Name: Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Scopri la quantificazione dell'architettura vascolare cerebrale con microscopia a due fotoni in vivo ed ex vivo in un modello murino di neuroinfiammazione indotta da HIV. Questo metodo permette di analizzare i cambiamenti morfologici dei capillari corticali.

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Ringraziamo Maria Jepson, la dottoressa Paivi Jordan e la dottoressa Linda Callahan dell'Università di Rochester Multiphoton Core per la consulenza tecnica durante il completamento di questo protocollo. Ringraziamo anche il Dr. Changyong Feng per la consulenza statistica esperta e il Dr. Maiken Nedergaard dell'University of Rochester Medical Center per il design della piastra utilizzata in questo articolo. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni T32GM007356 e R01DA026325 dal National Institutes of Health (NIH); e dal Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH) dell'Università di Rochester.

L&#39;Università del comitato dell&#39;Università di Rochester per le risorse animali ha approvato tutte le procedure eseguite in questo documento. Preparazione 1. Pre-chirurgico (e mouse) <ol><li> Preparare l&#39;area chirurgica con tutte le attrezzature necessarie. Sterilizzare tutti gli utensili impiegati durante la procedura di anticipo utilizzando 70% di etanolo. Facoltativamente, utilizzare uno sterilizzatore vetro tallone o in autoclave per sterilizzare gli strumenti. </li><li> Posizionare il mouse in una camera di induzione isoflurano collegato ad un vaporizzatore isoflurano. Impostare i livelli isoflurano al 4% ad una velocità di 1 L / min. Nota: per gli esperimenti qui riportati, i topi con doxiciclina (DOX) inducibile di HIV-1 Tat transgene guidato dalla proteina gliale fibrillare specifici astrociti (GFAP) promotore (HIV Tat-Tg topi) 10 sono stati utilizzati per esaminare l&#39;effetto del virus HIV -1 neuroinfiammazione sulla struttura vascolare cerebrale indotta, come precedentemente descritto 7,10. </li><li> Punta delicatamente la camera di induzione di osservare il mouse &amp;# 39; s riflesso di raddrizzamento. Una volta che il riflesso di raddrizzamento è stata soppressa, impostare il livello di isoflurano al 2% e reindirizzare il flusso d&#39;aria dalla camera di induzione al cono al banco chirurgica. </li><li> Spostare rapidamente il mouse dalla camera di induzione al pad riscaldamento dell&#39;acqua infuso. Continuare ad applicare isoflurano (1,5-2%) attraverso il cono. Regolare l&#39;anestesia secondo tolleranza individuale del mouse valutata attraverso la frequenza respiratoria (RR) di monitoraggio. Nota: La depressione di RR può perturbare parametri fisiologici gas che alterano il flusso sanguigno cerebrale e valutazione diametro del vaso. Tentativo di mantenere RR tra 55-65 respiri al minuto. Frequenza cardiaca (HR) può anche essere usato valutare la profondità dell&#39;anestesia; mantenere HR tra 300-450 battiti al minuto per evitare cambiamenti fisiologici al diametro del vaso. Tipicamente, anestesia sarà adeguato tra 1,5-2,0% isoflurano a 1 L / min per un dato mouse. </li><li> Eseguire un pizzico piedi per verificare ulteriormente la profondità dell&#39;anestesia. Se il mouse non risponde, commENCE le procedure chirurgiche. </li></ol> 2. Preparazione del sottile cranio cranici Finestra <ol><li> Applicare gel lacrima artificiale agli occhi del mouse. Rimuovere completamente i capelli dal cuoio capelluto del mouse con le forbici o un rasoio elettrico. </li><li> Sterilizzare il cuoio capelluto mediante l&#39;applicazione di una soluzione di iodio-povidone; lasciare asciugare. Poi, sotto un microscopio ottico, togliere la pelle dal cuoio capelluto del mouse, esponendo completamente le ossa parietali, ossa frontali caudale, e marcatura Bregma. </li><li> Applicare una piccola quantità di una soluzione di cloruro ferrico 10% al cranio per asciugare le membrane per una facile rimozione. Rimuovere le membrane secche con la # 5/45 forcipe raschiando delicatamente il cranio. </li><li> Applicare un sottile strato di colla intorno alla finestra piastra di testa. Premere delicatamente la piastra di testa contro il cranio del mouse, mantenendo la zona di interesse del centro della finestra. Applicare