Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della Caenorhabditis elegans 'Locomotion
May 2nd, 2013
Un metodo di micro-elettro-fluidico semiautomatico per indurre on-demand locomozione in Caenorhabditis elegans È descritto. Questo metodo si basa sul fenomeno neurofisiologico di vermi che rispondono a campi elettrici lievi ("electrotaxis") all'interno di canali microfluidica. Microfluidica electrotaxis serve come una tecnica rapida, sensibile, a basso costo, e scalabile per lo screening per i fattori che incidono sulla salute neuronale.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare anomalie nella segnalazione neuronale e neuromuscolare nell'organismo modello di C Allergan in seguito all'esposizione chimica o alla manipolazione genetica. Ciò si ottiene progettando e incidendo prima un modello di microcanali in un wafer di silicio. Durante la seconda fase, lo stampo in silicone viene utilizzato per fondere uno o più micro canali da PDMS.
Quindi i componenti accessori vengono fissati allo stampo PDMS. Successivamente, il comportamento dei vermi mentre vengono stimolati a nuotare attraverso il microcanale viene registrato utilizzando una telecamera montata sul microscopio. In definitiva, l'elettromicrofluidica viene utilizzata per determinare i cambiamenti nei nematodi, nei sistemi neuronali e muscolari dovuti a manipolazioni chimiche o genetiche con locomozione come lettura.
Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, in particolare i saggi comportamentali basati su piastra, è che con questa tecnica, la direzione di locomozione del verme può essere strettamente controllata, consentendo una quantificazione precisa dei comportamenti della locomotiva come la frequenza di curvatura del corpo, il tempo di rotazione e la velocità di nuoto. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di malattie neurodegenerative come il Parkinson e l'Alzheimer perché può essere utilizzata per lo screening di fattori chimici e genetici con proprietà neuroprotettive. Abbiamo avuto l'idea di questa tecnica quando ci siamo resi conto che mancava un metodo per analizzare il comportamento del movimento in modo quantitativo.
Il movimento è volontario e casuale, ed è difficile da caratterizzare. Quindi, abbiamo voluto stabilire un metodo semplice che tutti possono imparare: per realizzare lo stampo master, iniziare bagnando un wafer di silicio da tre pollici in acetone e poi metanolo per 30 secondi ciascuno. Quindi sciacquare il wafer con acqua deionizzata per cinque minuti.
Quindi, utilizzare una pistola ad azoto per asciugare la superficie dei wafer e quindi riscaldare il wafer su una piastra calda a 120 gradi Celsius dopo due minuti, ossidare al plasma la superficie del wafer di silicio a 50 watt per un minuto. Ora utilizzando tre millilitri di SU eight 100 photo resist centrifugare la superficie del wafer a 1, 750 giri/min per 40 secondi, quindi pre-cuocere il wafer rivestito su una piastra calda a 65 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, aumentare la temperatura a 95 gradi Celsius in due minuti e cuocere la cialda per un'altra ora.
Dopo aver rimosso il wafer dalla piastra riscaldante, disporre una maschera fotografica del design desiderato sopra il wafer. Esporre il fotoresist alla luce UV per 95 secondi. Quindi post-cuocere la cialda su una piastra calda utilizzando lo stesso gradiente di temperatura utilizzato per il precotto dopo la post-cottura.
Immergere il wafer in SU otto. Sviluppa una soluzione per 10-15 minuti. Sciacquare il wafer con isopropanolo per confermare il completamento dello sviluppo del progetto.
Quindi risciacquare con acqua deionizzata per 30 secondi. Infine, asciugare la cialda con una pistola ad azoto e infornare brevemente a 120 gradi Celsius. Ora, posiziona lo stampo master fabbricato e un wafer di silicone vuoto in due piastre di Petri separate rivestite con un foglio di alluminio.
Versare 20 millilitri di prepolimero PDMS nello stampo master e nel piatto e 15 millilitri nel piatto di wafer vuoto. Successivamente, premere delicatamente sui wafer con un applicatore di legno usa e getta per eliminare eventuali sacche d'aria sotto i wafer, quindi coprire entrambi i piatti e metterli da parte per un giorno a polimerizzare. Dopo che i wafer si sono induriti, rimuovere la pellicola e staccare il PDMS.
