (fames) ed esteri dell&#39;acido dimetilici dicarbossilici (DCA DME), utilizzare 17: 0 FAME (IS1) come IS per quantificazione (cellule viola-ombreggiata nella tabella monomero; Supplemental File 2/3). Ai monomeri idrossilati, tra cui alcoli primari, acido ferulico e acidi ω-idrossi, utilizzare 15: 0 FAME 15-idrossi (IS2) come IS di scelta per la quantificazione composto (cellule verdi shadded nella tabella monomero; Supplemental file 2/3) . </li><li> Aggiungere a secco peso foglia per ogni replica alle colonne AX-BA (File supplementare 2) o AQ-AT (File supplementare 3); in alternativa, eseguire la scansione di foglie di calcolare superfici e aggiungere i valori dell&#39;area alla tabella monomero di esprimere carichi monomeri per unità diarea di superficie. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

A differenza di altri biopolimeri come il DNA e le proteine, poliesteri pianta di lipidi non sono fatti da un modello. Invece, le loro composizioni dipendono dalla specificità degli enzimi presenti nei tessuti che rendono questi polimeri extracellulari. Come tale analisi, chimica del componente componenti sono fondamentali per capire composizione di poliestere lipidica. Metodi chimici di fendere le obbligazioni estere includono saponificazione, idrogenolisi, transmetilazione acido-catalizzata, e la base-catalizzata transmetilazione 2. Ciascuno di essi presenta vantaggi e svantaggi. Saponificazione produce grassi idrossi acidi liberi che possono subire reazioni secondarie. Idrogenolisi con litio alluminio idruro (LiAlH 4) 16 è stato utilizzato per l&#39;analisi cutina 7. Idrogenolisi riduce carboni funzionalizzati per alcoli e delle strutture originali devono essere dedotto da deuteriolysis con deuteruro litio alluminio (LiAlD 4). Ilsvantaggio di questo approccio è il requisito di alta risoluzione GC / MS per confrontare il grado di deuteriation dei polioli grassi ottenuti per fare assegnazioni delle loro strutture. Transesterificazione acido-catalizzata con metanolica trifluoruro di boro (BF 3) è stata spesso utilizzata in cutina e suberina depolymerizations 8,17,18, ma il reagente ha una durata limitata e può introdurre artefatti dovuti a lato reazioni 15. Acido solforico metanolica produce anche esteri metilici dei monomeri, ma con proporzioni maggiori di acidi grassi 2-idrossi, che presumibilmente non sono veri componenti lipidici poliestere, rispetto ad altri metodi 10. Il metodo transesterificazione catalizzata Naome descritto in questo protocollo produce esteri metilici di acidi grassi che sono derivatizzati da sililazione dei gruppi ossidrilici, fornendo caratteristiche spettri di massa per l&#39;identificazione o per acetilazione di fornire più derivati ​​stabili di gruppi ossidrilici for quantificazione. Uno svantaggio di questa tecnica è che compete con l&#39;idrolisi transesterificazione presenza di acqua nella reazione. Acqua reagisce con Naome (catalizzatore) e produce NaOH, che a sua volta idrolizza grassi esteri metilici acido per produrre acidi liberi (Figura 2D). Questa è una reazione collaterale indesiderabile perché due picchi saranno presenti per ogni acido grasso: un estere metilico e un estere derivato TMSI, complicando così l&#39;analisi. Utilizzando reagenti anidri e aggiungendo acetato di metile come co-solvente di competere con saponificazione sono passaggi così cruciali per prevenire l&#39;idrolisi (Figura 2D). Cutin e suberina contengono tra l&#39;1 e il 26% glicerolo 4. Tuttavia, questo monomero non viene rilevata dalle condizioni sperimentali descritte in questo protocollo. Il glicerolo è altamente idrofila e, a differenza degli acidi grassi monomeri di estere metilico, sarà eliminato durante le fasi acquose di lavaggio con solvente. Questa limitazione anchepplies ad altri metodi di depolimerizzazione cutina, ma glicerolo possono essere determinati nello strato acquoso ottenuto dopo transesterificazione utilizzando un metodo enzimatico. In alternativa, può essere quantificato utilizzando condizioni più blande (ad es., 0,05 M Naome) senza ulteriore estrazione dell&#39;acqua per rilevare tutti monomeri, compresi glicerolo 19,20 .Anche se utile ai fini della quantificazione glicerolo, condizioni blande solito danno depolimerizzazione incompleta di cutina e suberina. Se un GC accoppiato ad un rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID) è disponibile, tutte le repliche possono essere analizzati in questo strumento a fini quantitativi, dopo i picchi di un campione rappresentativo sono stati identificati mediante GC / MS. In alternativa, i monomeri in GC / FID tracce possono