una goccia di cemento dentale per la piastra di testa di polimerizzare la colla. </li><li> Applicare uno strato sottiledi colla lungo il bordo della finestra piastra di testa per creare un serbatoio in cui tenere salina. Una volta che la colla si è asciugata, avvitare il piastra di testa nel cablaggio del mouse piastra di testa. Nota: il cablaggio del mouse piastra di testa utilizzato in questa procedura è una struttura con una base di metallo e due colonne di metallo. Su ogni colonna c&#39;è una molla e un galletto. La piastra di testa è posto sulla sommità della molla, e il dado ad alette viene stretto finché la testa sia in piano e non si muove. </li><li> Rimuovere la colla dalla finestra piastra di testa con una punta attaccato ad un trapano MicroTorque impostato a 6.000 giri. Fermare ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del mouse del cranio che può provocare danni strutturali alle navi. <ol><li> Utilizzando una nuova punta, posizionare il MicroTorque fresa 1.5 mm lateralmente da linea mediana (un terzo del diametro della finestra piastra di testa). Inizia a sottile cranio nei dintorni a 4,000 rpm. Spostare il trapano delicatamente attraverso il cranio senza pressione diretta verso il basso. </li><li> Cease drilling ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del cranio del mouse. Durante questo tempo, rimuovere la polvere accumulata cranio utilizzando una bomboletta di aria compressa. </li><li> Utilizzare gocce di soluzione salina RT raffreddare cranio per 5-10 secondi. Rimuovere delicatamente tutto il liquido con un panno morbido per continuare cranio diradamento. </li></ol></li><li> Per l&#39;assottigliamento finale del cranio, posizionare un piccolo volume di soluzione salina nel serbatoio piastra di testa e leggermente spazzare un microlama dentale sull&#39;area di interesse finché piccoli vasi sono chiaramente visibili. </li></ol> 3. Il monitoraggio dei parametri fisiologici <ol><li> Una volta che il cranio è completamente diluito, scollegare il mouse dal supporto e posizionarlo sul dorso. Nastro delicatamente verso il basso entrambe le zampe posteriori per esporre chiaramente le cosce mediale. </li><li> Rimuovere i capelli su entrambe le cosce mediale con le forbici o un rasoio elettrico. Disinfettare il sito chirurgico coprendo le cosce con iodopovidone. </li><li> Pizzicare la pelle sulla coscia mediale proprio sopra la vena femoralee l&#39;arteria con la # 5 pinze. Tirare delicatamente la pelle verso l&#39;alto e usare le forbici per tagliare e rimuovere la pelle. Nota: la coscia sinistra è riservata nel caso di complicanze chirurgiche (anomalie vascolari, vasi rotti). </li><li> Applicare circa 3-5 gocce di soluzione fisiologica 0,9% al sito chirurgico. Questo consente una maggiore ingrandimento di navi, oltre a mantenere il sito idratata e prevenire l&#39;essiccazione dei vasi. Separare la vena femorale da arteria da dissezione senza mezzi termini nel fascio neurovascolare femorale utilizzando due # 5/45 pinze. </li><li> Inserire due, 3 pezzi cm di sutura chirurgica sotto l&#39;arteria femorale circa 1 cm di distanza. Ruotare la parte superiore in senso orario di sutura per creare un laccio vascolare che contribuirà a prevenire un&#39;eccessiva perdita di sangue durante il cateterismo. </li><li> Fai una piccola incisione nell&#39;arteria femorale utilizzando le forbici primavera. Posizionare il catetere nell&#39;arteria attraverso l&#39;incisione e avanzare fino a quando il catetere è saldamente all&#39;interno dell&#39;arteria. </li><li&gt; districare la sutura superiore (laccio emostatico) per valutare la tenuta e il corretto posizionamento del catetere. Fissare il catetere nell&#39;arteria femorale legando due nodi intorno al catetere all&#39;interno del vaso utilizzando le suture. </li><li> Iniettare 10 ml di eparina (100 UI / ml) attraverso il catetere per prevenire la coagulazione del sangue. Poi, chirurgicamente chiudere la coscia destra cucendo insieme la pelle con un 4-0 di sutura in un semplice schema interrotto. </li><li> Iniettare 50 ml di uretano (1,2 mg / g) per via intraperitoneale nel quadrante in basso a destra. Cinque minuti dopo ripetere con un&#39;altra iniezione 50 microlitri al quadrante inferiore sinistro per un totale di 100 ml