Quindi utilizzare un unicorno Harris da 2,5 millimetri per perforare le porte di accesso al fluido su entrambe le estremità del canale nel PDMS dallo stampo master. Tagliare entrambi i dischi PDMS in strisce di dimensioni simili. Quindi, in una camera bianca, caricare il canale, la striscia PDMS vuota e un vetrino in un ossidatore al plasma.
Esporre i materiali al plasma di ossigeno a 40 watt di potenza per 40 secondi. Quindi incollare il pezzo del canale e il vetrino ai lati opposti della striscia vuota e mettere da parte i materiali per completare l'incollaggio. Dopo due ore, utilizzare il prepolimero PDMS per collegare due pezzi di tubo di plastica lunghi almeno sei pollici ai serbatoi perforati su una piastra calda a 120 gradi Celsius.
Lasciare indurire il PDMS prima di continuare. Quindi fissare un connettore di plastica fluidica a uno dei tubi per consentire il fissaggio della siringa. Ora, inserire tre pollici di filo di rame isolato calibro 22 in ciascun serbatoio tra il tubo di ingresso e il canale che fissa i fili con più prepolimero PDMS.
Iniziare questo passaggio posizionando il microcanale appena assemblato su un tavolino mobile XY di un microscopio con una fotocamera montata collegata a un monitor, collegare l'alimentazione agli elettrodi dei microcanali. Dopo aver confermato che la resistenza del microcanale è di circa 0,6 mega ohm, collegare il tubo di uscita del microcanale a una siringa monouso. Quindi immergere l'imboccatura del tubo di ingresso in una soluzione di nematodi sospesa in tampone fisiologico M nove.
Applicare una pressione negativa all'interno della siringa per aspirare il liquido nel canale. Quando i tubi di ingresso e di uscita sono entrambi pieni, scollegare la siringa e l'idrostatica. Manipolare il flusso regolando l'altezza relativa dei tubi per posizionare una vite senza fine al centro del canale.
Quindi stendere entrambi i tubi alla stessa altitudine per mantenere il flusso zero all'interno del microcanale. Quando si commutano i campioni a vite senza fine durante un esperimento di elettrotaxi, dopo aver livellato entrambi i tubi di ingresso alla stessa altezza, se c'è ancora flusso, apportare piccole regolazioni all'altezza del tubo l'uno rispetto all'altro. Se non siamo sicuri che il flusso sia davvero zero, possiamo indurre un'inversione nel movimento del verme cambiando la polarità del campo elettrico e quindi valutando la velocità lineare del verme mentre gira.
Ora imposta l'alimentatore sulla tensione appropriata. Attivare il segnale elettrico e attendere un minuto di pre-esposizione affinché il verme si acclimati al campo, durante il quale il verme dovrebbe iniziare a muoversi verso il catodo quando il minuto è trascorso. Inizia la registrazione.
Al termine dell'esperimento, rimuovere tutto il liquido e i vermi dal canale. Sciacquare la camera con acqua deionizzata e lasciare asciugare il dispositivo su una piastra calda a 125 gradi Celsius. In questo video rappresentativo, viene mostrato un elettroasse di nematodi giovani adulti di tipo selvatico e le sue uscite di posizione e velocità dal software di tracciamento dei vermi.
Il video inizia con il catodo a destra. L'aspetto della pipetta di vetro indica l'imminente inversione, la successiva rimozione dei segnali della pipetta. Il momento di inversione qui, i dati per la posizione rispetto al tempo e la velocità istantanea rispetto al tempo uscite del programma di tracciamento del verme personalizzato per il vite senza fine Nel video viene mostrato il programma calcolato la curva di velocità dalla curva del tempo di posizione.
Questo box plot mostra i dati di elettrovelocità di un insieme di animali selvatici e trenchgenic . Gli animali transgenici T esprimono il gene dell'alfa-sinucleina umana nei muscoli della parete corporea sotto il controllo del promotore del gene della catena pesante della miosina UNC 54, che causa l'aggregazione proteica e si manifesta come una risposta elettrotattica più lenta rispetto a quella degli animali di tipo selvatico. Una volta padroneggiati, più di 20 vermi possono essere analizzati ogni ora se l'esperimento dell'elettrotaxi viene eseguito correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che solo le mutazioni e le sostanze chimiche che influenzano la locomozione o la sensazione di elettrosclerosi produrranno fenotipi rilevabili dal test delle elettrotasse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come modellare un silicone. Abbiamo assemblato il canale microfluidico e come analizzare la locomozione del metodo N utilizzando un saggio axis.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo micro-elettro-fluidico semi-automatizzato per indurre la locomozione su richiesta in Caenorhabditis elegans. La tecnica sfrutta il fenomeno dell'elettrotassi, permettendo un rapido screening dei fattori che influenzano la salute neuronale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienza
- Microfluidica
- Analisi Comportamentale
Sfondo
- Caenorhabditis elegans è un organismo modello per lo studio della segnalazione neuronale e neuromuscolare.
