Name: Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri la microscopia intravitale per studiare la microcircolazione cerebrale nel topo usando finestre craniche croniche. Questa tecnica consente di tracciare cambiamenti emodinamici e risposte infiammatorie in vivo nel tempo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni R01-HL87290, R01-HL87290-S1 e R01-AI082610 dal National Institutes of Health di LJMC.

1. Craniotomia Un craniotomia a 8-a-10-settimana topi vecchi deve essere eseguita in anticipo come descritto in precedenza 1, tranne che una barra di titanio non si trova nella testa dell'animale. La finestra cronica cranica è un esame che consente la preparazione stabile della microcircolazione piale anche mesi dopo essere stato impiantato. Di solito, noi dobbiamo fare i nostri studi 2-3 settimane dopo l'impianto finestra cranica. 2. Microscopia intravitale <ol><li> Due-tre settimane dopo la craniotomia, la temperatura corporea è controllata e poi il mouse è leggermente anestetizzati con isoflurano (4% per l'induzione, 1-2% per la manutenzione). Anestesia luce è utilizzato per prevenire lo stress degli animali e il disagio durante la procedura sperimentale. </li><li> Gli animali vengono poi poste in posizione prona su un telaio stereotassico e la testa accuratamente protetti utilizzando le barre orecchio. Il livello è regolato con le leve destra e sinistra. Temperatura corporea viene mantenuta con una piastra elettrica. Poiché i topi con malaria cerebrale sviluppano ipotermia, le impostazioni di temperatura devono essere adeguate per ogni animale. </li><li> Lo slittamento di copertura sulla finestra cranica è delicatamente pulito con un batuffolo di cotone imbevuto di olio minerale e una foto panoramica dei vasi sotto la finestra è presa con l'aiuto di uno stereomicroscopio e una macchina fotografica digitale (Nikon Coolpix 995, Giappone). L'immagine è stampata, identificato e datato e sarà utilizzata come una mappa per le misure del diametro del vaso e di globuli rossi (RBC) velocità. </li><li> Il mouse è poi trasferito in una fase microscopio intravitale (personalizzato Leica-McBain, San Diego, CA). Una goccia d'acqua è posizionato sulla finestra cranica approfittando della ben formata dal acrilico dentale, messa a fuoco viene regolata. Misurazioni sono effettuate utilizzando un 20X (LUMPFL-WIR, apertura numerica 0.6, Olympus) obiettivo immersione in acqua. Le stesse navi sono seguite in modo che i confronti diretti ai loro livelli basali è stato possibile effettuare, permettendo un maggiore statistiche robuste per le popolazioni piccolo campione. Le immagini vengono catturate con una macchina fotografica digitale a bassa velocità della luce (Hamamatsu C9300-221, in Giappone), o bassa telecamera analogica luce (Cohu 4815, San Diego, CA) collegato ad un nastro videoregistratore (JVC, Giappone), di data e ora (Video MicroImage sistemi, Boyertown, PA) e un monitor a colori (PELCO, Clovis, CA). Il nastro è correttamente identificati prima dell'inizio della registrazione, e il timestamp permette l'identificazione degli eventi documentando il periodo di tempo durante il quale sono stati ricodificato tali eventi. </li><li> Un primo controllo dei vasi è fatto per valutare la qualità della preparazione e se il sangue scorre in tutte le navi. Poi, la selezione dei vasi da misurare è fatto e dovrebbe includere venule e arteriole di diametri diversi (nel nostro preparati topo piale, maggior parte delle navi comprese tra 20 e 80μm) e coprono diverse posizioni all'interno della superficie esposta alla finestra. Arteriole e venule possono essere facilmente differenziate controllando la direzione del flusso di sangue nel ramificazioni della nave (se distribuisce o raccoglie il sangue). Nei nostri studi, le misure sono effettuate in 12 unità. Posizione precisa di ogni punto da misurare è annotato nel quadro della vascolarizzazione piale. </li><li> Per ogni spot, il diametro del vaso è misurata utilizzando un dispositivo di taglio dell'immagine (taglio immagine, Vista Elettronica, San Diego, CA) 2. Una volta che il luogo è selezionata, l'immagine della nave è allineato in posizione verticale e l'immagine viene tosato fino agli estremi opposti sono allineati e la lettura è documentata. Questo valore può essere tradotto in micrometri da precedente calibrazione per ogni ingrandimento specifico utilizzando un reticolo micrometrico di taratura (Edmund Optics Inc., Barrington, New Jersey). </li><li> Ogni spot è registrato durante almeno 30 