di uretano intraperitoneale. Ridurre lentamente i livelli isoflurano a circa il 0,25%, mentre in concomitanza ricontrollare il mouse per la profondità dell&#39;anestesia. Nota: Mantenere l&#39;ago superficiali all&#39;interno della cavità peritoneale lungo la parete addominale posteriore in modo da non perforare l&#39;intestino. Questo può essere ottenuto pizzicando rectus mu addominalescles lontano dai visceri e poi iniettare. </li><li> Utilizzando un tubo capillare, raccogliere un campione di 40 ml di sangue arterioso dal catetere. Fissare il catetere al trasduttore di pressione sanguigna, dotata di rubinetto a quattro vie soluzione salina e la siringa eparina-riempita. </li><li> Nastro il trasduttore di pressione sanguigna con gli apparecchi chirurgici per impedire la rimozione involontaria del catetere. Avviare il monitoraggio della pressione arteriosa media. </li><li> Inserire il tubo capillare riempito di sangue in una porta di entrata analizzatore di gas di sangue. Una volta che tutto il sangue è stato estratto, rimuovere il tubo capillare dalla porta di entrata. I livelli di gas nel sangue 2 O 2 e CO apparirà su una carta stampata dal analizzatore di gas di sangue. </li></ol> 4. L&#39;iniezione del colorante fluorescente <ol><li> Pizzicare la pelle sulla coscia sinistra mediale utilizzando la # 5 pinze. Tirare delicatamente la pelle verso l&#39;alto e usare le forbici per tagliare e rimuovere la pelle. Preparare destrano coniugato rosso che emette rhodamine tintura(70 kDa) (10 mg / kg disciolto in soluzione fisiologica). </li><li> Individuare femorale vein.Using una siringa da 1 ml con un ago da 30 G allegata, disegnare una soluzione precedentemente preparata di un colorante fluorescente appropriata per l&#39;imaging alla linea 130 microlitri della siringa. Rimuovere tutte le bolle d&#39;aria disegnando il colorante completamente nella siringa e fermamente muovendo il muro siringa. <ol><li> Piegare il 30 ago G con un angolo di circa 30 gradi, premendo contro una superficie dura lato smusso up. Riempire l&#39;ago con il colorante ed eliminare il liquido in eccesso, lasciando un campione di 100 microlitri. </li></ol></li><li> Iniettare il campione di 100 ml di colorante lentamente nella vena femorale. Dopo aver rimosso l&#39;ago, applicare costante, delicatamente pressione sul sito di iniezione per fermare le emorragie. Lasciare il colorante circolare per 5 min. Nota: in alternativa, la vena femorale destra può essere utilizzato invece per l&#39;iniezione colorante fluorescente per impedire ulteriore perdita di sangue attraverso la creazione di un altro sito chirurgico. Inoltre, se laanimale sta sanguinando incontrollabile dal sito chirurgico, potrebbe essere un&#39;indicazione che troppo eparina è stato dato per irrigare il catetere. Se non c&#39;è coagulazione entro 10-15 minuti e il mouse è ancora sanguinando, considerare riavviare l&#39;esperimento con un nuovo mouse. </li><li> Chiudere la coscia sinistra cucendo insieme la pelle con un 4-0 di sutura, poi capovolgere con attenzione il mouse sul suo stomaco, e inserirla nel cablaggio del mouse piastra di testa. </li></ol> 5. In Vivo a due Photon Imaging <ol><li> Spostare l&#39;apparato chirurgico al microscopio a due fotoni, avendo cura di mantenere i livelli di anestesia continui. Mettere una piccola quantità di soluzione salina allo 0,9% nel serbatoio piastra di testa e abbassare l&#39;obiettivo microscopio in modo che viene a contatto con la soluzione salina. Individuare l&#39;area di interesse con l&#39;obiettivo a campo chiaro visualizzazione </li><li> Posizionare il laser di eccitazione a due fotoni ad una lunghezza d&#39;onda appropriata per il colorante fluorescente. Iniziare due fotoni di imaging utilizzando il 25x oOBIETTIVO. Si noti che in questi esperimenti abbiamo usato un destrano coniugato al rosso emettono rodamina colorante che è stato eccitato alla lunghezza d&#39;onda di 780 nm. Una 607/36 banda passante del filtro di emissione per rilevare la fluorescenza della tintura, e una banda passante del filtro di emissione 480/20 è stato utilizzato per rilevare autofluorescenza arteriosa </li><li> Individuare una capillare letto sulla schermata di visualizzazione, e ingrandire l&#39;area utilizzando ottiche zoom 