essere identificati se i loro indici di ritenzione sono noti. Il rivelatore a ionizzazione di fiamma ha particolarmente elevata sensibilità ed una vasta gamma di proporzionalità, che è fondamentale per la quantificazione della maggiori e minori componenti di esempioin corse singole. Inoltre, è robusto e facile da mantenere e far funzionare 15. Il protocollo descritto consente l&#39;affidabile e riproducibile isolamento, l&#39;identificazione e la quantificazione degli impianti lipidici monomeri poliestere, permettendo la caratterizzazione chimica di mutanti che differiscono nella composizione di uno o più monomeri di poliestere lipidi. La procedura è scalabile, può essere facilmente adattato per elaborare sia piccole e sfusi quantità di vari materiali vegetali, tra radici, semi, foglie, steli e fiori. Dati spettrali di massa di lipidi monomeri poliestere da molte specie sono stati pubblicati ad es., 21-26 e costituiscono risorse preziose per identificare monomeri sconosciuti quando adattare questo protocollo ad altri tessuti e / o specie. Questo metodo è applicabile alle indagini della biosintesi, la regolamentazione e la distribuzione di poliesteri di lipidi nelle piante superiori.

Piante vascolari si basano su livelli extracellulari che fungono da barriera impermeabile tra tessuti vegetali e l&#39;ambiente esterno. Queste strutture associate parete cellulare lipofilo limitano infezione patogena e regolano il trasporto passivo di gas, acqua e sostanze disciolte in e fuori di tessuti vegetali 1. Tali ostacoli sono la cuticola impianto, una struttura unica per synapomorphic piante 2, e le diverse barriere di diffusione-suberina contenente. La cuticola è uno strato oleophilic sintetizzata dalle cellule epidermiche e legato a loro tramite uno strato pectinaceous sul lato extracellulare della parete cellulare 3-5. Esso racchiude gli organi aerei primarie di piante superiori, funzionando come interfaccia vitale tra tessuti vegetali e l&#39;ambiente. Cutin, la matrice strutturale della cuticola, e suberina sono due poliesteri glycerolipid insolubili associati con cere solventi estraibili 2,4. Questi polimerico lipids sono composti derivati ​​degli acidi grassi saturi e insaturi e sono strutturalmente e funzionalmente simili. Tuttavia, essi si distinguono per differenze caratteristiche nei siti composizione e deposizione chimica. Suberina è un poliestere alifatico situato all&#39;interno delle pareti cellulari di alcuni tessuti esterni ed interni formando una parete secondaria. Tessuti Suberized includono periderms di radici, tuberi e corteccia degli alberi, endodermis radice, strati cappotto di semi, e le ferite rimarginate 2. A differenza cutina, poliestere suberina genere contiene alcoli, saturi e acidi dicarbossilici monoinsaturi, e una gran parte di monomeri-molto-lunga catena (C≥20). Cutin è il più abbondante in poliestere lipidico piante vascolari 6, ed è composta da glicerolo e derivati ​​di acidi grassi C16-C18 interesterificato, come idrossi e idrossi-sostituito epossidiche acidi grassi 4. Mentre la composizione di polimeri cutinavaria tra le specie tracheophyte, i monomeri principali predominanti sono 10, 16-diidrossi 16: 0, 18-idrossi-9,10-epossi 18: 0, e 9,10,18-triidrossi 18: 0 acidi grassi. È interessante notare che, foglie e gambo Arabidopsis cutina è principalmente composto da 18: 2 dicarbossilico 7,8. Cuticole pianta presente anche una notevole variabilità di spessore, da pochi nanometri a diversi micrometri 9. Poiché isolamento cuticola è un passo laboriosa e che richiede tempo, particolarmente per cuticole foglia molto sottili, come quelli di Arabidopsis thaliana 8, metodi che non utilizzano isolamento cuticola sono stati sviluppati e validati 7,8. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la composizione monomero di cutina in foglie Arabidopsis thaliana da metilato sodico (Naome) depolimerizzazione -catalyzed e gascromatografia successiva / spettrometria di massa (GC / MS) analisi. Questo protocollo offre un metodo affidabile per saggiare il comPosition di poliesteri pianta di lipidi in interi tessuti delipidato, ed è stato adattato da protocolli precedentemente riportati 7,10,11. Campioni di tessuto integrali sono prima omogeneizzati ed esaustivo delipidato, eliminando i lipidi solventi estraibili, tra cui cuticolare e cere epicuticolari, lipidi di membrana, e trigliceridi. Residui arricchita di parete cellulare vengono poi depolimerizzati nei loro costituenti monomeri di esteri metilici da sodio metilato-catalizzata metanolisi. Grassi esteri metilici degli acidi vengono estratti su acidificazione, e derivatizzati per ottenere i loro derivati ​​trimetilsilileteri o acetil corrispondenti. Residui derivatizzati sono altamente volatili, e possono essere eluiti da una colonna gascromatografica ad una temperatura ragionevole senza alterarne la conformazione strutturale durante l&#39;analisi GC / MS.

