Derivate dal midollo osseo macrofagi Production
22 novembre 2013
I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell'interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l'attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare macrofagi da urine, colture cellulari derivate dal midollo osseo. Ciò si ottiene prima estraendo il midollo osseo dalle zampe posteriori del topo. Nella seconda fase, i macrofagi residenti nel midollo osseo vengono rimossi e quindi le cellule del midollo osseo vengono ulteriormente coltivate in condizioni di differenziazione dei macrofagi.
Quindi, quando le cellule del midollo osseo si sono differenziate in macrofagi, possono essere raccolte per l'analisi sperimentale. In definitiva, la microscopia confocale può essere utilizzata per dimostrare la localizzazione dell'LPS batterico all'interno dei compartimenti acidi dei macrofagi derivati dal midollo osseo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la crescita di macrofagi, linee cellulari, è che il gran numero, quindi è possibile ottenere macrofagi primari.
La dimostrazione visiva del metodo è fondamentale poiché le fasi di autoproduzione sono difficili da imparare e richiedono pratica e, per raggiungere il successo, disinfettare la pelle di un topo soppresso con etanolo al 70%. Fai un'incisione nella parte superiore di ciascuna zampa posteriore e tira la pelle verso il basso verso il piede per esporre il muscolo. Quindi, taglia le zampe posteriori e usa forbici e pinze sterili.
Per rimuovere la pelle, mettere le zampe in una capsula di Petri sterile da 35 millimetri contenente cinque millilitri di ghiaccio sterile. PBS freddo. Rimuovere la pelle e i muscoli attaccati alle ossa, quindi trasferire le ossa in una nuova capsula di Petri sterile contenente cinque millilitri di ghiaccio.
PBS freddo e sterile. Lavate le ossa due volte con altri cinque millilitri di PBS e poi trasferitele in un mortaio sterile contenente cinque millilitri di ghiaccio. PBS freddo e sterile.
Ora taglia la tibia dal femore all'altezza dell'articolazione e usa un pestello per schiacciare delicatamente le ossa. Raccogliere tre volte il surnatante in provette ghiacciate da 15 millilitri. Quindi filtrare la sospensione tissutale attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micron.
Per rimuovere i frammenti solidi, centrifugare il filtrato e scartare delicatamente il surnatante. Dissociare il pellet con il tampone di lisi dei globuli rossi, aggiungendo 20 millilitri di DMEM completo a freddo ghiacciato dopo 30 secondi per fermare la reazione dopo aver centrifugato le cellule, sospendiamo il pellet in 20 millilitri di 37 gradi Celsius, completiamo il DMEM e quindi dividiamo la sospensione cellulare tra due piastre di Petri da 100 millimetri. Incubare le piastre per quattro ore a 37 gradi Celsius, quindi raccogliere i surnatanti in provette da 50 millilitri a temperatura ambiente.
Dopo aver centrifugato i surnatanti, risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM completo integrato con il surnatante L 9 29 cellule precedentemente preparato, quindi filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare in nylon da 40 micron. Aggiungere il filtrato a 140 millilitri di DMEM completo e terreno cellulare L 9 29, quindi distribuire 10 millilitri di sospensione cellulare per piatto in 15 piastre Petri da 100 millimetri. Dopo aver incubato le cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica a 10 millilitri di DMEM completo più surnatante L 9 29 e incubare le cellule per altri quattro giorni.
Monitorando periodicamente la crescita cellulare con un microscopio invertito per raccogliere i macrofagi derivati dal midollo osseo, aspirare e scartare prima il surnatante. Quindi lavare le piastre di Petri due volte con DMEM completo. Successivamente, aggiungi cinque millilitri di DMEM completo a 37 gradi Celsius e usa un poliziotto di gomma per staccare delicatamente le cellule, raccogliere i macrofagi derivati dal midollo osseo in provette da 50 millilitri e quindi far girare le cellule.
Resus sospendendo i pellet in 20 millilitri di DMEM completo. Infine, contare le celle in base all'esclusione triam blue. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere un gran numero di macrofagi in pochi giorni dopo aver isolato e placcato le cellule rotonde del midollo osseo non aderenti meno i macrofagi residenti nel midollo osseo, come appena dimostrato.
Queste cellule precursori BMDM rappresentative sono state incubate con G-M-C-S-F. Dopo tre giorni, le cellule hanno iniziato ad aderire e a differenziarsi in macrofagi. Dopo sette giorni, è stato osservato un monostrato confluente di macrofagi derivati dal midollo osseo.
L'analisi citofluorimetrica per F 4 80 e H-L-A-D-R ha rivelato che i macrofagi derivati dal midollo osseo esprimevano entrambi i marcatori confermando la differenziazione delle cellule del midollo osseo in macrofagi. Valutare le capacità acide PHA dei macrofagi derivati dal midollo osseo. La capacità delle cellule di internalizzare la velocità del lattice è stata monitorata come previsto.
È stato determinato che il numero di perle per cellula aumenta nel tempo per valutare il loro potenziale endocitico. Anche i macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati co-coltivati con Coxiella. È stato osservato che l'LPS dell'occhio di Burnett in rosso era localizzato in un compartimento che ospitava la proteina di membrana associata al lisosomiale uno in blu, ma non la catepsina D in verde, dimostrando che l'LPS era presente negli endosomi tardivi, che non sono in grado di fondersi con i lisosomi come previsto dal macrofago derivato dal midollo osseo.
