Ablazione laser e microscopia intravitale per studiare il rimodellamento intestinale

I modelli di lesioni sono indispensabili per studiare la rigenerazione in vivo, tuttavia, studiare la rigenerazione nell'intestino si è dimostrato una sfida tecnica. La mancanza di protocolli di imaging longitudinale ha impedito una comprensione più approfondita delle dinamiche della scala cellulare e tissutale che orchestrano la rigenerazione intestinale. In questo protocollo, descriviamo un metodo di microscopia intravitale che induce localmente danni tissutali su scala singola e segue la risposta rigenerativa dell'epitelio intestinale nel topo vivente al danno di ablazione laser basato su fotoni di una singola cripta o campi intestinali più grandi in modo controllato nel tempo e nello spazio.

L'imaging intravitale successivo, ripetitivo a lungo termine consente il monitoraggio dell'area danneggiata nel tempo e consente il monitoraggio delle dinamiche della cripta durante il recupero dei tessuti per un periodo di più settimane. Indurre i topi iniettando tamoxifene sciolto in olio di girasole in quattro-sei settimane prima dell'intervento chirurgico. Applicare l'analgesia, iniettare 200 microlitri di buprenorfina per via sottocutanea 30 minuti prima dell'intervento.

Somministrare carprofen in acqua potabile 24 ore prima dell'intervento. Introdurre strumenti chirurgici sterili autoclavati nell'armadio a rischio biologico. Accendere il termoforo e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius.

Accendere la camera di controllo della temperatura del microscopio almeno quattro ore prima dell'imaging. Mantenere stabile la temperatura all'interno della camera climatica a 37 gradi Celsius. Accendi il microscopio a due fotoni, lo scanner e il laser.

Avviare il software di imaging. Regolare la lunghezza d'onda del laser a 960 nanometri e aprire l'otturatore. Anestetizzare il mouse usando da due a 3% di isoflurano e posizionarlo su una piastra elettrica coperta da un panno sterile.

Controllare la profondità dell'anestesia valutando la frequenza e la qualità della respirazione un respiro al secondo e controllando il riflesso del topo. Coprire gli occhi del topo con un unguento per gli occhi. Iniettare 200 microlitri di soluzione salina sterile preriscaldata per via sottocutanea.

Rasare l'addome e rimuovere i capelli. Cambiare il panno sterile nell'area chirurgica. Inserire la sonda rettale per monitorare la temperatura del mouse.

La temperatura dovrebbe essere approssimativamente a 37 gradi Celsius. Indossare un nuovo paio di guanti sterili. Pulire l'area chirurgica in modo circolare alternando scrub di soluzione antisettica seguita da 80% di etanolo tre volte.

Coprire il mouse con un drappo chirurgico sterile. Controllare il riflesso del mouse. Fai un'incisione verticale della linea mediana di 10 millimetri attraverso la pelle usando un bisturi sterile.

Incidi la linea alba usando le forbici per separare i muscoli addominali retti e aprire l'addome. Trova il cieco del topo usando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione salina preriscaldata per usarlo come punto di riferimento. Fai un piccolo taglio in un pezzo di garza, bagnalo in soluzione salina sterile preriscaldata e posizionalo sopra l'incisione.

Estrarre l'intestino con tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina sterile preriscaldata. Mantenere l'intestino idratato aggiungendo soluzione salina sterilizzata preriscaldata. Trasferire il mouse in una scatola di imaging sterile preriscaldata.

Posizionare l'intestino sul vetro sterile. Posizionare la testa del topo all'interno del tubo di inalazione della scatola di imaging. Se necessario, fissare il mouse con pellicola flessibile sterile e nastro adesivo.

Posizionare la scatola di imaging contenente il mouse nella camera del microscopio. Monitorare il mouse durante l'imaging controllando la frequenza e la profondità della respirazione e la temperatura tramite una sonda rettale ogni 15 minuti. L'isoflurano deve essere mantenuto tra l'uno e il 2%Trova una regione nell'intestino usando gli IP del microscopio.

Ottenere un'ampia visione a campo della regione di interesse utilizzando la fotocamera interna del microscopio. Immagine della regione di interesse utilizzando il laser a 960 nanometri del microscopio multifotone. Regolare la potenza e la lunghezza d'onda del laser in base alle fluoroforme utilizzate nell'esperimento.