2. Immagini Acquisire dei capillari con il software di imaging a due fotoni. </li><li> Dopo l&#39;imaging è completo, sacrifica il mouse per dislocazione cervicale seguita da decapitazione. </li></ol> 6. Ex Vivo a due Photon Imaging <ol><li> Utilizzando le forbici finissimi, fare un&#39;incisione nel cuoio capelluto dalle ossa interparietale alle ossa frontali del mouse. Fissare la pelle ai lati del cranio con il dito indice e il pollice. </li><li> Posizionare le forbici in più sottili sotto l&#39;osso interparietale mediale e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale. Fermare il taglio del cranio circa 3 mm dopo aver segnato il bregma. Nota: Applicare una pressione verso l&#39;alto quando il taglio del cranio, per evitare che il taglio del cervello. </li><li> Usando i # 5 pinze, separare il cranio dal cervello e rimuovere accuratamente eventuali meningi dalla superficie del cervello. Meningi rimanenti possono accidentalmente lacerare il cervello; estrema cura dovrebbe essere presa per evitare questo. Far scorrere delicatamente la # 5 pinze sotto il cervello avanza lentamente in avanti fino a quando il cervello è privo di cranio. Nota: che la pressione verso il basso deve essere usato per evitare la puntura del cervello. </li><li> Posizionare il cervello in uno strumento cerebrale sezionamento specifico per i topi. Lavare il cervello mediante l&#39;applicazione di gocce di liquido cerebrospinale artificiale nel cervello. </li><li> Rimuovere una sezione coronale 2 millimetri di cervello da bregma 0 a bregma -2. Posizionare la sezione coronale su un vetrino concava contenente liquido cerebrospinale artificiale con il bregma 0 (la maggior parte craniale della sezione) rivolto verso l&#39;alto. Coprire delicatamente il cervello slghiaccio con una scivolata copertura in vetro. Nota: Evitare di premere il vetro una volta posizionati sulla parte del cervello in quanto ciò potrebbe deformare l&#39;architettura vascolare. </li><li> Trasferire il vetrino al palco microscopio e mettere una piccola quantità di soluzione fisiologica 0,9% sul vetrino. Abbassare l&#39;obiettivo microscopio fino al perfetto contatto con la soluzione salina. Individuare la linea mediana del cervello con l&#39;obiettivo campo chiaro. </li><li> Iniziare l&#39;imaging a due fotoni e individuare la linea mediana di nuovo con l&#39;obiettivo 25x. Ottenere questo cercando la fessura longitudinale sulla superficie corticale della sezione coronale. Posizionare il bordo destro dello schermo per immagini sulla linea mediana e spostare lo schermo visualizzatore sopra lateralmente tre fotogrammi completi (circa 1,5 mm dalla linea mediana). Si noti che in questi esperimenti, i parametri di imaging erano identici a quelli indicati nella nota al punto 5.2. </li><li> Individuare la profondità alla quale i capillari sono appena visibili sullo schermo vista. Abbassare il piano di messa a fuoco un ulteriore 20micron per determinare all&#39;inizio della z-stack. </li><li> Impostare lo spessore di 1 micron immagine. Abbassare la schermata di visualizzazione per 100 micron e regolare la potenza del laser durante tale che meno dell&#39;1% dei pixel sono troppo saturi. Nota: le immagini z-stack sono compilati da una serie di 100 immagini consecutive 500x500x1 micron. Maggiore è lo z-stack più accurati calcoli di post processing sarà. Generalmente, tentare di raccogliere un z-stack di 100 micron o maggiore. </li><li> Premere l&#39;icona XY Ripeti seguita dall&#39;icona XY adiacente. Una volta che lo z-stack è completo, premere l&#39;icona della serie Fine e salvare il file. </li></ol> 7. Elaborazione Dati <ol><li> Aprire un vivo un&#39;immagine capillare nel software ImageJ. Impostare manualmente il pixel rapporto distanza in base ai valori ottenuti dal software due fotoni. <ol><li> Selezionare l&#39;icona del * * direttamente dal menu Strumenti. Tracciare una linea che si estende da una parete capillare al oppoparete capillare del sito, e registrare la lunghezza fornita da ImageJ. Si noti che può essere necessario per ingrandire l&#39;immagine in modo da visualizzare chiaramente i bordi delle pareti dei capillari. </li><li> Ripetere passaggio 7.1.1 in diverse posizioni lungo il capillare, così come per più capillari