Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i cambiamenti nei network capillari corticali dopo un'esposizione prolungata alla virotossina del virus dell'HIV, tat. Questo metodo può aiutare a esaminare modifiche chiave nella morfologia dei capillari corticali che potrebbero contribuire alla patogenesi dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una quantificazione fisiologicamente accurata di diversi parametri morfologici capillari.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patogenesi dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV, può essere applicato anche ad altre malattie in cui si verificano alterazioni vascolari, come la malattia di Alzheimer. Iniziare questa procedura applicando un gel lacrimale artificiale sugli occhi di un topo anestetizzato.

Successivamente, rasare la testa utilizzando un rasoio elettrico. Poi, applicare una soluzione di iodopovidone per sterilizzare il cuoio capelluto e lasciarla asciugare. Sotto un microscopio ottico, rimuovere il cuoio capelluto dell'animale per esporre completamente le ossa parietali, le ossa frontali caudali e il punto bregmatico.

Applicare una piccola quantità di una soluzione al dieci percento di cloruro ferrico sul cranio, al fine di asciugare la membrana per una facile rimozione. Successivamente, rimuovere la membrana secca, raschiando delicatamente il cranio con la pinzetta. Poi, applicare uno strato sottile di colla attorno alla finestra della piastra cranica.

Premere delicatamente la piastra cranica contro il cranio del mouse, in modo da mantenere l'area di interesse al centro della finestra. Successivamente, applicare una goccia di cemento dentale sulla piastra cranica per polimerizzare la colla. Poi, applicare uno strato sottile di colla lungo il bordo della finestra della piastra cranica per creare una riserva in cui contenere la soluzione salina.

Dopo che la colla si è asciugata, avvitare la piastra cranica nel supporto per la piastra cranica del mouse. Rimuovere qualsiasi residuo di colla dalla finestra della piastra cranica utilizzando una punta da trapano collegata a un microtrapano, impostato a 6.000 giri al minuto. Fermarsi ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del cranio del mouse.

Successivamente, utilizzando una nuova punta, iniziare ad assottigliare il cranio con un trapano microtorp impostato a 4.000 giri al minuto. Muovere delicatamente il trapano sulla superficie del cranio senza esercitare pressione diretta verso il basso. Una volta che il cranio è completamente assottigliato, staccare il topo dal supporto e posizionarlo supino.

Fissare delicatamente entrambi gli arti inferiori con del nastro adesivo per esporre chiaramente le cosce mediali. Successivamente, rimuovere i peli presenti sulle cosce mediali e disinfettare la zona chirurgica applicando l'iodopovidone sulle cosce. Poi, rimuovere delicatamente la pelle dal lato mediale della coscia destra, sopra la vena e l'arteria femorale.

Applicare circa tre a cinque gocce di soluzione salina 0,9% sul sito chirurgico. Successivamente, separare la vena femorale dall'arteria, dissezionando in modo ottuso il fascio neurovascolare femorale. Ora, posizionare due pezzi di sutura chirurgica lunghi tre centimetri ciascuno al di sotto dell'arteria femorale, distanziati tra loro di circa un centimetro.

Ruotare la sutura superiore in senso orario per creare un laccio emostatico vascolare che aiuterà a prevenire una perdita eccessiva di sangue durante la cateterizzazione. Successivamente, praticare una piccola incisione nell'arteria femorale utilizzando forbici a molla, dove in seguito verrà inserito il catetere per monitorare i parametri fisiologici del topo. In questa procedura, rimuovere la pelle dalla coscia mediale sinistra del topo.

Successivamente, individuare la vena femorale. Utilizzando una siringa da un millilitro e un ago da 30 gauge, aspirare 130 microlitri della soluzione di colorante fluorescente. Iniettare lentamente 100 microlitri del colorante nella vena femorale.

Dopo aver rimosso l'ago, applicare una pressione costante e delicata sul sito di iniezione per arrestare qualsiasi sanguinamento e permettere al colorante di circolare per cinque minuti. Successivamente, chiudere il sito chirurgico con punti di sutura. Girare con attenzione il topo in posizione prona e posizionarlo nel supporto per la testa del mouse.

Per l'immagine a due fotoni in vivo, spostare l'apparato chirurgico sul microscopio a due fotoni e assicurarsi di mantenere il livello di anestesia dell'animale. Successivamente, inserire una piccola quantità di soluzione salina 0,9% nel serbatoio della piastra cranica e abbassare l'obiettivo del microscopio in modo che entri in contatto con la soluzione salina. Quindi, individuare l'area di interesse utilizzando l'obiettivo per la visione in campo chiaro.