In questo esempio, la membrana espressa dalle cripte è una proteina fluorescente rossa e sono marcate stocasticamente con proteine fluorescenti verdi dopo induzione con una dose finale bassa di tamoxifene. Acquisire uno stack Z da 10 a 20 passi di tre micron della regione di interesse. Scegli una singola posizione o più posizioni dall'immagine del riquadro in precedenza.

Utilizzare la funzione di calibrazione del punto di violazione nel software di imaging con zoom 32 e 124 per 124 pixel di risoluzione con una velocità di scansione di 400 hertz utilizzando la proprietà di scansione bidirezionale da tre a 10 secondi, a seconda delle dimensioni del danno previsto. L'inizio del danno nell'area della cripta può essere riconosciuto da un aumento dell'autofluorescenza sia nel canale verde che in quello rosso. Dopo l'ablazione, acquisire Z-stack delle regioni danneggiate per confermare la posizione e l'entità del danno.

Ripetere i due passaggi precedenti per più regioni nello stesso mouse. Posizionare il topo mentre è ancora sotto anestesia su un'area di sutura sterile e coprire con un drappeggio sterile. Inserire nuovamente l'intestino esposto nell'addome utilizzando tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina sterile preriscaldata.

Suturare la linea alba eseguendo una semplice sutura continua utilizzando suture assorbibili. Chiudere le estremità della sutura con nodi chirurgici. Ripeti lo stesso passaggio con lo strato della pelle.

Spegnere la stazione di isoflurano, pulire e sterilizzare la scatola di imaging e l'intarsio. Lasciare che il topo si riprenda dall'intervento chirurgico mentre la gabbia viene posizionata sulla piastra riscaldante per un'ora. Iniettare 200 microlitri di buprenorfina per via sottocutanea da sei a 12 ore dopo l'intervento.

Somministrare carprofen in acqua potabile per 72 ore dopo l'intervento. Pesare il topo e monitorare il benessere ogni giorno per una settimana dopo l'intervento. Sul secondo punto temporale almeno una settimana dopo la prima sessione di imaging, ripetere l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale.

Usa il modello dei vasi sanguigni per ritrovare le stesse regioni di interesse immagine al primo punto temporale. Se il topo non è destinato ad essere ripreso in un altro punto temporale, sacrificare il topo eseguendo la dislocazione cervicale in anestesia. Altrimenti, continuare con la chiusura del sito chirurgico e delle cure post-operatorie.

I topi K19-Cre ERT mTmG sono stati iniettati con tamoxifene per indurre la marcatura stocastica delle cellule con GFP da quattro a sei settimane prima dell'intervento chirurgico e della prima sessione di imaging. Dopo aver esposto chirurgicamente l'intestino del mouse e acquisito immagini della fotocamera e fluorescenti della regione di interesse, le impostazioni del punto di violazione del laser multifotone vengono utilizzate per ablare le cripte. L'inizio del danno può essere riconosciuto da un aumento dell'autofluorescenza sia nel canale verde che in quello rosso.

La stessa procedura viene ripetuta un mese dopo e la vascolarizzazione viene utilizzata come punto di riferimento per ritrovare la stessa regione. Utilizzando il modello di coriandoli Lgr5-eGFP, le cripte etichettate con colori diversi possono essere seguite nel tempo per mappare le dinamiche di recupero. In questo esempio, le cripte in verde esprimono il Lgr5 Cre, e una cripta in magenta è etichettata con il colore dei coriandoli.

Diverse modalità di rigenerazione sono osservate due settimane dopo l'ablazione laser. Alcune regioni rimangono invariate, mentre altre regioni mostrano un rimodellamento in forme di fissione della cripta, quindi la divisione di una cripta in due, o la fusione, la fusione di due cripte in una, o la scomparsa della cripta. L'ablazione laser combinata con il metodo di microscopia intravitale limita il danno a una regione di interesse definita.

Questo ci consente di controllare la posizione del danno e l'entità del danno. La gravità del danno può essere modulata per ablare cripte o interi campi intestinali per informarci sulla risposta rigenerativa alla scala della cripta. Oltre al controllo spaziale, l'ablazione laser consente anche di cronometrare con precisione l'insorgenza del danno oltre a visualizzare lo stesso organo sia in condizioni omeostatiche che rigeneranti nello stesso topo, superando così la precisione dei precedenti modelli di lesioni.

L'applicazione dell'ablazione laser e dell'imaging intravitale ripetitivo può essere utilizzata come piattaforma per una moltitudine di domande di ricerca e diverse aree scientifiche che spaziano dalla rigenerazione, all'immunologia e alla ricerca sul cancro.