secondi per il monitoraggio degli eritrociti. Per l'inseguimento, un campione di sangue viene raccolto, ed eritrociti sono marcate con il colorante carbocyanine Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) e infuso attraverso la vena della coda per ottenere un concentrazioni in vivo di circa 0.4-0.5% 3. Negli animali infettati da Plasmodium berghei ANKA (PBA) che esprime la proteina fluorescente verde (GFP-PBA, una donazione dalla ricerca sulla malaria e di riferimento reagente Resource Center MR4, Manassas, VA; depositati da CJ Janse e AP Waters), nessuna infusione di etichetta cella è necessario. Le immagini video sono registrati a 150 fotogrammi al secondo. Questo tasso è impostato per ottenere 1-6 immagini di una cella su un fotogramma del video per la determinazione delle velocità fino a 8 mm / s. Le immagini video sono digitalizzati con un personal computer utilizzando il software Adobe Premiere 4.0 e xy dati di coordinate per ogni immagine cellulari ottenute utilizzando SigmaScan Pro 4.0 software (SPSS Chicago, IL) 4. Posizioni delle cellule sono determinate manualmente piuttosto che da analisi d'immagine, dato che l'occhio di un osservatore addestrato ha dimostrato di dare una buona stima della posizione del centro di una cellula, cheh, in generale, corrisponde alla posizione di fluorescenza massima osservato per la maggior parte delle cellule orientamenti. Determinazioni multiple di posizione e velocità sono fatti per ogni cella e una media di ottenere velocità media dei globuli rossi. </li><li> Quando misure di velocità dei globuli rossi vengono eseguite in linea, il tempo di osservazione totale per ogni mouse non sia superiore a 10-15 minuti cardiodepressive minimizzare gli effetti dell'anestesia. </li><li> Una volta diametro del vaso e misure della velocità di RBC sono disponibili, il calcolo del flusso sanguigno in ogni nave può essere fatto utilizzando la formula: Q = V x π (D / 2) 2, dove Q = flusso di sangue, V = velocità dei globuli rossi e D = diametro del vaso. </li><li> Queste procedure possono essere ripetute nel tempo. Per esempio, nel modello murino della malaria cerebrale, eseguiamo misurazioni giornaliere a partire dal giorno 4 di infezione. I valori ottenuti ogni giorno per ogni mouse sono normalizzati rispetto al giorno 0 (pre-infezione), che è considerato al 100%. </li><li> Oltre al diametro del vaso e le misurazioni del flusso sanguigno, le valutazioni aggiuntive possono essere eseguite, per esempio una migliore valutazione della perfusione e l'analisi di rotolamento dei leucociti e / o piastrine e l'aderenza in vasi piale. Queste misurazioni sono effettuate con l'ausilio di marcatori fluorescenti-etichettati. Nel caso della malaria, si può anche rilevare in circolazione o parassiti aderenti mediante utilizzando il ceppo PBA che esprime GFP. </li><li> Per la valutazione della perfusione usiamo una soluzione di albumina marcato con FITC (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), e per quantificare l'adesione dei leucociti alle navi piale si usa anticorpi contro il pan-leucociti marcatore CD45 marcati con Texas Red (TXR) ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Per questo, 25μL del Albumina-FITC (2mg/ml) e 20μL del movimento anti-CD45-PE anticorpi (200μg/mL) sono miscelati e iniettati nel pre-riscaldato vena della coda. Il mouse può essere ripreso immediatamente, se le misure di dispersione si albumina-FITC è consentito di circolare per 15 minuti. Fluorescenza verde (518nm) emessa da albumina-FITC e GFP (PBA-GFP pRBC) viene catturata usando e ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), e anti-CD45-TXR fluorescenza (615nm) viene chiuso e catturato con un Vivid standard: XF42. </li><li> La fluorescenza marcata albumina permette una migliore visualizzazione della rete vascolare, comprese le navi penetrante, ed è particolarmente utile negli stati di malattia come la malaria cerebrale per verificare per le navi non perfuso o sotto-perfusi. Può anche essere utilizzato per misurare la perdita vascolare 5. </li><li> Il fluorescente marcato anticorpi anti-CD45 lo rendono facile da identificare e quantificare rotolamento dei leucociti e l'adesione alle navi piale. Per evitare distorsioni nella quantificazione, si quantificare rotolamento e adesione sugli stessi punti predefiniti per misurare il flusso sanguigno. Quantificazione di adesione dei leucociti è fatto contando il numero di leucociti in una nave-100μm lunghezza. Rotolamento è quantificato contando il numero di leucociti viaggia a una velocità notevolmente più lento di velocità del sangue nella stessa lunghezza 100μm, per 30 secondi. </li></ol> 3. Rappresentante risultati <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. (Punto 2.6) Immagini della rete piale vascolare del mouse accessibile attraverso la finestra del cranio. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. (Piazza di 3,1-3,5) visualizzare schematica del set up per la microscopia intravitale del microcircolo del mouse piale. 1: intravitale microscopio; 2: 20X obiettivo immersione in acqua; 3: sorgente di luce; 4a: digitale di scarsa illuminazione telecamera ad alta velocità; 4b: telecamera analogica; 5: il mouse nel frame stereotassico; 6: monitor del computer; 7: analogico tosatore Monitor che mostra come la tosatura immagine (freccia) viene fatto per misurare diametro del vaso. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. (Passo 3,6-3,8) microvascolari rosso sangue velocità misurazioni delle cellule tenendo traccia delle cellule di registrazioni video ad alta velocità fluorescenza. Foto da A a F sono immagini sequenza di una nave piale, mostrando un singolo RBC in movimento che attraversano il campo microscopico delimitata dalla fotocamera. Determinazione manuale del fotogramma per fotogramma posizioni di 15 o più celle che attraversano il campo, con la sua distanza pre-calibrato, permette il calcolo della velocità media dei globuli rossi in ogni nave con l'aiuto di un foglio di calcolo Excel. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Figura 4"> Figura 4. (Punto 3.9) dei dati di un esperimento rappresentativo che mostra i cambiamenti del flusso sanguigno piale nel tempo in Plasmodium berghei ANKA (PBA) topi infettati (n = 5) e in topi di controllo non infetto (n = 5). Mentre in topi di controllo del flusso di sangue piale è relativamente stabile nel tempo, PBA topi infettati mostrano una marcata diminuzione del flusso sanguignoal momento dello sviluppo della malaria cerebrale (giorno 6). I dati sono la media ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Figura 5"> Figura 5. (Step 4.3) Un gran numero di leucociti aderenti alle navi piale di un topo infettati da Plasmodium berghei ANKA, come rivelato dalla colorazione con anticorpi anti-CD45-Texas Red anticorpi fluorescenti.

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di microscopia intravitale qui descritto fornisce uno strumento unico e potente per l&#39;osservazione dettagliata del microcircolo piale nel topo. Permette individuando singole arteriole e venule e misurare i cambiamenti di un certo numero di parametri quali diametro nave, velocità dei globuli rossi, il flusso di sangue, aderenza e rotolamento dei leucociti, piastrine e altri elementi del sangue, fuoriuscita vascolare, pH tessutale e pO2 e potenzialmente molti altri applicazioni. La risposta vascolare in ...

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Colorante carbocianina Dil</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumina-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-CD45-TxR</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Questo modello sperimentale è stato disegnato per valutare la microcircolazione piale mouse durante acute e croniche, emodinamica fisiologico e fisiopatologico, stati infiammatori e metabolici, utilizzando in vivo microscopia a fluorescenza. Una finestra chiusa del cranio è posta sopra la sinistra corteccia parieto-occipitale dei topi. Microcircolazione locale è registrato in tempo reale attraverso la finestra utilizzando epi e illuminazione a fluorescenza, e le misure di diametri navi e dei globuli rossi (RBC) velocità vengono eseguiti. RBC velocità viene misurata utilizzando in tempo reale cross-correlazione e / o eritrociti fluorescente-etichettati. L&#39;adesione dei leucociti e delle piastrine alle navi piale e valutazione della perfusione vascolare e perdite sono realizzati con l&#39;aiuto di marcatori di fluorescenza marcati come gli anticorpi albumina-FITC e anti-CD45-TXR. Microcircolazione possono essere ripetutamente il video-registrato per diversi giorni. Abbiamo usato per la prima volta alla chiusura microscopia cervello finestra intravitale per studiare il microcircolo piale di seguire i cambiamenti dinamici nel corso di infezione da Plasmodium berghei ANKA nei topi e mostrano che l&#39;espressione di CM è associata a disfunzioni del microcircolo caratterizzata da vasocostrizione, marcata diminuzione nel sangue flusso e alla fine il collasso vascolare.