- L'elettrotassi è una risposta neurofisiologica ai campi elettrici.
- I canali microfluidici consentono esperimenti controllati su piccoli organismi.
- Comprendere la locomozione può rivelare informazioni sulla salute neuronale.
Obiettivo dello Studio
- Identificare anomalie nella segnalazione neuronale e neuromuscolare.
- Valutare gli effetti dell'esposizione chimica o della manipolazione genetica.
- Utilizzare la locomozione come indicatore per i cambiamenti neuronali e muscolari.
Metodi Utilizzati
- Progettazione e incisione di pattern di microcanali su wafer di silicio.
- Gettatura di microcanali da PDMS utilizzando stampi in silicone.
- Fissaggio di componenti accessori allo stampo PDMS.
- Registrazione del comportamento dei vermi utilizzando una telecamera montata su microscopio.
Risultati Principali
- Induzione con successo della locomozione in C. elegans utilizzando l'elettrotassi.
- Identificazione di cambiamenti nei sistemi neuronali e muscolari.
- Dimostrazione dell'elettrotassi microfluidica come metodo di screening scalabile.
- Approfondimenti sugli effetti delle manipolazioni genetiche e chimiche.
Conclusioni
- L'elettrotassi microfluidica è uno strumento prezioso per la ricerca in neuroscienza.
- Questo metodo fornisce un approccio a basso costo e sensibile per studiare la salute neuronale.
- Ulteriori applicazioni potrebbero migliorare la comprensione dei disturbi neuromuscolari.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative locomotion analysis in C. elegans enables high-throughput screening for neuroprotective compounds and genetic modifiers in neurodegenerative disease models. By converting neuronal signaling defects into measurable electrotactic responses, this method supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The microfluidic format provides scalable, reproducible phenotypic readouts that improve predictive confidence in lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking dopaminergic neuron function to quantifiable locomotion phenotypes.
- Operational Value: Enables rapid assessment of genetic and chemical manipulations affecting neuronal signaling with on-demand electrotaxis stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue movement defects in PD models before costly mammalian studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs such as swimming speed and body bend frequency for assay readiness.
- Operational Value: Facilitates automation potential with microfluidic control of worm positioning and field polarity reversal for reversal time measurements.
- Scalability: Permits screening of over 20 worms per hour, enabling efficient primary screens for neuroprotective factors.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses locomotion as a disease-relevant functional readout that correlates with dopaminergic neurodegeneration in C. elegans PD models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes neurotoxic effects from general toxicity by isolating neuronal signaling defects via electrotactic response alterations.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by quantifying age-dependent electrotactic variability in young adults versus larvae.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic electrotaxis assay integrates into discovery workflows as a phenotypic screening platform between target hit confirmation and lead optimization, providing mechanistic insights on neuronal viability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroprotective genes and compounds by quantifying locomotor recovery in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative locomotion metrics that enable Z'-factor assessment and assay robustness evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved position and velocity outputs for kinetic analysis of electrotactic response dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent response variations relevant to late-onset neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-project screening of neuronal modulators across diverse genetic backgrounds and strain backgrounds like C. briggsae.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal screening by isolating locomotion as a specific readout for neuromuscular function.
- Operational Value: Standardizes worm handling and stimulus delivery, minimizing variability from manual assays and enabling cross-site reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating go/no-go decisions through early phenotypic profiling of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on dose-responsive electrotactic recovery in transgenic models expressing human disease proteins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including photolithography and PDMS bonding techniques.
- Depends on access to microscope-mounted camera systems and programmable power supplies for precise electric field control.
- Necessitates standardization of worm preparation protocols, including age synchronization and M9 buffer conditioning.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to other nematode species or varying channel geometries.
- Limited to detecting phenotypes that affect locomotion or electro-sensation, as confirmed by source material noting that only such mutations or chemicals yield detectable responses.
