Isolamento e analisi della composizione delle piante cuticola lipidi poliestere monomeri

Le piante vascolari si basano su strati extracellulari che fungono da barriere impermeabili tra i tessuti vegetali e l'ambiente esterno. Queste cellule lipofile, pur essendo strutture associate, limitano l'infezione patogena e regolano il trasporto passivo di gas, acqua e sostanze disciolte dentro e fuori i tessuti vegetali. Una barriera importante è la cuticola della pianta, una struttura complessa unica per le piante.

La cutina è un glicerolo poliestere lipidico insolubile che costituisce la matrice strutturale della cuticola ed è associata a cere estraibili con solvente. Qui presentiamo una tecnica affidabile per saggiare la composizione dei poliesteri lipidici e trattenere i tessuti vegetali lipidici. In questo protocollo, i campioni di tessuto intero vengono raccolti, omogeneizzati e, esaustivamente, dilapidati da una serie di estrazioni con solvente per rimuovere i lipidi solubili in solvente, comprese le cere cuticolari ed epi particolari.

Triglicerolo nei lipidi di membrana. I campioni vengono quindi depolimerizzati nei monomeri lipidici che li compongono mediante lisi metilica catalizzata da ossido di metanfetamina di sodio. I reagenti di simulazione vengono aggiunti ai gruppi ossidrilici transmetilati nei corrispondenti derivati di cellule trimetiliche adatti per l'analisi gascromatografica.

I residui derivati vengono quindi trasferiti in fiale GC e caricati in A-G-C-M-S per l'analisi, generando un cromatogramma, caratterizzando la composizione monomerica dei bio poliesteri. Presente nei campioni estratti. Qui raccogliamo campioni di foglie intere da piante selvatiche e due mutanti di piante mature di arabidopsis ANA.

Per l'estrazione e l'analisi, aggiungere 0,5 grammi di tessuto per pulire le provette di vetro che sono state pre-risciacquate con cloroformio. Mettere 100 millilitri di isopropanolo in un pallone e aggiungere butilidrossitoluene a una concentrazione dello 0,01%Il BHT è un antiossidante aggiunto per proteggere i doppi legami e gli acidi grassi dall'ossidazione durante le estrazioni con solvente. Preriscaldare il solvente a bagnomaria a circa 85 gradi.

Aggiungere 25 millilitri di isopropanolo riscaldato per grammo di tessuto vegetale e incubare i campioni nel calore LOC a 85 gradi per 15 minuti. Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente e con protezione per le orecchie e gli occhi. Infine, macinare i campioni con un omogeneizzatore per ottenere una dispersione omogenea, sigillare le provette con tappi a vite e agitare a 100 giri/min per uno o due campioni di centrifuga a 800 G per 10 minuti.

Per separare la fase organica dai materiali a più alta densità compattati nel pellet, rimuovere e scartare il surnatante utilizzando un Pasteur o un propent. Fare attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo a temperatura ambiente e agitare i campioni per una notte.

A 100 giri/min, centrifugare i campioni e scartare il surnatante. Aggiungo 25 millilitri di una soluzione due a uno di cloroformio, metanolo, pergrammo di tessuto, e agito i campioni durante la notte centrifugando e scartando la fase organica. Quindi ripetere questo processo utilizzando una soluzione di metanolo di cloroformio da uno a due.

Asciugare il pellet durante la notte e trasferire le provette dalla cappa aspirante a un essiccante sottovuoto contenente solfato di calcio anidro per disidratare i campioni per un periodo di almeno tre giorni o fino al raggiungimento di una massa costante. Una volta completamente essiccati, i campioni sono pronti per la deflorazione mediante metalisi catalizzata da ossido di metanfetamina di sodio. Aggiungere due soluzioni di standard interni a provette contenenti tessuti secchi utilizzando una siringa di vetro, iniziando con 25 microlitri di metile HETO decanoato e 25 microlitri di omega pentec e lattone.