nell&#39;immagine. </li></ol></li><li> Aprire il file z-stack nel software analitico come Amira. Selezionare l&#39;icona filamento Editor dalla barra degli strumenti sotto-applicazione <ol><li> Impostare lo spessore spettatore a circa 20. Spostare lo spettatore a parte superiore o inferiore della z-stack. </li><li> Selezionare l&#39;icona Traccia e spostare il cursore sopra l&#39;immagine caricata. Nodi immettere sul capillari nelle posizioni descritte nella figura 2C; segmenti appariranno automaticamente tra i nodi adiacenti. Tracciare capillari durante l&#39;intero z-stack. Nota: sarà necessario inserire nodi tra i punti finali e punti di ramificazione per rintracciare i capillari thrOughout lo z-stack. </li><li> Per rimuovere questi nodi, fare clic sull&#39;icona Intermedio Rimuovi. Nota: Questo può creare segmenti erronee in loop che devono essere rimossi manualmente selezionando il ciclo utilizzando l&#39;icona Seleziona unico, e quindi selezionando l&#39;icona Elimina selezionati. Se loop continuano ad apparire nella stessa zona durante il tracciamento, è probabile che i nodi sono stati posti su diversi capillari. </li><li> Una volta che il tracciato è completo, selezionare l&#39;icona del grafico Info per aprire un foglio elettronico contenente i parametri vascolari estratti automaticamente. Il numero di nodi e segmenti sono disponibili nella schermata vista principale. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo qui descritto può essere applicato per analizzare strutture microvascolari cerebrali in un&#39;ampia gamma di modelli sperimentali / impostazioni. Per il successo di questo metodo, tre passaggi critici devono essere padroneggiato. In primo luogo, la finestra sottile cranio non deve danneggiare il cranio o cerebrale sottostante. E &#39;facile forare il cranio durante diradamento, o causare perdite di calore indotta vascolare. Questo può interferire con le immagini come il colorante fluorescente colerà nel piano...

Virus dell&#39;immunodeficienza umana 1 (HIV-1) invade il cervello durante la fase acuta di infezione da virus, e infetta produttivo sia microglia e macrofagi residenti del cervello, portando a loro attivazione - e il rilascio di entrambi mediatori dell&#39;infiammazione ospitanti di derivazione e l&#39;HIV-1 solubile virotoxins come la Tat e gp120 (rivisto in 1,2). Di conseguenza, uno stato cronico neuroinflammatory si stabilisce nel SNC, che è pensato per contribuire alla patogenesi di HIV-1 disturbi associati neurocognitivi (mano) 3-5. Sovraespressione cronica di HIV-1 Tat o interleuchina (IL) -17A nel SNC di topi ha mostrato di provocare microvascolare rarefazione 6,7. Ciò solleva la possibilità che neuroinfiammazione cronica può contribuire alla patogenesi di mano attraverso effetti sul sistema vascolare cerebrale. Al fine di esaminare ulteriormente la questione, abbiamo sviluppato metodi per quantificare strut vascolari cerebraliture. Questo documento descrive un metodo per quantificare il numero di nodi capillari, segmenti capillari, significa la lunghezza del segmento, la lunghezza totale del segmento, diametro medio capillare, e il volume totale capillare usando immagini in vivo di reti capillari attraverso una finestra corticale sottile cranio (modificato da precedentemente descritta protocolli) 8,9, nonché ex vivo imaging sezioni cerebrali, utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo approccio combinato prevede una quantificazione olistica parametri vascolari cerebrali, poiché il sottile cranio finestra corticale in vivo permette la preservazione dell&#39;ambiente cerebrale, mentre ex vivo imaging reti capillari in fettine di cervello permette la ricostruzione di completo, tridimensionale reti capillari - che possono poi essere quantificati utilizzando il software disponibile in commercio.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Leica</td><td>Leica Inc.</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore ad Alta Intensità</td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Stryker&nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T/POMPA</td><td>Gaymar Industries, Inc.