Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

L'obiettivo generale di questa procedura è generare macrofagi da urine, colture cellulari derivate dal midollo osseo. Ciò si ottiene prima estraendo il midollo osseo dalle zampe posteriori del topo. Nella seconda fase, i macrofagi residenti nel midollo osseo vengono rimossi e quindi le cellule del midollo osseo vengono ulteriormente coltivate in condizioni di differenziazione dei macrofagi.

Quindi, quando le cellule del midollo osseo si sono differenziate in macrofagi, possono essere raccolte per l'analisi sperimentale. In definitiva, la microscopia confocale può essere utilizzata per dimostrare la localizzazione dell'LPS batterico all'interno dei compartimenti acidi dei macrofagi derivati dal midollo osseo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la crescita di macrofagi, linee cellulari, è che il gran numero, quindi è possibile ottenere macrofagi primari.

La dimostrazione visiva del metodo è fondamentale poiché le fasi di autoproduzione sono difficili da imparare e richiedono pratica e, per raggiungere il successo, disinfettare la pelle di un topo soppresso con etanolo al 70%. Fai un'incisione nella parte superiore di ciascuna zampa posteriore e tira la pelle verso il basso verso il piede per esporre il muscolo. Quindi, taglia le zampe posteriori e usa forbici e pinze sterili.

Per rimuovere la pelle, mettere le zampe in una capsula di Petri sterile da 35 millimetri contenente cinque millilitri di ghiaccio sterile. PBS freddo. Rimuovere la pelle e i muscoli attaccati alle ossa, quindi trasferire le ossa in una nuova capsula di Petri sterile contenente cinque millilitri di ghiaccio.

PBS freddo e sterile. Lavate le ossa due volte con altri cinque millilitri di PBS e poi trasferitele in un mortaio sterile contenente cinque millilitri di ghiaccio. PBS freddo e sterile.

Ora taglia la tibia dal femore all'altezza dell'articolazione e usa un pestello per schiacciare delicatamente le ossa. Raccogliere tre volte il surnatante in provette ghiacciate da 15 millilitri. Quindi filtrare la sospensione tissutale attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micron.

Per rimuovere i frammenti solidi, centrifugare il filtrato e scartare delicatamente il surnatante. Dissociare il pellet con il tampone di lisi dei globuli rossi, aggiungendo 20 millilitri di DMEM completo a freddo ghiacciato dopo 30 secondi per fermare la reazione dopo aver centrifugato le cellule, sospendiamo il pellet in 20 millilitri di 37 gradi Celsius, completiamo il DMEM e quindi dividiamo la sospensione cellulare tra due piastre di Petri da 100 millimetri. Incubare le piastre per quattro ore a 37 gradi Celsius, quindi raccogliere i surnatanti in provette da 50 millilitri a temperatura ambiente.

Dopo aver centrifugato i surnatanti, risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM completo integrato con il surnatante L 9 29 cellule precedentemente preparato, quindi filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare in nylon da 40 micron. Aggiungere il filtrato a 140 millilitri di DMEM completo e terreno cellulare L 9 29, quindi distribuire 10 millilitri di sospensione cellulare per piatto in 15 piastre Petri da 100 millimetri. Dopo aver incubato le cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica a 10 millilitri di DMEM completo più surnatante L 9 29 e incubare le cellule per altri quattro giorni.

Monitorando periodicamente la crescita cellulare con un microscopio invertito per raccogliere i macrofagi derivati dal midollo osseo, aspirare e scartare prima il surnatante. Quindi lavare le piastre di Petri due volte con DMEM completo. Successivamente, aggiungi cinque millilitri di DMEM completo a 37 gradi Celsius e usa un poliziotto di gomma per staccare delicatamente le cellule, raccogliere i macrofagi derivati dal midollo osseo in provette da 50 millilitri e quindi far girare le cellule.

Resus sospendendo i pellet in 20 millilitri di DMEM completo. Infine, contare le celle in base all'esclusione triam blue. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere un gran numero di macrofagi in pochi giorni dopo aver isolato e placcato le cellule rotonde del midollo osseo non aderenti meno i macrofagi residenti nel midollo osseo, come appena dimostrato.

Queste cellule precursori BMDM rappresentative sono state incubate con G-M-C-S-F. Dopo tre giorni, le cellule hanno iniziato ad aderire e a differenziarsi in macrofagi. Dopo sette giorni, è stato osservato un monostrato confluente di macrofagi derivati dal midollo osseo.

L'analisi citofluorimetrica per F 4 80 e H-L-A-D-R ha rivelato che i macrofagi derivati dal midollo osseo esprimevano entrambi i marcatori confermando la differenziazione delle cellule del midollo osseo in macrofagi. Valutare le capacità acide PHA dei macrofagi derivati dal midollo osseo. La capacità delle cellule di internalizzare la velocità del lattice è stata monitorata come previsto.

È stato determinato che il numero di perle per cellula aumenta nel tempo per valutare il loro potenziale endocitico. Anche i macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati co-coltivati con Coxiella. È stato osservato che l'LPS dell'occhio di Burnett in rosso era localizzato in un compartimento che ospitava la proteina di membrana associata al lisosomiale uno in blu, ma non la catepsina D in verde, dimostrando che l'LPS era presente negli endosomi tardivi, che non sono in grado di fondersi con i lisosomi come previsto dal macrofago derivato dal midollo osseo.

Le interazioni batteriche tra patogeni e patogeni sono state ulteriormente analizzate attraverso la loro infezione mediante TMA Wiley eye. Come previsto, i batteri in rosso non erano localizzati nel compartimento che ospita KPS e D, che appare nuovamente in verde. In questo immuno blot rappresentativo, sono state valutate le vie di trasduzione del segnale dei macrofagi derivati dal midollo osseo, dimostrando che i macrofagi derivati dal midollo osseo come i tessuti, i macrofagi isolati sovraregolano i livelli di chinasi fosforilata P 38 alfa map in risposta alla stimolazione dell'EPS di esia coli.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia cellulare, come ad esempio a quale compartimento intracellulare micro localizzato.