Le interazioni batteriche tra patogeni e patogeni sono state ulteriormente analizzate attraverso la loro infezione mediante TMA Wiley eye. Come previsto, i batteri in rosso non erano localizzati nel compartimento che ospita KPS e D, che appare nuovamente in verde. In questo immuno blot rappresentativo, sono state valutate le vie di trasduzione del segnale dei macrofagi derivati dal midollo osseo, dimostrando che i macrofagi derivati dal midollo osseo come i tessuti, i macrofagi isolati sovraregolano i livelli di chinasi fosforilata P 38 alfa map in risposta alla stimolazione dell'EPS di esia coli.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia cellulare, come ad esempio a quale compartimento intracellulare micro localizzato.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per differenziare macrofagi dal midollo osseo di topo. La procedura prevede l'estrazione del midollo osseo e la sua coltivazione in condizioni specifiche per generare macrofagi primari da analizzare sperimentalmente.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Microbiologia
Sfondo
- I macrofagi svolgono un ruolo fondamentale nel sistema immunitario.
- Recenti progressi hanno migliorato la comprensione delle interazioni tra macrofagi e microrganismi.
- I metodi per generare macrofagi primari sono essenziali per la ricerca.
- Questo studio si concentra su un approccio innovativo per ottenere macrofagi dal midollo osseo di topo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per differenziare i macrofagi dal midollo osseo di topo.
- Facilitare lo studio delle funzioni e delle interazioni dei macrofagi.
- Fornire una tecnica in grado di produrre un elevato numero di macrofagi primari.
Metodi Utilizzati
- Estrazione del midollo osseo dagli arti posteriori del topo.
- Rimozione dei macrofagi residenti dal midollo osseo.
- Coltura delle cellule del midollo osseo in condizioni di differenziazione verso macrofagi.
- Utilizzo della microscopia confocale per analizzare la localizzazione del LPS batterico nei macrofagi.
Risultati principali
- Differenziazione riuscita delle cellule del midollo osseo in macrofagi.
- Dimostrazione della localizzazione del LPS batterico nei macrofagi.
- Elevate quantità di macrofagi primari ottenuti rispetto ai metodi tradizionali.
- Migliore comprensione del comportamento dei macrofagi in risposta a stimoli microbici.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un modo efficace per generare macrofagi primari.
- Questo approccio può essere applicato a diverse analisi sperimentali.
- Studi futuri potranno sfruttare questi macrofagi per esplorare le risposte immunitarie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'ottenimento di macrofagi primari dal midollo osseo consente una modellizzazione fisiologicamente rilevante delle interazioni tra ospite e patogeno e delle risposte immunitarie. Questo metodo supporta la validazione degli bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta, fornendo un accesso scalabile a cellule immunitarie rilevanti per la malattia. L'approccio migliora l'affidabilità predittiva dei modelli preclinici riducendo la dipendenza da linee cellulari immortalizzate.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi mediati dai macrofagi in modelli di malattie infettive e infiammatorie.
- Valore operativo: Fornisce una fonte rinnovabile di macrofagi primari per studi riproducibili sull'interazione con il bersaglio.
- Valore scientifico: Permette la validazione funzionale di bersagli immunomodulatori mediante saggi di fagocitosi e citochine.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera popolazioni standardizzate di macrofagi per schermature riproducibili di composti in saggi di immunologia.
- Valore operativo: Consente la preparazione ad alto rendimento di cellule differenziate per garantire la riproducibilità dei saggi tra diversi siti.
- Valore scientifico: Facilita letture quantitative come la localizzazione del LPS e l'assorbimento di microsfere per schermature meccanicistiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella il comportamento dei macrofagi umani in studi preclinici sulla persistenza batterica e sulla sopravvivenza intracellulare.
- Valore operativo: Consente modelli di infezione longitudinali mediante l’uso di patogeni come Coxiella per valutare potenziali terapie.
- Valore scientifico: Permette letture allineate a biomarcatori, come l’attivazione della p38 MAPK fosforilata in risposta a LPS.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla valutazione preclinica, fornendo una fonte scalabile di cellule immunitarie primarie per lo screening meccanicistico e fenotipico.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi nelle interazioni ospite-patogeno consentendo esperimenti di co-coltura controllata tra macrofagi e patogeni.
- Screening: Fornisce macrofagi pronti per saggi con output quantificabili come la cinetica di internalizzazione e l'attivazione della segnalazione.
- Analisi: Permette l'uso della microscopia confocale e della citometria a flusso per l'analisi ad alto contenuto del fenotipo e della funzione dei macrofagi.
- Ricerca Translazionale: Collega la fase iniziale della scoperta alla validazione preclinica attraverso modelli di cellule immunitarie rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato e scalabile per la generazione di macrofagi primari in diversi progetti di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la validità predittiva dei modelli di immunologia e delle malattie infettive mediante l'uso di cellule primarie.
- Valore operativo: Riduce la variabilità e migliora la riproducibilità nei saggi basati sui macrofagi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo, riducendo i rischi associati ai meccanismi d'azione in sistemi fisiologicamente rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati immunomodulanti e anti-infettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di prelievo asettico dei tessuti e di coltura cellulare primaria.
- È subordinato all'accesso al supernatante di cellule L929 o al M-CSF per la differenziazione dei macrofagi.
- Necessita di protocolli standardizzati per l'estrazione del midollo osseo e la quantificazione dei macrofagi tra diversi gruppi di lavoro.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende a fonti di midollo osseo umano o di altre specie.
- È limitato dalla necessità di condizioni sterili e di passaggi temporizzati di differenziazione per garantire purezza e resa dei macrofagi.
