Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

L'obiettivo generale di questa analisi del flusso extracellulare è valutare le caratteristiche metaboliche dei macrofagi derivati dal midollo osseo polarizzati M1 e M. Questo metodo può servire come quadro di riferimento per studiare come particolari citochine, composti o codici genogenici influenzano il fenotipo metabolico dei macrofagi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede solo una piccola quantità di macrofagi.

Inoltre, misura tutti i parametri rilevanti della glicolisi e dei mitocondri in un unico test. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sul fenotipo metabolico dei macrofagi derivati dal midollo osseo, può anche essere applicato a tutti i tipi di macrofagi o cellule immunitarie. Abbiamo avuto l'idea di pubblicare questo metodo in J poiché riceviamo spesso richieste da altri scienziati per assisterli con i loro saggi di flusso cellulare di accesso metabolico L'ottavo giorno di coltura, verificare la presenza di macrofagi maturi mediante ispezione visiva e incubare i macrofagi derivati dal midollo osseo maturo in 10 millilitri di soluzione salina di citrato per cinque minuti.

A 37 gradi Celsius quando le celle si sono staccate. Lavare la coltura con 10 millilitri di PBS e contare il numero di cellule vitali. Quindi seminare cinque volte 10 alla quarta cella per pozzetto.

In una coltura cellulare XFE 96, micropiastra in 100 microlitri di terreno di coltura per pozzetto, tenendo la pipetta ad angolo circa a metà del lato di ciascun pozzetto. Per erogare le celle, aggiungere il solo mezzo ai pozzetti di correzione dello sfondo A uno, A 12, H uno e H 12. Quindi lasciare riposare le cellule a temperatura ambiente in una cappa di coltura cellulare per un'ora.

Dopo aver confermato la coltura di aderenza, le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Tre ore dopo la piastra, stimolare da quattro a sei pozzetti di cellule per condizione, a seconda dei casi, per 24 ore. Per polarizzare i macrofagi derivati dal midollo osseo il giorno prima del test del flusso extracellulare, posizionare la cartuccia del sensore capovolta accanto alla piastra di servizio e riempire ogni piastra con 200 microlitri di soluzione di crin.

Quindi, abbassare la cartuccia del sensore sulla piastra di servizio per immergere i sensori nella soluzione di Caino e verificare che il livello della soluzione di Caino sia sufficientemente alto da mantenere il sensore sommerso. Quindi posizionare la cartuccia in un incubatore a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere delicatamente il surnatante dai macrofagi polarizzati e lavare le cellule con 100 microlitri di saggio appena preparato.

Mezzo per pozzetto. Aggiungere 180 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto e utilizzare il microscopio per verificare che le cellule non siano state lavate via. Se le cellule sono ancora attaccate, posizionare la piastra nell'incubatore senza anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora prima dell'esecuzione del saggio mentre le cellule sono in incubazione.

Preparare 10 miscele di composti per iniezione come indicato nella tabella e riscaldare le miscele a 37 gradi Celsius. Quindi caricare la cartuccia del sensore con i volumi appropriati di composto e le porte A, B, C e D utilizzando le guide di caricamento fornite per caratterizzare la bioenergia dei macrofagi polarizzati mediante saggio di flusso extracellulare. Utilizzare la procedura guidata di analisi per creare un modello di analisi con tempi di miscelazione di due minuti e tre minuti di misurazione e almeno tre cicli di misurazione di miscela e velocità prima di ciascuna delle quattro iniezioni e dopo l'ultima iniezione.

Quindi iniziare il test e seguire le istruzioni come indicato dall'apparecchiatura. Caricamento della piastra della cartuccia con le sonde idratate per consentire la calibrazione da parte dell'apparato e della piastra cellulare. Quando richiesto, al termine del test, scartare con cura tutto il terreno di coltura e conservare la micropiastra di coltura cellulare analizzata a meno 20 gradi Celsius fino alla normalizzazione.

Per normalizzare le cellule utilizzando il kit per il saggio di proliferazione cellulare, scongelare la piastra e incubare le cellule in 200 microlitri di tampone di lisi cellulare appena preparato per pozzetto per cinque minuti a temperatura ambiente. Infine, misurare la fluorescenza con un'eccitazione di circa 480 nanometri e un massimo di emissione di circa 520 nanometri. Utilizzando le misurazioni della fluorescenza acquisite per calcolare il rapporto in cui la conta cellulare media di tutti i pozzetti dei macrofagi naive è impostata su uno, quindi esportare questi rapporti nel software di analisi delle onde del cavalluccio marino.

Per normalizzare i dati, un saggio di flusso extracellulare produrrà tipicamente il tasso di acidificazione extracellulare o il tasso di consumo di ECAR e ossigeno, o grafici OCR come dimostrato in questa figura rappresentativa dopo l'iniezione di glucosio, l'aumento osservato di ECAR rappresenta il tasso di glicolisi. L'ulteriore aumento osservato nell'ECAR dopo un'inibizione della TP sintasi con tutta la micina liga fornisce ulteriori informazioni sulla riserva e la capacità glicolitica. Quando si analizzano i valori OCR, l'iniezione di CIN facilita il calcolo del consumo di ossigeno utilizzato per la sintesi mitocondriale di A TP, FCCP disaccoppia la respirazione mitocondriale.

Le corrispondenti misurazioni OCR forniscono dati sulla capacità respiratoria massima e di riserva nota e sull'iniezione di antimicina a, tuttavia, bloccano i complessi mitocondriali uno e tre con l'OCR residuo che rappresenta il consumo di ossigeno non mitocondriale. L'attivazione dei macrofagi con LPS induce un aumento del metabolismo glicolitico. Con le differenze tra LPS e IL, quattro macrofagi trattati diventano ancora più evidenti quando si osservano i tassi di consumo di ossigeno.

Infatti, mentre il metabolismo ossidativo massimo è altamente soppresso nei macrofagi trattati con LPS, IL four induce una respirazione robusta nei macrofagi M 2. Una volta padroneggiato, il test dell'influenza extracellulare può essere completato in due ore se viene eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di iniettare il veterinario insieme a FCCP per alimentare la massima respirazione dopo il disaccoppiamento.

Dopo questa tecnica, è possibile eseguire ulteriori saggi come Eliza per valutare l'efficienza della polarizzazione dei macrofagi. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare le caratteristiche metaboliche di un'ampia gamma di cellule immunitarie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi del flusso extracellulare per valutare il fenotipo metabolico dei macrofagi.