Microscopia intravitale di seguire gli eventi emodinamici infiammatori e temporale e spaziale del microcircolo piale.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

Questo modello sperimentale è stato progettato per valutare la microcircolazione piale del topo durante condizioni emodinamiche acute e croniche, fisiologiche e patofisiologiche, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la microcircolazione nel cervello del topo mediante microscopia intravitale, che consente di monitorare i cambiamenti dinamici nei marcatori emodinamici e infiammatori nella microcircolazione piale per periodi prolungati di tempo. Questa tecnica è stata sviluppata presso l'Istituto di Bioingegneria di La Jolla, dove è stata utilizzata per molti tipi di studi. Ad esempio, il monitoraggio dei cambiamenti emodinamici durante il decorso dell'infezione da plasmodium berghei e nel momento dell'espressione della malaria cerebrale.Questo viene effettuato innanzitutto impiantando una finestra cranica cronica due settimane prima degli studi di microscopia intravitale. Il secondo passaggio della procedura consiste nel registrare la morfologia complessiva della finestra cranica mediante un'immagine digitale ad alta risoluzione a basso ingrandimento. Il terzo passaggio della procedura è acquisire immagini di microscopia intravitale utilizzando illuminazione convenzionale e fluorescente, e selezionare specifici siti di studio per misurazioni in tempo reale del diametro dei vasi e della velocità dei globuli rossi.L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'eseguire un'analisi intravitale dell'adesione di leucociti e piastrine nei vasi piliferi mediante anticorpi specifici marcati con fluorescenza. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano in vivo modifiche microcircolatorie in modelli cerebrali che rispecchiano condizioni fisiologiche, patofisiologiche o patologiche, attraverso la microscopia intravitale cerebrale, al fine di stabilire i cambiamenti emodinamici associati a tali condizioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette di osservare il cervello nel suo ambiente fisiologico senza esporlo ad agenti esterni o a mezzi artificiali; rispetto alla risonanza magnetica e all'angiografia, la microscopia intravitale offre risoluzioni spaziale e temporale elevate e ci consente di osservare dal livello macroscopico a quello microscopico.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla fisiologia e la fisiopatologia della microcircolazione cerebrale, come ad esempio i cambiamenti emodinamici e infiammatori durante malattie acute e croniche. Da due a tre settimane prima della microscopia intravitale, viene eseguita una craniotomia su topi di età compresa tra otto e dieci settimane, come precedentemente dimostrato, con l’unica differenza che una barra di titanio non viene posizionata sulla testa dell’animale. La finestra cranica cronica costituisce una preparazione stabile, che permette l’esame della microcircolazione del parenchima anche mesi dopo l’impianto, nel giorno dell’esperimento.Prima di tutto, verificare la temperatura corporea dell'animale prima di posizionare l'animale in un telaio stereotassico, infondendo globuli rossi precedentemente marcati con fluorescenza attraverso la vena della coda del topo. Questo permetterà il tracciamento dei globuli rossi, che verrà dimostrato in seguito. Quindi anestetizzare leggermente il topo con isoflurano.4% per l'induzione, dall'1 al 2% per il mantenimento. Successivamente, posizionare l'animale in posizione prona all'interno di un telaio stereotassico su un tappetino riscaldante. Fissare attentamente la testa utilizzando le barre auricolari e regolare il livello mediante le leve destra e sinistra.Pulire delicatamente il vetrino della finestra cranica con un bastoncino di cotone inumidito con olio minerale. Quindi, utilizzando un microscopio stereoscopico collegato a una fotocamera digitale, acquisire alcune fotografie panoramiche dei vasi situati sotto la finestra. Dopo aver trasferito le immagini panoramiche su un computer, selezionare quella migliore da stampare, identificare e datare.Questa foto verrà utilizzata come mappa per le misurazioni del diametro dei vasi e della velocità dei globuli rossi, che saranno dimostrate successivamente per iniziare la microscopia intravitale. Trasferire il topo su un supporto microscopico intravitale personalizzato. Applicare una goccia d'acqua sulla finestra cranica sfruttando la camera formata dall'acrilico dentale.Si utilizza un obiettivo ad immersione in acqua 20x con apertura numerica di 0,5. Le immagini vengono registrate mediante due telecamere: una telecamera