Per avviare la polimerizzazione profonda, aggiungere 0,9 millilitri di acetato di metile ai campioni, seguiti da 1,5 millilitri di catalizzatore di ossido di metanfetamina di sodio e 3,6 millilitri di metanolo. Incubare i campioni a 60 gradi per due ore con vortice periodico all'interno del sistema di reazione, i poliesteri lipidici reagiscono con gli anioni ossido di metanfetamina nucleofila per formare intermedi tetraedrici instabili, che si dissociano facilmente in acido grasso, esteri metilici e anioni ossido. Questi ossidi sono basi coniugate e reagiscono con il metanolo rigenerando gli anioni IDE metanfetamine attivi catali, sostenendo così ulteriori reazioni di polimerizzazione profonda.

Se l'acqua è presente nel sistema, reagirà con l'ossido di metanfetamina di sodio per formare idrossido di sodio. Una base forte che converte irreversibilmente i poliesteri in acidi grassi liberi indesiderati. Al posto dei fas per prevenire l'idrolisi, viene aggiunto l'acetato di metile per rimuovere l'idrossido di sodio all'interno del sistema.

Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, estrarre i monomeri aggiungendo 10 millilitri di dicloruro di metilene a ciascuna provetta. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di acido acido glaciale per acidificare i campioni.

Riempire le provette con una soluzione di cloruro di sodio 0,5 molari, agitare accuratamente e centrifugare per minuti. Sotto la cappa aspirante. Trasferire con cura la fase organica inferiore mediante pipetta in provette pulite e pre-risciacquate di medie dimensioni.

Lavare nuovamente i campioni con una soluzione salina a vortice e centrifugare per 10 minuti. Rimuovere la fase acquosa superiore, quindi aggiungere solfato di sodio anidro ai campioni come agente essiccante per rimuovere le tracce di acqua rimanenti nella centrifuga dei campioni a vortice di soluzione e trasferire il solvente per pulire le provette di piccole dimensioni pre-risciacquate, caricare le provette in un evaporatore di azoto per far evaporare il solvente e ottenere residui secchi di monomeri. Utilizzando una siringa di vetro, aggiungere 100 microlitri di purina e 100 microlitri di B-S-T-F-A per convertire i gruppi ossidrilici in derivati volatili delle cellule trimetiliche.

Incubare i campioni a 100 gradi per 10 minuti. Lasciare raffreddare i tubi ed evaporare sotto azoto gassoso. Aggiungere 500 microlitri di una soluzione di eptano toluene uno a uno ai residui rossi disciolti, che vengono poi brevemente centrifugati.

Trasferire i campioni derivati in fiale GC contenenti inserti da 400 microlitri. Racchiudere le fiale di carico dei campioni in un gascromatografo, che li inietta in una colonna capillare per l'analisi, l'eluato viene quindi rilevato dallo spettrometro di massa quadruplo. I dati grezzi acquisiti dall'analisi GCMS vengono elaborati e presentati come cromatogramma per ciascun campione.

I singoli monomeri corrispondenti a diversi picchi cromatografici sono identificati dai loro specifici spettri di massa. Nei tempi di ritenzione GC, le quantità dei singoli monomeri sono determinate utilizzando il metodo standard interno di quantificazione, consentendo di effettuare confronti tra l'abbondanza e la composizione dei monomeri tra i campioni. Qui sono mostrati cromatogrammi sovrapposti da analisi rappresentative di monomeri, rilasciati da un ascesso di coniglio tessuto fogliare corrispondente al tipo selvatico e due alleli mutanti di un gene che codifica per un enzima P quattro 50 mono ossigenasi che dimostrano profili monomerici distinti.

I nostri risultati dimostrano differenze significative, l'abbondanza di tre principali cutina, monomeri e piante di arabidopsis di tipo selvatico e mutante. Questo protocollo è un metodo robusto per analizzare la composizione dei poliesteri lipidici vegetali mediante l'isolamento, l'identificazione e la quantificazione dei loro monomeri costituenti. La procedura è scalabile e può essere facilmente adattata per elaborare grandi quantità di vari materiali vegetali, tra cui radici, semi, foglie e altri tessuti interi.

Questa tecnica è applicabile agli studi che indagano la biosintesi, la regolazione e la distribuzione della cutina e della suberina nelle piante superiori.