Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della
2 maggio 2013
Un metodo di micro-elettro-fluidico semiautomatico per indurre on-demand locomozione in Caenorhabditis elegans È descritto. Questo metodo si basa sul fenomeno neurofisiologico di vermi che rispondono a campi elettrici lievi ("electrotaxis") all'interno di canali microfluidica. Microfluidica electrotaxis serve come una tecnica rapida, sensibile, a basso costo, e scalabile per lo screening per i fattori che incidono sulla salute neuronale.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare anomalie nella segnalazione neuronale e neuromuscolare nell'organismo modello di C Allergan dopo esposizione chimica o manipolazione genetica. Ciò viene ottenuto innanzitutto progettando e incisione un modello di microcanale in una piastrina di silicio. Nella seconda fase, il calco di silicio viene utilizzato per ottenere uno o più microcanali in PDMS.
Successivamente, componenti accessori vengono fissati allo stampo in PDMS. In seguito, il comportamento dei vermi mentre vengono stimolati a nuotare attraverso il microcanale viene registrato mediante una telecamera montata su microscopio. Infine, l'elettromicrofluidica viene utilizzata per determinare le alterazioni nei sistemi neuronali e muscolari dei nematodi indotte da manipolazioni chimiche o genetiche, utilizzando la locomozione come parametro di lettura.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, in particolare i saggi comportamentali basati su piastre, consiste nel fatto che con questa metodica è possibile controllare con precisione la direzione della locomozione del verme, consentendo una quantificazione accurata di comportamenti locomotori come la frequenza delle flessioni corporee, il tempo di rotazione e la velocità natatoria. Le implicazioni di questa tecnica riguardano anche la terapia di disturbi neurodegenerativi come il morbo di Parkinson e quello di Alzheimer, poiché può essere utilizzata per identificare fattori chimici e genetici dotati di proprietà neuroprotettive. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questa tecnica quando abbiamo compreso che mancava un metodo per analizzare il comportamento motorio in modo quantitativo.
Il movimento è volontario e casuale, ed è difficile da caratterizzare. Pertanto, abbiamo voluto stabilire un metodo semplice che chiunque possa imparare. Per realizzare lo stampo master, immergere innanzitutto una piastrina di silicio da tre pollici in acetone e successivamente in metanolo per 30 secondi ciascuno. Risciacquare quindi la piastrina con acqua deionizzata per cinque minuti.
Successivamente, utilizzare una pistola ad azoto per asciugare la superficie della piastrina e quindi riscaldare la piastrina su una piastra riscaldante a 120 gradi Celsius dopo due minuti; ossidare al plasma la superficie della piastrina di silicio a 50 watt per un minuto. Ora, utilizzando tre millilitri di resist foto-sensibile SU-8 100, rivestire la superficie della piastrina mediante spin-coating a 1.750 giri al minuto per 40 secondi, quindi preriscaldare la piastrina rivestita su una piastra riscaldante a 65 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, aumentare la temperatura a 95 gradi Celsius nell'arco di due minuti e cuocere la piastrina per un'ulteriore ora.
Dopo aver rimosso la piastrina dalla piastra riscaldata, posizionare una maschera fotografica con il disegno desiderato sulla piastrina. Esporre il fotoresistente alla luce UV per 95 secondi. Successivamente, effettuare una cottura post-esposizione della piastrina su una piastra riscaldata, utilizzando lo stesso gradiente di temperatura impiegato per la cottura pre-esposizione.
Immergere la wafer in SU eight. Preparare una soluzione per 10-15 minuti. Risciacquare la wafer con isopropanolo per confermare il completamento dello sviluppo del disegno.
Quindi risciacquare con acqua deionizzata per 30 secondi. Infine, asciugare la piastrina con una pistola a azoto e riscaldare brevemente a 120 gradi Celsius. Ora, posizionare il master stampo realizzato e una piastrina di silicone nuova in due piatti di Petri separati, foderati con carta di alluminio.
Versare 20 millilitri di prepolimero di PDMS nel piatto contenente il master mold e 15 millilitri nel piatto contenente il wafer vuoto. Successivamente, premere delicatamente sui wafer con un applicatore di legno monouso per eliminare eventuali bolle d'aria presenti al di sotto dei wafer, quindi coprire entrambi i piatti e lasciarli a riposo per un giorno per consentire la polimerizzazione. Dopo che i wafer si sono polimerizzati, rimuovere la pellicola e staccare il PDMS.
Quindi utilizzare un punzone Harris da 2,5 millimetri per creare i porti di accesso del fluido alle due estremità del canale nel PDMS proveniente dallo stampo master. Tagliare entrambi i dischi di PDMS in strisce di dimensioni simili. Successivamente, in una camera bianca, caricare il canale, la striscia di PDMS non strutturata e un vetrino in un ossidante al plasma.
