Microscopia a due fotoni per l'imaging in vivo della microvascolarizzazione cerebrale di topo

Inizia con un topo anestetizzato con una piastra per la testa fissata su una finestra corticale a cranio sottile preparata chirurgicamente.

Posiziona il mouse supino. Rimuovere la pelle mediale della coscia per esporre la vena femorale.

Iniettare un colorante fluorescente coniugato nella vena per marcare il plasma sanguigno, consentendo la visualizzazione dei vasi sanguigni.

Sutura l'incisione.

Capovolgere il mouse e fissare la piastra in un'imbracatura per stabilizzare il mouse.

Trasferire la configurazione su un tavolino per microscopio a due fotoni.

Aggiungere soluzione fisiologica sulla finestra corticale. Abbassare la lente dell'obiettivo finché non tocca la soluzione fisiologica.

Utilizzando l'illuminazione a campo chiaro, individuare la regione di imaging.

Passa all'imaging a due fotoni.

Il laser del microscopio focalizza la luce a bassa energia nel vicino infrarosso nel cervello.

Nel punto focale del laser, due fotoni combinano la loro energia per eccitare il colorante, rendendo i vasi sanguigni fluorescenti.

Identifica un letto capillare, una rete di piccoli vasi sanguigni che collegano le arterie alle vene, e ingrandiscilo.

Acquisisci immagini per analizzare la microvascolarizzazione del cervello.

In questa procedura, rimuovere la pelle sulla coscia sinistra mediale del topo. Quindi, individua la vena femorale. Utilizzando una siringa da 1 millilitro e un ago calibro 30, aspirare 130 microlitri della soluzione colorante fluorescente. Iniettare lentamente 100 microlitri di colorante nella vena femorale.

Dopo aver rimosso l'ago, applicare una pressione costante e delicata sul sito di iniezione per fermare l'emorragia e lasciare che il colorante circoli per cinque minuti. Quindi, chiudere il sito chirurgico con punti di sutura. Capovolgere con cautela il mouse sullo stomaco e posizionarlo nell'imbracatura della piastra della testa del mouse. Per l'imaging in vivo a due fotoni, spostare l'apparato chirurgico al microscopio a due fotoni e assicurarsi di mantenere il livello di anestesia dell'animale.

Quindi, posizionare una piccola quantità di soluzione fisiologica allo 0,9% nel serbatoio della piastra di testa e abbassare l'obiettivo del microscopio in modo che entri in contatto con la soluzione salina. Quindi, individuare l'area di interesse, utilizzando l'obiettivo di visualizzazione in campo chiaro. Successivamente, inizia l'imaging a due fotoni. Individuare un letto capillare sullo schermo di visualizzazione e ingrandire quest'area utilizzando lo zoom ottico 2. Acquisisci immagini dei capillari utilizzando il software di imaging a due fotoni.