In seguito, iniziare l'acquisizione con microscopia a due fotoni. Individuare un letto capillare sullo schermo di visualizzazione e ingrandire questa zona utilizzando anche lo zoom ottico. Acquisire immagini dei capillari mediante il software di microscopia a due fotoni.

Per l'immagine a due fotoni ex vivo, effettuare un'incisione nel cuoio capelluto dalle ossa interparietali alle ossa frontali del topo decapitato. Fissare la pelle ai lati del cranio con l'indice e il pollice, posizionare le forbici extra fini al di sotto dell'osso interparietale mediale e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale fino a circa tre millimetri oltre il punto bregmatico. Successivamente, separare il cranio dal cervello e rimuovere con cura eventuali meningi dalla superficie del cervello utilizzando la pinzetta.

Fare scivolare delicatamente la pinzetta sotto il cervello per staccarlo dal cranio. Successivamente, posizionare il cervello in una matrice cerebrale specifica per topi e lavarlo con gocce di ACSF. Poi, rimuovere una sezione cerebrale coronale spessa un millimetro.

Posizionare la sezione cerebrale su un vetrino concavo contenente ACSF, con la parte più anteriore della sezione rivolta verso l'alto. Quindi coprire delicatamente la fetta cerebrale con un coprioggetto di vetro. Trasferire il vetrino sul portacampioni del microscopio e applicare una piccola quantità di soluzione salina 0,9% sul coprioggetto.

Abbassi l'obiettivo del microscopio fino a quando entra in contatto con la soluzione salina. Successivamente, localizzi la linea mediana del cervello utilizzando l'obiettivo a campo chiaro. A questo punto, inizi l'acquisizione con microscopia a due fotoni e localizzi nuovamente la linea mediana utilizzando l'obiettivo 25x.

Per raggiungere questo obiettivo, cercare la scissura longitudinale sulla superficie corticale della sezione coronale. Quindi, posizionare il bordo destro dello schermo di imaging sulla linea mediana e spostare lateralmente lo schermo del visualizzatore di tre fotogrammi completi. Individuare la profondità alla quale i capillari sono appena visibili sullo schermo di visualizzazione.

Quindi, abbassare ulteriormente il piano di messa a fuoco di 20 micrometri per determinare l'estremità superiore dello stack in z. Impostare lo spessore dell'immagine a un micrometro. Abbassare lo schermo di visualizzazione di 100 micrometri e regolare la potenza del laser in modo continuo, in modo che meno dell'uno percento dei pixel risulti sovrasaturo.

Infine, acquisire lo z-stack. In questa figura, dopo che la sezione del cervello è stata preparata, viene individuata un'area di imaging a circa 1,5 millimetri dalla linea mediana. Uno z-stack di 100 micrometri produce un'immagine tridimensionale utilizzata per l'analisi nel software analitico Amira.

La rete capillare viene quindi tracciata manualmente posizionando dei nodi all'inizio e alla fine di un capillare o in qualsiasi punto in cui un capillare si dirama in un altro. Questo produce un'immagine completamente scheletrizzata dalla quale i parametri morfologici vengono estratti automaticamente. Il numero di nodi capillari, segmenti, lunghezza media dei segmenti e lunghezza totale dei segmenti può essere estratto mediante imaging ex vivo a due fotoni di sezioni cerebrali di topo.

Qui, un'immagine bidimensionale delle reti capillari viene prodotta mediante imaging in vivo, nel quale può essere estratto il diametro capillare e può essere calcolato il volume capillare totale utilizzando il diametro capillare e la lunghezza totale dei segmenti ottenuta dall'imaging ex vivo. Una volta acquisita padronanza, questa procedura può essere completata in tre ore e mezza se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione della procedura, è importante agire rapidamente mantenendo un livello costante di anestesia, poiché l'isoflurano può causare vasodilatazione dei capillari corticali, alterando così i dati.

Durante questa procedura possono essere ottenuti altri parametri capillari, come la velocità degli eritrociti o il flusso degli eritrociti, che possono fornire una comprensione più approfondita dei cambiamenti patogenetici osservati nei disturbi neurocognitivi associati all'HIV e in altre malattie neurodegenerative. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.