Esporre i materiali al plasma di ossigeno a una potenza di 40 watt per 40 secondi. Quindi incollare il pezzo del canale e il vetrino su lati opposti della striscia vuota e mettere da parte i materiali per completare l'adesione. Dopo due ore, utilizzare il prepolimero di PDMS per attaccare due pezzi di tubo in plastica di almeno sei pollici di lunghezza ai serbatoi perforati su una piastra riscaldante a 120 gradi Celsius.
Lasciare polimerizzare il PDMS prima di proseguire. Quindi applicare un connettore plastico fluidico a uno dei tubi per permettere l'attacco di siringhe. Inserire ora lunghezze di tre pollici di filo di rame isolato calibro 22 in ciascun serbatoio tra il tubo di ingresso e il canale, fissando i fili con ulteriore prepolimero di PDMS.
Iniziare questo passaggio posizionando il microcanale appena assemblato su un piano mobile XY di un microscopio dotato di una telecamera collegata a un monitor; collegare l'alimentatore agli elettrodi del microcanale. Dopo aver verificato che la resistenza del microcanale sia di circa 0,6 megaohm, collegare il tubo di uscita del microcanale a una siringa monouso. Successivamente, immergere l'imboccatura del tubo di ingresso in una soluzione di nematodi sospesi nel buffer fisiologico M nove.
Applicare una pressione negativa all'interno della siringa per aspirare il liquido nel canale. Quando i tubi di ingresso e di uscita sono entrambi pieni, scollegare la siringa e l'elemento idrostatico. Regolare il flusso modificando l'altezza relativa dei tubi per posizionare un verme al centro del canale.
Quindi posizionare entrambi i tubi in posizione orizzontale alla stessa altezza per mantenere un flusso nullo all'interno del microcanale. Quando si sostituiscono i campioni di vermi durante un esperimento di elettrotassi, dopo aver livellato entrambi i tubi di ingresso alla stessa altezza, se persiste un flusso, effettuare piccole regolazioni dell'altezza dei tubi l'uno rispetto all'altro. Se non si è certi che il flusso sia effettivamente nullo, è possibile indurre un'inversione del movimento del verme cambiando la polarità del campo elettrico e quindi valutare la velocità lineare del verme mentre inverte la direzione.
Ora impostare l'alimentatore sulla tensione appropriata. Attivare il segnale elettrico e attendere un minuto di pre-esposizione per consentire al verme di abituarsi al campo; durante questo periodo, il verme dovrebbe iniziare a muoversi verso il catodo. Trascorso il minuto, iniziare la registrazione.
Al termine dell'esperimento, rimuovere tutti i liquidi e i vermi dal canale. Risciacquare la camera con acqua deionizzata e lasciare l'apparecchio su una piastra riscaldante a 125 gradi Celsius per asciugarlo. In questo video rappresentativo, vengono mostrati un asse elettro di un nematode adulto di tipo selvatico giovane e i relativi dati di posizione e velocità ottenuti dal software di tracciamento dei vermi.
Il video inizia con la catodo a destra. L'aspetto della pipetta di vetro indica l'imminente inversione, mentre la successiva rimozione del segnale della pipetta. Il momento dell'inversione qui, i dati di posizione rispetto al tempo e di velocità istantanea rispetto al tempo, provenienti dal programma personalizzato di tracciamento del verme, sono mostrati per il verme nel video; il programma ha calcolato la curva di velocità a partire dalla curva posizione-tempo.
Questo grafico a scatola mostra i dati di velocità elettrotattica provenienti da un insieme di animali di tipo selvaggio e transgenici. Gli animali transgenici di tipo T esprimono il gene umano dell'alpha-sinucleina nei muscoli della parete corporea sotto il controllo del promotore del gene della miosina pesante UNC-54, il che provoca aggregazione proteica e si manifesta con una risposta elettrotattica più lenta rispetto a quella degli animali di tipo selvaggio. Una volta acquisita padronanza, è possibile sottoporre a saggio più di 20 vermi ogni ora, se l'esperimento di elettrotassi viene eseguito correttamente.
Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che solo le mutazioni e le sostanze chimiche che influenzano la locomozione o la sensibilità elettro-sensoriale produrranno fenotipi rilevabili mediante il saggio di elettrotassi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come creare un modello in silicone, come assemblare un canale microfluidico e come analizzare la locomozione di N metodo utilizzando un saggio di assi.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo micro-elettro-fluidico semi-automatico per indurre la locomozione su richiesta in Caenorhabditis elegans. La tecnica sfrutta il fenomeno dell'elettrotassi, consentendo lo screening rapido di fattori che influenzano la salute neuronale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Microfluidica
- Analisi del Comportamento
Sfondo
- Caenorhabditis elegans è un organismo modello per lo studio della segnalazione neuronale e neuromuscolare.
- L'elettrotassi è una risposta neurofisiologica ai campi elettrici.
- I canali microfluidici permettono esperimenti controllati su organismi di piccole dimensioni.
- Comprendere la locomozione può fornire informazioni sullo stato di salute neuronale.
Scopo dello studio
- Identificare anomalie nella segnalazione neuronale e neuromuscolare.