<table><tbody><tr><td>Prodotti chimici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvente per delipidazione</td></tr><tr><td>Solfato di sodio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Anidride acetica</td><td>Sigma Aldrich 320102</td><td></td><td>Agente di derivatizzazione</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimetilsilil)-trifluoroacetammide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Agente di derivatizzazione</td></tr><tr><td>Idrossitoluene butilato (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antiossidante</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Agente essiccante</td></tr><tr><td>Suflate di calcio anidro (DRIERITE- 8 MESH con indicatore)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Agente essiccante</td></tr><tr><td>Cloroformio (triclorometano)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Agente di acidificazione</td></tr><tr><td>Gas vettore elio, aria compressa</td><td>Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Gas vettore, GC/MS</td></tr><tr><td>Eptano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Esani</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Solvente</td></tr> <tr><td>organicoMetanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Solvente organico, reattivo alla transmetilazione</td></tr><tr><td>Acetato di metile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Metil eptadecanoato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Standard interno (1mg/mL stock)</td></tr><tr><td>Dicloruro di metilene (diclorometano)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Azoto, compresso</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Gas di trasporto, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolattone</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Standard interno (1 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-solvente per derivatizzazione</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Soluzione salina</td></tr><tr><td>Metossido di sodio (25% in peso)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Plant Growth Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX è consigliato per coltivare piante di Arabidopsis (Eddy, R. e Hahn, D.T., 2012, http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Metodi Purdue per la crescita di Arabidopsis.</td></tr><tr><td>PermaNest Humidity Dome&nbsp;</td><td>Soluzione del coltivatore, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Vassoi per piante Perma-Nest (22x11 pollici)</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vasi quadrati per serra, 3,5 pollici</td><td>Soluzione del coltivatore, LLC, Cookeville, TN&nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>Fertilizzante per piante per uso generico, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vetreria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta in vetro 13 x 100 mm con tappo a vite rivestito in teflon</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in vetro da 16 x 125 mm con tappo</td> <td>a vite rivestito in teflonKimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>Provette in vetro da 20 x 125 mm con tappo a vite in teflon</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per fiale GC National</td><td>Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>Microinserti per fiale GC</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>Fiale</td><td>GC National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Pipette pasteur monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danzatrice</td><td></td><td></td> <td>del ventreA questo scopo è possibile utilizzare uno shaker se la danzatrice del ventre non è disponibile</td></tr><tr><td>DB-5 Colonna GC capillare</td><td>J& W Scientific, CA, Stati Uniti; &nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0,25 mm x 0,25 &mu; m spessore del film</td></tr><tr><td>Essiccatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 a bagno d'acqua</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT spettrometro di massa a quadpolo singolo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td>Fisher Scientific</td> Evaporatore di azoto Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td> Polytron Birkmann <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gascromatografo Trace 1300</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regolatore a due stadi</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore sottovuoto</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e analisi della composizione delle piante cuticola lipidi poliestere monomeri

