Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i cambiamenti nelle reti capillari corticali dopo un'esposizione prolungata alla virotossina dell'HIV, tat. Questo metodo può aiutare a esaminare i cambiamenti chiave nella morfologia dei capillari corticali che possono contribuire alla patogenesi dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una quantificazione fisiologicamente accurata di molteplici parametri morfologici capillari.

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla patogenesi dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV. Può anche essere applicato ad altre malattie in cui si verificano cambiamenti vascolari come il morbo di Alzheimer. Inizia questa procedura applicando un gel lacrimale artificiale sugli occhi di un topo anestetizzato.

Quindi, rasa la testa usando un rasoio elettrico. Quindi, applicare la soluzione di iodio povidone per sterilizzare il cuoio capelluto e lasciarlo asciugare. Al microscopio ottico, rimuovere il cuoio capelluto dell'animale, per esporre completamente le ossa parietali, le ossa frontali caudali e la punta di bregma.

Applicare una piccola quantità di una soluzione di cloruro ferrico al dieci percento sul cranio, al fine di asciugare la membrana per una facile rimozione. Successivamente, rimuovere la membrana secca, raschiando delicatamente il cranio con la pinza. Quindi, applicare un sottile strato di colla attorno alla finestra della piastra di testa.

Premere delicatamente la piastra della testa contro il cranio del mouse, per mantenere l'area di interesse al centro della finestra. Successivamente, applicare una goccia di cemento dentale sulla piastra di testa, per polimerizzare la colla. Quindi, applica un sottile strato di colla lungo il bordo della finestra della piastra di testa per creare un serbatoio per trattenere la soluzione salina.

Una volta che la colla si è asciugata, avvitare la piastra della testa nel cablaggio della piastra della testa del mouse. Rimuovere la colla dalla finestra della piastra di sterzo utilizzando una punta da trapano collegata a un trapano micro-torp, impostata a 6.000 giri/min. Fermarsi ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del cranio del topo.

Successivamente, utilizzando una nuova punta da trapano, inizia a assottigliare il cranio utilizzando un trapano micro-torp impostato a 4.000 giri / min. Muovi delicatamente il trapano sul cranio senza una pressione diretta verso il basso. Una volta che il cranio è completamente assottigliato, stacca il mouse dal supporto e posizionalo sulla schiena.

Fissare delicatamente entrambi gli arti posteriori per esporre chiaramente le cosce mediali. Quindi rimuovere i peli su entrambe le cosce mediali e disinfettare il sito chirurgico coprendo le cosce con iodio povidone. Quindi, rimuovere delicatamente la pelle sulla coscia destra mediale, sopra la vena femorale e l'arteria.

Applicare circa tre-cinque gocce di soluzione fisiologica allo 0,9% sul sito chirurgico. Quindi, separare la vena femorale dall'arteria, sezionando bruscamente il fascio neurovascolare femorale. Ora, posiziona due pezzi di sutura chirurgica di tre centimetri, sotto l'arteria femorale, a circa un centimetro di distanza.

Ruotare la sutura superiore in senso orario per creare un laccio emostatico vascolare che aiuterà a prevenire un'eccessiva perdita di sangue durante il cateterismo. Successivamente, praticare una piccola incisione nell'arteria femorale utilizzando delle forbici a molla, dove successivamente verrà inserito il catetere per monitorare i parametri fisiologici del topo. In questa procedura, rimuovere la pelle sulla coscia sinistra mediale del topo.

Quindi, individua la vena femorale. Utilizzando una siringa da un millilitro e un ago da 30 gauge, aspirare 130 microlitri di soluzione colorante fluorescente. Iniettare lentamente 100 microlitri di colorante nella vena femorale.

Dopo aver rimosso l'ago, applicare una leggera pressione costante sul sito di iniezione per fermare qualsiasi sanguinamento e lasciare che il colorante circoli per cinque minuti. Quindi, chiudere il sito chirurgico con punti di sutura. Capovolgere con cautela il mouse sullo stomaco e posizionarlo nell'imbracatura della piastra della testa del mouse.