- Valutare gli effetti dell'esposizione a sostanze chimiche o della manipolazione genetica.
- Utilizzare la locomozione come parametro di lettura per modifiche neuronali e muscolari.
Metodi Utilizzati
- Progettazione e incisione di schemi di microcanali in wafer di silicio.
- Stampaggio di microcanali in PDMS utilizzando stampi di silicio.
- Collegamento di componenti accessori allo stampo in PDMS.
- Registrazione del comportamento dei vermi mediante una telecamera montata sul microscopio.
Risultati principali
- Induzione riuscita della locomozione in C. elegans mediante elettrotassi.
- Identificazione di modifiche nei sistemi neuronali e muscolari.
- Dimostrazione dell'elettrotassi microfluidica come metodo scalabile per lo screening.
- Informazioni sugli effetti delle manipolazioni genetiche e chimiche.
Conclusioni
- La elettotassi microfluidica è uno strumento prezioso per la ricerca in neuroscienze.
- Questo metodo fornisce un approccio economico e sensibile allo studio della salute neuronale.
- Ulteriori applicazioni potrebbero migliorare la comprensione dei disturbi neuromuscolari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'analisi quantitativa della locomozione in C. elegans consente lo screening ad alto rendimento di composti neuroprotettivi e modificatori genetici nei modelli di malattie neurodegenerative. Convertendo i difetti del segnale neuronale in risposte elettotattiche misurabili, questo metodo supporta la validazione precoce degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nei percorsi di scoperta. Il formato microfluidico fornisce letture fenotipiche scalabili e riproducibili che migliorano l'affidabilità predittiva nelle campagne di identificazione di composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche collegando la funzione dei neuroni dopaminergici a fenotipi locomotori quantificabili.
- Valore operativo: Consente una valutazione rapida di manipolazioni genetiche e chimiche che influenzano la segnalazione neuronale, mediante stimolazione on-demand di elettrotassi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli identificando composti in grado di ripristinare i difetti del movimento nei modelli di MP, prima di studi mammiferi costosi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output standardizzati e quantitativi, come la velocità natatoria e la frequenza di flessione del corpo, per la prontezza del saggio.
- Valore operativo: Favorisce il potenziale di automazione grazie al controllo microfluidico della posizione dei vermi e all'inversione della polarità del campo per misurare i tempi di inversione.
- Scalabilità: Permette lo screening di oltre 20 vermi all'ora, consentendo schermate primarie efficienti per fattori neuroprotettivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Utilizza la locomozione come lettura funzionale rilevante per la malattia, che si correla con la neurodegenerazione dopaminergica nei modelli di Parkinson di C. elegans.
- De-risking meccanicistico: Distingue gli effetti neurotossici dalla tossicità generale isolando i difetti del segnale neuronale attraverso alterazioni della risposta elettrotattica.
- Allineamento del biomarcatore: Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali quantificando la variabilità elettrotattica dipendente dall'età negli adulti giovani rispetto alle larve.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio di elettrotassi microfluidico si integra nei flussi di lavoro di scoperta come piattaforma di screening fenotipico tra la conferma dell'interazione con il bersaglio e l'ottimizzazione del composto leader, fornendo informazioni meccanicistiche sulla vitalità neuronale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su geni e composti neuroprotettivi quantificando il recupero della locomozione in modelli di malattia.
- Screening: Fornisce metriche quantitative e riproducibili della locomozione che permettono la valutazione del fattore Z' e della robustezza del saggio.
- Analisi: Fornisce dati temporali di posizione e velocità per l'analisi cinetica della dinamica della risposta elettotattica.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando variazioni della risposta dipendenti dall'età, rilevanti per le neurodegenerazioni ad insorgenza tardiva.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening incrociato di modulatori neuronali in diversi contesti genetici e ceppi, come C. briggsae.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei test neuronali isolando la locomozione come parametro specifico per la funzione neuromuscolare.
- Valore operativo: Standardizza la manipolazione dei vermi e la somministrazione dello stimolo, riducendo la variabilità derivante dai saggi manuali e consentendo la riproducibilità tra diversi siti.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale accelerando le decisioni di tipo go/no-go mediante un profilo fenotipico precoce di candidati neuroprotettivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei risultati positivi aggiustata per il rischio, basata sul recupero elettrotattico dose-dipendente in modelli transgenici che esprimono proteine umane associate a malattie.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di dispositivi microfluidici, inclusa la fotolitografia e le tecniche di legame del PDMS.
- Richiede l'accesso a sistemi di telecamere montate su microscopio e alimentatori programmabili per un controllo preciso del campo elettrico.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di preparazione dei vermi, inclusa la sincronizzazione per età e il condizionamento con buffer M9.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende il saggio ad altre specie di nematodi o a geometrie di canale diverse.
- È limitato al rilevamento di fenotipi che influenzano la locomozione o la sensibilità elettrica, come confermato dal materiale di origine che indica come solo tali mutazioni o sostanze chimiche producano risposte rilevabili.