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Le piante terrestri producono biopoliesteri alifatici extracellulari che modificano le pareti cellulari di tessuti specifici. Le cellule epidermiche sintetizzano la cutina, un poliestere di glicerolo e acidi grassi modificati che costituisce la struttura della cuticola che ricopre le superfici aeree delle piante. La suberina è un poliestere lipidico correlato che si deposita sulle pareti cellulari di alcuni tessuti, tra cui l'endoderma della radice e il periderma dei tuberi, la corteccia degli alberi e le radici. Questi polimeri lipidici hanno una composizione molto variabile tra le specie vegetali e spesso differiscono tra i tessuti all'interno di una singola specie. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la composizione monomerica della cutina nelle foglie di Arabidopsis thaliana mediante depolimerizzazione catalizzata da metossido di sodio (NaOMe), derivatizzazione e successiva analisi di gascromatografia-spettrometria di massa (GC/MS). Questo metodo può essere utilizzato per studiare i monomeri di poliesteri insolubili isolati da interi tessuti vegetali delipidizzati contenenti cutina o suberina. Il metodo può essere applicato non solo per caratterizzare la composizione di polimeri lipidici in specie non precedentemente analizzate, ma anche come strumento analitico in approcci genetici diretti e inversi per valutare la funzione del gene candidato.

Il protocollo descritto in questo manoscritto è impostato per determinare lipidi monomeri poliestere, riducendo al minimo i contributi di lipidi non cutina 10 figura 1 presenta una panoramica del saggio, che prende tutto tra le 8 (cioè, cutina o suberina.) -. 10 giorni (dalla raccolta dei tessuti prima di ottenere dati GC), a seconda di quanto tempo i campioni sono lasciate asciugare. Il metanolisi selezionato base-catalizzata (Figura 2) metodo per depolimerizzano poliesteri è stato precedentemente convalidato per i semi di Arabidopsis, che contengono sia cutina e suberina. I tessuti vengono prima omogeneizzati ed esaustivo delipidato per rimuovere i lipidi solventi estraibili. La resa residui dopo l&#39;estrazione, come percentuale del peso fresco iniziale, è di solito 6% per A. thaliana Col-0 foglie. Residui arricchita di parete cellulare vengono essiccati in un essiccatore a vuoto e poi depolimerizzati nei loro costituenti monomeri di esteri metilici dabase-catalizzata transmetilazione. Due ore di incubazione è stato scelto come il tempo critico richiesto per il corretto depolimerizzazione e il recupero dei componenti lipidici poliestere. Tempi di incubazione più, determina aumento di acidi 2-idrossi; questi potenzialmente derivano da sfingolipidi di membrana 10. Un tipico cromatogramma se viene mostrato Arabidopsis tipo selvaggio del foglio cutina in figura 3, per i derivati ​​O -TMSi etere (Figura 3A) e derivati ​​O acetil (Figura 3B). Ogni picco è stato identificato dal confronto con spettri di massa dalla letteratura 7,8 e una banca dati pubblica 12 protocollo video .La nostra mostra come preparare derivati ​​TMSI, ma campioni possono in alternativa essere acetilato a derivatize gruppi idrossile. Derivati ​​sililati sono un bene per scopi di identificazione perché danno spettri di massa diagnostico. Tuttavia, i derivati ​​acetilati sono più stabili e una buona alternativa a sililazionemonomeri una volta sono stati identificati 10. Per contribuire all&#39;attuazione di questo protocollo in laboratori che solo hanno GC accoppiato a ionizzazione di fiamma (FID), GC / FID tracce corrispondenti a derivati ​​acetilati di WT monomeri foglia cutina e ad una serie omologa di norme esteri metilici di acidi grassi sono anche visualizzati (Figura supplementare 4). Questo metodo è qualitativo e rileva le differenze quantitative tra i campioni, quindi il suo valore per l&#39;analisi mutante. Gli importi dei singoli monomeri vengono determinati con il metodo standard interno di quantificazione, consentendo il confronto di monomero abbondanza tra i campioni. Va chiarito, tuttavia, che la dimensione di picco (conte totali di ioni) non può riflettere i rapporti molari dei monomeri del poliestere. Stiamo comprese le tabelle modificabili di monomeri per calcolare gli importi dei monomeri in foglia Arabidopsis cutina