Per l'imaging in vivo a due fotoni, spostare l'apparato chirurgico al microscopio a due fotoni e assicurarsi di mantenere il livello di anestesia dell'animale. Quindi, posizionare una piccola quantità di soluzione fisiologica allo 0,9% nel serbatoio della piastra di testa e nell'obiettivo inferiore del microscopio in modo che entri in contatto con la soluzione salina. Quindi, localizzare l'area di interesse utilizzando l'obiettivo di visualizzazione in campo chiaro.

Successivamente, inizia l'imaging di due fotoni. Individua un letto capillare sullo schermo di visualizzazione e ingrandisci quest'area utilizzando anche lo zoom ottico. Acquisizione di immagini dei capillari utilizzando il software di imaging a due fotoni.

Per l'imaging ex vivo a due fotoni, praticare un'incisione nel cuoio capelluto dalle ossa interparietali alle ossa frontali del topo decapitato. Fissare la pelle ai lati del cranio con l'indice e il pollice, posizionare le forbici extra sottili sotto l'osso interparietale mediale e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale fino a circa tre millimetri dopo il punto di bregma. Quindi, separare il cranio dal cervello e rimuovere con cura eventuali meningi dalla superficie del cervello con il forcipe.

Fai scorrere delicatamente la pinza sotto il cervello per liberarlo dal cranio. Successivamente, posizionare il cervello in una matrice cerebrale, specifica per i topi, e lavarla con gocce di ACSF. Quindi, rimuovere una sezione di cervello coronale spessa un millimetro.

Posizionare la sezione cerebrale su un vetrino concavo contenente ACSF, con la parte più anteriore della sezione rivolta verso l'alto. Quindi coprire delicatamente la fetta di cervello con un vetrino coprioggetti. Trasferire il vetrino sul tavolino del microscopio e posizionare una piccola quantità di soluzione fisiologica allo 0,9% sul vetrino coprioggetto.

Abbassare l'obiettivo del microscopio fino a quando non viene a contatto con la soluzione fisiologica. Successivamente, localizza la linea mediana del cervello utilizzando l'obiettivo a campo chiaro. Ora, inizia l'imaging di due fotoni e individua nuovamente la linea mediana utilizzando l'obiettivo 25x.

A tale scopo, cerca la fessura longitudinale sulla superficie corticale della sezione coronale. Quindi, posizionare il bordo destro dello schermo di imaging sulla linea mediana e spostare lateralmente lo schermo dello spettatore su tre fotogrammi completi. Individua la profondità alla quale i capillari sono appena visibili sullo schermo di visualizzazione.

Quindi, abbassare il piano di messa a fuoco per altri 20 micrometri per determinare la parte superiore dello z-stack. Impostare lo spessore dell'immagine su un micrometro. Abbassare lo schermo di visualizzazione di 100 micrometri e regolare la potenza del laser in modo che meno dell'uno percento dei pixel sia sovrasaturo.

Infine, acquisisci lo z-stack. In questa figura, dopo che la fetta di cervello è stata preparata, si trova un'area di imaging a circa 1,5 millimetri dalla linea mediana. Uno z-stack da 100 micrometri produce un'immagine tridimensionale utilizzata per l'analisi nel software analitico Amira.

La rete capillare viene quindi tracciata manualmente posizionando i nodi all'inizio e alla fine di un capillare o in qualsiasi posizione in cui un capillare si dirama in un altro. Questo produce un'immagine completamente scheletrata da cui vengono estratti automaticamente i parametri morfologici. Il numero di nodi capillari, i segmenti, la lunghezza media del segmento e la lunghezza totale del segmento possono essere estratti utilizzando l'imaging ex vivo di due fotoni di fette di cervello di topo.

Qui, un'immagine bidimensionale delle reti capillari viene prodotta mediante imaging in vivo, in cui il diametro del capillare può essere estratto e il volume totale del capillare può essere calcolato utilizzando il diametro del capillare e la lunghezza totale del segmento ottenuta dall'imaging ex vivo. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in tre ore e mezza se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante muoversi rapidamente mantenendo un livello costante di anestesia poiché l'isoflurano può causare vasodilatazione dei capillari corticali, distorcendo così i dati.

Durante questa procedura possono essere ottenuti altri parametri capillari, come la velocità dei globuli rossi o il flusso dei globuli rossi, che possono fornire una comprensione più profonda dei cambiamenti patogeni osservati nei disturbi neurocognitivi associati all'HIV e in altre malattie neurodegenerative. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.