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 Vaporizzatore di isoflurano</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>Gel lacrimale artificiale</td><td>Butler AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di iodio povidone&nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Bonn extra fini</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 Pinze</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5/45 Pinze</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro ferrico</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Gel adesivo istantaneo per prismi</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Kit manipolo Microtoruqe II</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Fresa per Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Norland Blade (Microblade dentale)</td> <td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Uretano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>Gruppo 2B cancerogeno</td></tr><tr><td>Sutura intrecciata</td><td>Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici a molla</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Catetere arterioso</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>MAC-01</td><td>L'estremità del catetere è stata allungata manualmente per diminuirne il diametro.</td></tr><tr><td>Pressione sanguigna Moniter</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore di pressione sanguigna e cavo</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab Analizzatore di gas ematici&nbsp;</td><td>Siemens&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; l Tubo capillare</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-destrano (70.000 MW, 10 mg/kg disciolto in soluzione salina)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Microscopio multifotone</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>Disponibile all'indirizzo</td></tr><tr><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html Amira Software</td><td>Visage Imaging&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione dei cerebrale vascolare architettura con due fotoni microscopia in un modello murino di neuroinflammation hiv-indotta

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

'L'infezione da virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) provoca frequentemente disturbi neurocognitivi associati all'HIV-1 (HAND) ed è caratterizzata da uno stato neuroinfiammatorio cronico all'interno del sistema nervoso centrale (SNC), che si ritiene sia guidato principalmente dall'attivazione viralmente mediata della microglia e dei macrofagi residenti nel cervello. L'infezione da HIV-1 è anche accompagnata da cambiamenti nel flusso sanguigno cerebrovascolare (CBF), aumentando la possibilità che la neuroinfiammazione cronica associata all'HIV possa portare a cambiamenti nel CBF e/o nell'architettura vascolare cerebrale. Per rispondere a questa domanda, abbiamo utilizzato un modello murino per la neuroinfiammazione indotta dall'HIV e abbiamo testato se l'esposizione a lungo termine a questo ambiente infiammatorio può danneggiare la vascolarizzazione cerebrale e provocare la rarefazione delle reti capillari. In questo articolo descriviamo un metodo per quantificare i cambiamenti nella densità capillare corticale in un modello murino di malattia neuroinfiammatoria (topi transgenici HIV-1 Tat). Questo approccio generalizzabile impiega l'imaging in vivo a due fotoni dei capillari corticali attraverso una finestra corticale a cranio sottile, nonché l'imaging ex vivo a due fotoni dei capillari corticali nelle sezioni cerebrali del topo. Queste procedure producono immagini e file z-stack di reti capillari, rispettivamente, che possono essere sottoposti ad analisi quantitativa al fine di valutare i cambiamenti nell'architettura vascolare cerebrale.

La finestra corticale sottile cranio permette in vivo due fotoni imaging capillari corticali (Figura 1). Una zona adatta per l&#39;immagine mostra numerosi, capillari distinti (Figura 1A). Nello stesso campo di vista, non c&#39;è arteriosa autofluorescenza parete cellulare, e ci possono essere altri segnali fluorescenti, quali il collagene, la fluorescenza indotte da generazione di seconda armonica 11 (Figura 1B). </p...

Questo articolo descrive un metodo con cui l'architettura vascolare nel cervello può essere quantificata utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo ed ex vivo.

Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i cambiamenti nei network capillari corticali dopo un'esposizione prolungata alla virotossina del virus dell'HIV, tat. Questo metodo può aiutare a esaminare modifiche chiave nella morfologia dei capillari corticali che potrebbero contribuire alla patogenesi dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una quantificazione fisiologicamente accurata di diversi parametri morfologici capillari.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patogenesi dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV, può essere applicato anche ad altre malattie in cui si verificano alterazioni vascolari, come la malattia di Alzheimer. Iniziare questa procedura applicando un gel lacrimale artificiale sugli occhi di un topo anestetizzato.Successivamente, rasare la testa utilizzando un rasoio elettrico. Poi, applicare una soluzione di iodopovidone per sterilizzare il cuoio capelluto e lasciarla asciugare. Sotto un microscopio ottico, rimuovere il cuoio capelluto dell'animale per esporre completamente le ossa parietali, le ossa frontali caudali e il punto bregmatico.Applicare una piccola quantità di una soluzione al dieci percento di cloruro ferrico sul cranio, al fine di asciugare la membrana per una facile rimozione. Successivamente, rimuovere la membrana secca, raschiando delicatamente il cranio con la pinzetta. Poi, applicare uno strato sottile di colla attorno alla finestra della piastra cranica.Premere delicatamente la piastra cranica contro il cranio del mouse, in modo da mantenere l'area di interesse al centro della finestra. Successivamente, applicare una goccia di cemento dentale sulla piastra cranica per polimerizzare la colla. Poi, applicare uno strato sottile di colla lungo il bordo della finestra della piastra cranica per creare una riserva in cui contenere la soluzione salina.Dopo che la colla si &egrave; asciugata, avvitare la piastra cranica nel supporto per la piastra cranica del mouse. Rimuovere qualsiasi residuo di colla dalla finestra della piastra cranica utilizzando una punta da trapano collegata a un microtrapano, impostato a 6.000 giri al minuto. Fermarsi ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del cranio del mouse.Successivamente, utilizzando una nuova punta, iniziare ad assottigliare il cranio con un trapano microtorp impostato a 4.000 giri al minuto. Muovere delicatamente il trapano sulla superficie del cranio senza esercitare pressione diretta verso il basso. Una volta che il cranio è completamente assottigliato, staccare il topo dal supporto e posizionarlo supino.Fissare delicatamente entrambi gli arti inferiori con del nastro adesivo per esporre chiaramente le cosce mediali. Successivamente, rimuovere i peli presenti sulle cosce mediali e disinfettare la zona chirurgica applicando l'iodopovidone sulle cosce. Poi, rimuovere delicatamente la pelle dal lato mediale della coscia destra, sopra la vena e l'arteria femorale.Applicare circa tre a cinque gocce di soluzione salina 0,9% sul sito chirurgico. Successivamente, separare la vena femorale dall'arteria, dissezionando in modo ottuso il fascio neurovascolare femorale. Ora, posizionare due pezzi di sutura chirurgica lunghi tre centimetri ciascuno al di sotto dell'arteria femorale, distanziati tra loro di circa un centimetro.Ruotare la sutura superiore in senso orario per creare un laccio emostatico vascolare che aiuterà a prevenire una perdita eccessiva di sangue durante la cateterizzazione. Successivamente, praticare una piccola incisione nell'arteria femorale utilizzando forbici a molla, dove in seguito verrà inserito il catetere per monitorare i parametri fisiologici del topo. In questa procedura, rimuovere la pelle dalla coscia mediale sinistra del topo.Successivamente, individuare la vena femorale. Utilizzando una siringa da un millilitro e un ago da 30 gauge, aspirare 130 microlitri della soluzione di colorante fluorescente. Iniettare lentamente 100 microlitri del colorante nella vena femorale.Dopo aver rimosso l'ago, applicare una pressione costante e delicata sul sito di iniezione per arrestare qualsiasi sanguinamento e permettere al colorante di circolare per cinque minuti. Successivamente, chiudere il sito chirurgico con punti di sutura. Girare con attenzione il topo in posizione prona e posizionarlo nel supporto per la testa del mouse.Per l'immagine a due fotoni in vivo, spostare l'apparato chirurgico sul microscopio a due fotoni e assicurarsi di mantenere il livello di anestesia dell'animale. Successivamente, inserire una piccola quantità di soluzione