come esteri di acidi grassi e derivati ​​metilici TMSI (File di riferimento 1), o asso<html> derivati ​​Tyl (File di riferimento 2) di alcoli. Le tabelle possono dover essere adattati se i campioni sono estratti da diversi organi o specie vegetali. A titolo di esempio, abbiamo analizzato Arabidopsis Thalia na Columbia (Col-0) foglie wild type e due alleli nulli-mutante in precedenza caratterizzati del gene CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) e att1-2 (m-2 ) 13,14. Citocromo P450 monossigenasi della sottofamiglia CYP86A codificano putativi Ohm-oxydases e partecipa nella suberina e cutina monomero biosintesi. I nostri risultati (Figura 4) dimostrano una significativa riduzione dei carichi di tre principali monomeri lipidici nelle foglie mutante rispetto alle foglie WT. Coerentemente con la funzione dell&#39;enzima previsto, 16: 0, 18: 2, e 18: 1 dicarbossilati furono particolarmente colpite nei mutanti ATT1. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Panoramica di analisi dei lipidi in poliestere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figura 2. Meccanismo della reazione transmetilazione Naome catalizzata. Gli anioni metossido nucleofili attaccano il carbonio cabonyl di poliesteri lipidi per formare un intermedio instabile tetraedrica (A), che si dissocia facilmente in esteri metilici di acidi grassi e anioni alcossido (B). Questi alcossidi sono basi coniugate, e reagiscono con metanolo, rigenerando gli anioni metossido cataliticamente attivi, sostenendo così reazioni di depolimerizzazione addizionali (C). Se l&#39;acqua è presente nelsistema, reagirà con metilato di sodio per formare idrossido di sodio, una base forte che idrolizza irreversibilmente esteri producendo acidi grassi liberi indesiderabili. Acetato di metile viene aggiunto come co-solvente 15 per rimuovere piccole quantità di idrossido di sodio all&#39;interno del sistema (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentante cromatogramma ionico totale di wild-type foglia Arabidopsis thaliana monomeri cutina. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) etere e (B) Derivati ​​ossidrile acetato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </a&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Figura 4. Cutin monomero composizione della Arabidopsis thaliana WT e due nulli alleli mutanti del gene CYP86A2 (mutante-1 = att1-1; mutante-2 = att1-2) barre di errore rappresentano la deviazione standard della media (n = 4). . Adattato da 13, con il permesso di © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> Figura 1. supplementare Peak risultati di integrazione tavolo dal software GC / MS. Picchi corrispondenti ai monomeri identificati e standard interni sono identificati dal loro retenti<html> in tempo (colonna C) e valori dell&#39;area sono riportati nella colonna D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Clicca qui per scaricare il file.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Supplemental file 2. Tabella di Arabidopsis monomeri cutina (derivati ​​trimetilsilil etere di esteri metilici degli acidi grassi idrossi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Cliccate qui per scaricare il file.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Supplemental file 3. Tabella di Arabidopsis monomeri cutina (derivati ​​O acetil di esteri metilici degli acidi grassi idrossi).com / file / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per scaricare il file. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Supplementare Figura 4. GC / FID tracce di (AB) estere metilico di acidi grassi (FAME) norme indice di conservazione (picchi sono etichettati con ogni FAME saturo lunghezza della catena); e (C) acetilato A. thaliana WT foglia monomeri cutina. Numeri sulla visiera corrispondono a: 16: 0 FAME (1), Ferulate (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAME (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-Dioh 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dicarbossilico dimetil estere; FAME: grassi estere metilico; IS1: standard interno 1, 17: 0 FAME; IS2: interna stAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Cliccate qui per scaricare il file.</a>

I poliesteri lipidici costituiscono i componenti strutturali di due modificazioni della parete cellulare, la cuticola vegetale e le barriere di diffusione contenenti suberina. In questo video, descriviamo un metodo per depolimerizzare la cutina da foglie intere delipidate. Il metodo può essere applicato allo studio di mutanti compromessi nella biosintesi della cutina o della suberina.

