Protocolli per l'analisi del ruolo delle cellule Paneth in Rigenerazione della murino Intestino con condizionale Cre-lox Modelli mouse

L'obiettivo generale di questa procedura di dissezione è dimostrare come isolare e preparare l'intestino del topo per le successive tecniche di caratterizzazione. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare la capacità delle cellule staminali intestinali di ripopolare l'intestino seguendo una procedura sperimentale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata seguendo qualsiasi tecnica o procedura o dopo la manipolazione genetica Utilizzando la tecnologia dei blocchi di gamberi Inizia posizionando un topo adulto soppresso in posizione supina e bagnando la pelliccia con il 70% di etanolo.

Quindi, usando le forbici, aprire la cavità intraperitoneale longitudinalmente lungo la linea mediana e fissare lo stomaco con una pinza. Quindi, recidere la connessione con l'esofago e tirare delicatamente lo stomaco per rimuovere l'intestino tenue fino all'appendice. Quindi tirare delicatamente l'appendice per rimuovere l'intestino crasso fino all'ano.

Una volta che l'intestino è stato isolato, rimuovere lo stomaco nell'appendice e utilizzare una siringa dotata di una punta di pipetta con estremità smussata per lavare l'intestino con PBS Immediatamente dopo il lavaggio, tagliare l'intestino in tre sezioni di uguali dimensioni, prossimale, centrale e distale. Quindi tagliare ogni sezione in pezzi di un centimetro e posizionare da tre a cinque frammenti di tessuto al centro di un pezzo di nastro chirurgico di due centimetri per due. In una formazione piramidale, quando tutti i tessuti sono stati attaccati, sigillare il nastro attorno ai pezzi longitudinalmente creando una pila di tronchi.

Quindi posizionare il nastro in un recipiente a fondo piatto contenente almeno 10 volte il volume di neutro, tamponato, formale e fissativo rispetto al volume del tessuto, e conservare i campioni a quattro gradi Celsius prima dell'inclusione e del sezionamento. Dopo la fissazione, trasferire il tessuto in un recipiente a fondo piatto contenente almeno 10 volte il volume di etanolo al 70% del volume di tessuto per fissare il tessuto in Metcon subito dopo il lavaggio. Tagliare l'intestino in tre sezioni di uguali dimensioni come appena dimostrato.

Quindi posizionare ogni sezione una accanto all'altra su un pezzo di carta da filtro di 15 x 15 centimetri e utilizzare le forbici ad arco a molla per aprire le sezioni su FOSS quando tutte le sezioni sono state divise. Trasferire la carta da filtro in una capsula di vetro contenente Metcon appena preparato per tre-24 ore a temperatura ambiente al termine della fissazione, utilizzare una pinza per raccogliere l'estremità di ciascuno dei pezzi di intestino uno alla volta e avvolgere i tessuti attorno alla pinza per formare singoli rotoli svizzeri. Fissare ogni rotolo aprendo leggermente la pinza e inserendo un ago calibro 25 attraverso il tessuto.

Quindi posizionare i tessuti arrotolati in un recipiente a fondo piatto contenente almeno 10 volte il volume di formula tamponata neutra e fissativo dei tessuti per almeno un'ora prima del trattamento per la visualizzazione lassy dell'intero Monte lassy dello scoppio del tessuto. Versare la cera grezza fusa mescolata con olio minerale in piastre di Petri da 15 centimetri. Quindi, subito dopo aver lavato l'intestino con PBS ghiacciato, sciacquare i tessuti con 25 millilitri di fissativo ex cal ghiacciato.

Dopo il fissaggio, tagliare l'intestino in tre o cinque sezioni uguali e posizionare ciascuna sezione su una delle piastre di cera raffreddate. Appuntare ciascuna estremità in modo che le sezioni siano leggermente allungate con le linee mesenteriche nella parte superiore delle piastre. Taglia il mesentere in eccesso.

Quindi usa le forbici per arco a molla per tagliare le budella bloccandole longitudinalmente mentre vengono aperte quando tutte le sezioni sono state bloccate. Inondare le piastre con una quantità di fissativo xal sufficiente a coprire tutti i tessuti dopo almeno un'ora a quattro gradi Celsius. Utilizzare una pipetta da 25 millilitri o una siringa per rimuovere il fissativo e lavare i fazzoletti una volta con 30 millilitri di PBS.

Quindi coprire le sezioni con 30 millilitri di soluzione unificante DTTD per un'incubazione da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente con oscillazione. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione divinizzante con una pipetta o una siringa da 25 millilitri e inondare i tessuti con altri 30 millilitri di PBS. Quindi utilizzare una pipetta posteriore per rimuovere il muco con il PBS dopo il lavaggio.

Sostituire il PBS con 30 millilitri di xal per una macchia notturna a temperatura ambiente al buio con una leggera agitazione su una piattaforma a dondolo la mattina successiva. Se le sezioni hanno sviluppato una macchia blu-verde, sostituire l'xal con 30 millilitri di PBS. Dopo tre minuti di leggera agitazione, preparare dei rotoli svizzeri come appena dimostrato e posizionare i fazzoletti in un recipiente a fondo piatto a bocca larga contenente almeno 10 volte il volume di fissativo appropriato come il volume di tessuto a quattro gradi Celsius per almeno 24 ore prima dell'inclusione e del sezionamento.

Utilizzando il reporter condizionale ROSA 26 R Laxy, è possibile osservare una ricombinazione del 100% tre giorni dopo l'induzione nell'intestino tenue utilizzando il DNA estratto dalle culle ricombinate. La QPCR per gli alleli ricombinati ha dimostrato un aumento non significativo della ricombinazione all'interno del sistema VI crease, potenzialmente dovuto alla ricombinazione nelle cellule di paneth non osservata. Utilizzando il sistema di piega ah utilizzando il reporter laxy, entrambi i sistemi hanno anche dimostrato una perdita completa di cellule ricombinate a tre giorni dall'induzione.

I dati sulla mitosi e sull'altezza cellulare della cripta K hanno indicato che il sistema ah H Cree potrebbe riprendersi presumibilmente a causa del ripopolamento da parte di cellule staminali intestinali non combinate. In netto contrasto, il criminale Cree non riuscì a riprendersi nonostante conservasse le celle epiteliali della cripta. Inoltre, le cellule della cripta nei topi floccati vi Cree Cantin B erano non proliferative e mancavano di espressione del marcatore delle cellule staminali intestinali.

EM quattro. A differenza delle cripte nei topi ah cre, allo stesso modo, le cellule PTH hanno subito l'apoptosi dopo la delezione di Caden b solo all'interno del sistema VI Cree. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa 10 minuti.

È importante ridurre al minimo i ritardi per prevenire la degradazione dei tessuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rimuovere l'intestino da un topo per l'analisi a valle.