salina 0,9% nel serbatoio della piastra cranica e abbassare l'obiettivo del microscopio in modo che entri in contatto con la soluzione salina. Quindi, individuare l'area di interesse utilizzando l'obiettivo per la visione in campo chiaro.In seguito, iniziare l'acquisizione con microscopia a due fotoni. Individuare un letto capillare sullo schermo di visualizzazione e ingrandire questa zona utilizzando anche lo zoom ottico. Acquisire immagini dei capillari mediante il software di microscopia a due fotoni.Per l'immagine a due fotoni ex vivo, effettuare un'incisione nel cuoio capelluto dalle ossa interparietali alle ossa frontali del topo decapitato. Fissare la pelle ai lati del cranio con l'indice e il pollice, posizionare le forbici extra fini al di sotto dell'osso interparietale mediale e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale fino a circa tre millimetri oltre il punto bregmatico. Successivamente, separare il cranio dal cervello e rimuovere con cura eventuali meningi dalla superficie del cervello utilizzando la pinzetta.Fare scivolare delicatamente la pinzetta sotto il cervello per staccarlo dal cranio. Successivamente, posizionare il cervello in una matrice cerebrale specifica per topi e lavarlo con gocce di ACSF. Poi, rimuovere una sezione cerebrale coronale spessa un millimetro.Posizionare la sezione cerebrale su un vetrino concavo contenente ACSF, con la parte più anteriore della sezione rivolta verso l'alto. Quindi coprire delicatamente la fetta cerebrale con un coprioggetto di vetro. Trasferire il vetrino sul portacampioni del microscopio e applicare una piccola quantità di soluzione salina 0,9% sul coprioggetto.Abbassi l'obiettivo del microscopio fino a quando entra in contatto con la soluzione salina. Successivamente, localizzi la linea mediana del cervello utilizzando l'obiettivo a campo chiaro. A questo punto, inizi l'acquisizione con microscopia a due fotoni e localizzi nuovamente la linea mediana utilizzando l'obiettivo 25x.Per raggiungere questo obiettivo, cercare la scissura longitudinale sulla superficie corticale della sezione coronale. Quindi, posizionare il bordo destro dello schermo di imaging sulla linea mediana e spostare lateralmente lo schermo del visualizzatore di tre fotogrammi completi. Individuare la profondità alla quale i capillari sono appena visibili sullo schermo di visualizzazione.Quindi, abbassare ulteriormente il piano di messa a fuoco di 20 micrometri per determinare l'estremit&agrave; superiore dello stack in z. Impostare lo spessore dell'immagine a un micrometro. Abbassare lo schermo di visualizzazione di 100 micrometri e regolare la potenza del laser in modo continuo, in modo che meno dell'uno percento dei pixel risulti sovrasaturo.Infine, acquisire lo z-stack. In questa figura, dopo che la sezione del cervello è stata preparata, viene individuata un'area di imaging a circa 1,5 millimetri dalla linea mediana. Uno z-stack di 100 micrometri produce un'immagine tridimensionale utilizzata per l'analisi nel software analitico Amira.La rete capillare viene quindi tracciata manualmente posizionando dei nodi all'inizio e alla fine di un capillare o in qualsiasi punto in cui un capillare si dirama in un altro. Questo produce un'immagine completamente scheletrizzata dalla quale i parametri morfologici vengono estratti automaticamente. Il numero di nodi capillari, segmenti, lunghezza media dei segmenti e lunghezza totale dei segmenti può essere estratto mediante imaging ex vivo a due fotoni di sezioni cerebrali di topo.Qui, un'immagine bidimensionale delle reti capillari viene prodotta mediante imaging in vivo, nel quale può essere estratto il diametro capillare e può essere calcolato il volume capillare totale utilizzando il diametro capillare e la lunghezza totale dei segmenti ottenuta dall'imaging ex vivo. Una volta acquisita padronanza, questa procedura può essere completata in tre ore e mezza se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione della procedura, è importante agire rapidamente mantenendo un livello costante di anestesia, poiché l'isoflurano può causare vasodilatazione dei capillari corticali, alterando così i dati.Durante questa procedura possono essere ottenuti altri parametri capillari, come la velocità degli eritrociti o il flusso degli eritrociti, che possono fornire una comprensione più approfondita dei cambiamenti patogenetici osservati nei disturbi neurocognitivi associati all'HIV e in altre malattie neurodegenerative. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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