Isolamento e analisi della composizione delle piante cuticola lipidi poliestere monomeri

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Le piante vascolari dipendono da strati extracellulari che svolgono la funzione di barriere impermeabili tra i tessuti vegetali e l'ambiente esterno. Queste strutture associate alle cellule lipofile limitano l'infezione da agenti patogeni e regolano il trasporto passivo di gas, acqua e sostanze disciolte all'interno e all'esterno dei tessuti vegetali. Una barriera importante è la cuticola vegetale, una struttura complessa unica delle piante.La cutina è un poliestere di glicerolo insolubile che costituisce la matrice strutturale della cuticola ed è associata a cere estraibili con solvente. Presentiamo qui una tecnica affidabile per analizzare la composizione dei poliesteri lipidici ed eliminare i lipidi dai tessuti vegetali. In questo protocollo, campioni di tessuto intero vengono raccolti, omogeneizzati e sottoposti a una serie esaustiva di estrazioni con solvente per rimuovere i lipidi solubili nel solvente, inclusi le cere cuticolari ed epicuticolari.Triglicerolo nei lipidi di membrana. I campioni vengono quindi depolimerizzati nei rispettivi monomeri lipidici mediante metilisi catalizzata da metossido di sodio. Vengono aggiunti reagenti per la simulazione al fine di transmetilare i gruppi idrossilici nei corrispondenti derivati trimetilsililici, adatti all'analisi mediante cromatografia gassosa.I residui derivati vengono quindi trasferiti in vial per GC e caricati nell'analizzatore A-G-C-M-S per l'analisi, generando un cromatogramma che caratterizza la composizione monomerica dei biopoliesteri presenti nei campioni estratti. In questo caso, raccogliamo campioni di foglie intere da piante di arabidopsis ANA di tipo selvaggio e da due mutanti maturi.Per l'estrazione e l'analisi, aggiungere 0,5 grammi di tessuto in provette di vetro pulite, precedentemente risciacquate con cloroformio. Versare 100 millilitri di isopropanolo in un matraccio e aggiungere butilidrossi toluene fino a una concentrazione dello 0,01%. Il BHT è un antiossidante aggiunto per proteggere i doppi legami e gli acidi grassi dall'ossidazione durante le estrazioni con solvente. Riscaldare preventivamente il solvente in un bagno d'acqua a circa 85 gradi.Aggiungere 25 millilitri di isopropanolo riscaldato per grammo di tessuto vegetale e incubare i campioni nel termoagitatatore a 85 gradi per 15 minuti. Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente, indossando protezioni per orecchie e occhi. Infine, frantumare i campioni con un omogeneizzatore per ottenere una dispersione omogenea, sigillare i tubi con tappi a vite e agitare a 100 RPM per uno o due minuti; centrifugare quindi i campioni a 800 G per 10 minuti.Per separare la fase organica dai materiali di maggiore densità compattati nel pellet, rimuovere e scartare il soprannatante utilizzando una pipetta di Pasteur o una propipetta. Prestare attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo a temperatura ambiente e agitare i campioni durante la notte.Centrifugare i campioni a 100 giri al minuto e scartare il soprannatante. Aggiungo 25 millilitri di una soluzione in rapporto due a uno di cloroformio e metanolo per grammo di tessuto, e agito i campioni durante la notte; quindi centrifugo e scarto la fase organica. Ripetere quindi questo processo utilizzando una soluzione in rapporto uno a due di cloroformio e metanolo.Essiccare il pellet durante la notte e trasferire le provette dalla cappa a un essiccatore sotto vuoto contenente solfato di calcio anidro per disidratare i campioni per un periodo di almeno tre giorni o fino al raggiungimento di massa costante. Una volta che i campioni sono completamente essiccati, sono pronti per la deflourazione mediante metanolisi catalizzata da metossido di sodio. Aggiungere alle provette contenenti i tessuti secchi due soluzioni di standard interni utilizzando una siringa di vetro, partendo da 25 microlitri di decanoato di metile HETO e 25 microlitri di omega pentec e lattone.Per avviare la polimerizzazione profonda, aggiungere 0,9 millilitri di acetato di metile ai campioni, seguiti da 1,5 millilitri di catalizzatore metossido di sodio e da 3,6 millilitri di metanolo. Incubare i campioni a 60 gradi per due ore con vorticosità periodica all'interno del sistema di reazione; i poliesteri lipidici reagiscono con gli anioni metossido nucleofili formando intermedi tetraedrici instabili, che si dissociano facilmente in acidi grassi, esteri metilici e anioni ossido. Questi ossidi sono basi coniugate e reagiscono con il metanolo rigenerando gli anioni metossido cataliticamente attivi, sostenendo così ulteriori reazioni di polimerizzazione profonda.Se nell'ambiente è presente acqua, reagirà con il metossido di sodio formando idrossido di sodio, una base forte che converte irreversibilmente i poliesteri in acidi grassi liberi indesiderati. Per evitare l'idrolisi, invece dei gas, viene aggiunto acetato di metile per rimuovere qualsiasi traccia di idrossido di sodio presente nel sistema.Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, estrarre i monomeri aggiungendo 10 millilitri di diclorometano a ciascun tubo. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di acido acetico glaciale per acidificare i campioni.Riempire i tubi con soluzione di cloruro di sodio 0,5 molare, vortexare accuratamente e centrifugare per minuti. Sotto cappa. Trasferire con attenzione la fase organica inferiore mediante pipetta in tubi medi puliti e pre-risciacquati.Lavare nuovamente i campioni con soluzione salina, vortexare e centrifugare per 10 minuti. Rimuovere la fase acquosa superiore, quindi aggiungere solfato di sodio anidro ai campioni come agente essiccante per rimuovere le tracce di acqua rimaste in soluzione; vortexare i campioni, centrifugare e trasferire il solvente in provette piccole e pulite, precedentemente risciacquate. Caricare le provette in un evaporatore ad azoto per evaporare il solvente ed ottenere residui secchi di monomeri. Utilizzando una siringa di vetro, aggiungere 100 microlitri di purina e 100 microlitri di B-S-T-F-A per convertire i gruppi idrossilici in derivati volatili di trimetil silile.Incubare i campioni a 100 gradi per 10 minuti. Lasciare raffreddare le provette ed evaporare sotto flusso di gas azoto. Aggiungere 500 µL di una soluzione uno a uno di EPTANO e toluene per sciogliere i residui, quindi centrifugare brevemente.Trasferire i campioni derivatizzati in vial per gascromatografia contenenti inserti da 400 microlitri. Chiudere i vial e caricare i campioni in un gascromatografo, che li inietta in una colonna capillare per l'analisi; gli eluati vengono quindi rilevati da uno spettrometro di massa a quadrupolo. I dati grezzi ottenuti dall'analisi GC-MS vengono elaborati e presentati come cromatogramma per ciascun campione.I singoli monomeri corrispondenti a diversi picchi cromatografici vengono identificati in base ai rispettivi spettri di massa specifici. Nei tempi di ritenzione in gascromatografia, le quantità dei singoli monomeri vengono determinate mediante il metodo dello standard interno per la quantificazione, consentendo di effettuare confronti tra i campioni per quanto riguarda abbondanza e composizione dei monomeri. Qui vengono mostrati cromatogrammi sovrapposti provenienti da analisi rappresentative di monomeri rilasciati da tessuto fogliare di ascesso di coniglio, corrispondenti al tipo selvaggio e a due alleli mutanti di un gene che codifica un enzima P quattro 50 monoossigenasi, che mostrano profili monomerici distinti.I nostri risultati dimostrano differenze significative nell'abbondanza di tre monomeri principali del cutina, in piante di arabidopsis wild type e mutanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per analizzare la composizione dei poliesteri lipidici vegetali, mediante l'isolamento, l'identificazione e la quantificazione dei rispettivi monomeri costitutivi. La procedura è scalabile e può essere facilmente adattata per elaborare grandi quantità di diversi materiali vegetali, inclusi radici, semi, foglie e altri tessuti interi.Questa tecnica è applicabile a studi che indagano la regolazione della biosintesi e la distribuzione di cutina e suberina nelle piante superiori.

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