digitale ad alta sensibilità, bassa luminosità e alta velocità collegata a un computer e a un monitor, e una telecamera analogica a bassa luminosità collegata a un registratore video (VCR), a un dispositivo di marcatura temporale e a un monitor a colori. Prima di selezionare i vasi da misurare, controllare i vasi per valutare la qualità del preparato e verificare che il sangue circoli in tutti i vasi; quindi selezionare i vasi da misurare. Questi dovrebbero includere vene e arterie di diverso diametro e coprire diverse posizioni all'interno dell'area esposta dalla finestra.Nel nostro esperimento, selezioniamo 12 vasi per la misurazione mentre si osservano diversi campi all'interno della finestra cranica. Per selezionare i vasi, si annota la posizione precisa di ciascun punto da misurare sulla foto della vascolarizzazione PY, scattata in precedenza. Per ogni punto, il diametro del vaso viene misurato utilizzando un dispositivo di scorrimento dell'immagine. Una volta selezionato il punto, l'immagine del vaso viene allineata in posizione verticale e l'immagine viene scorsa fino ai bordi opposti.Gli estremi vengono allineati e la lettura viene documentata. Per il tracciamento degli eritrociti, ogni punto viene registrato dalla fotocamera digitale per almeno 30 secondi e le immagini video vengono acquisite a 150 fotogrammi al secondo. Questa velocità è impostata per ottenere da uno a sei fotogrammi di una cellula su un singolo fotogramma video, al fine di determinare velocità fino a sei millimetri al secondo.Una volta completata la raccolta dei dati, rimuovere il topo dal telaio stereotassico e riposizionarlo nella gabbia per farlo riprendere dall'anestesia utilizzando un software appropriato. Le immagini video acquisite vengono digitalizzate e vengono ottenuti i dati delle coordinate XY per ogni immagine cellulare. Le posizioni delle cellule vengono determinate manualmente, piuttosto che mediante analisi delle immagini.Dato che l'occhio di un osservatore esperto fornisce una buona stima della posizione del centro di una cellula, che in generale corrisponde al punto di massima fluorescenza osservata, per la maggior parte delle orientazioni cellulari le determinazioni di posizione e velocità vengono effettuate su 15 cellule per ogni vaso. Si calcola una media per ottenere la velocità media dei globuli rossi una volta disponibili le misurazioni del diametro del vaso e della velocità dei globuli rossi.Il calcolo del flusso ematico in ciascun vaso può essere effettuato utilizzando la formula Q uguale a D diviso due al quadrato per PI greco per V, dove Q corrisponde al flusso ematico, V alla velocità dei globuli rossi e D al diametro del vaso, per la valutazione della perfusione e l'analisi dell'adesione dei leucociti nei vasi affluenti. La microscopia intravitale viene eseguita su un animale infuso con una miscela di albumina marcata con FSE e anticorpi contro il marcatore pan-leucocitario CD 45 marcato con Texas Red. L'albumina marcata con fluorescenza permette una migliore visualizzazione della rete vascolare, inclusi i vasi penetranti, ed è particolarmente utile in condizioni patologiche come la malaria cerebrale per verificare la presenza di vasi non perfusi o ipoperfusi.Gli anticorpi anti-CD45 marcati con fluorescenza permettono di identificare e quantificare facilmente il rotolamento e l'adesione dei leucociti ai vasi. La quantificazione dell'adesione dei leucociti avviene contando il numero di leucociti presenti in un tratto di vaso lungo 100 micron. Il rotolamento viene quantificato contando il numero di leucociti che si muovono a una velocità significativamente inferiore rispetto alla velocità del sangue nello stesso tratto di 100 micron durante un periodo di 30 secondi. Illustrato.Di seguito è riportato un esempio di misurazioni della velocità dei globuli rossi nel microcircolo mediante tracciamento cellulare da video ad alta velocità in fluorescenza. Le immagini del video da A a F sono sequenze del microcircolo. Ogni immagine rappresenta la posizione di un singolo globulo rosso in movimento, acquisita fotogramma per fotogramma mediante una telecamera ad alta velocità.Questo grafico proveniente da un esperimento rappresentativo mostra le variazioni nel flusso sanguigno del pene nel tempo. Nei topi infettati da plasmodium, burgi, onca e nei topi di controllo non infetti, mentre nei topi di controllo il flusso sanguigno del pene è relativamente stabile nel tempo. I topi infettati da PBA mostrano una marcata riduzione del flusso sanguigno in concomitanza con lo sviluppo della malaria cerebrale.Al sesto giorno, la colorazione con anticorpi fluorescenti anti-CD45 marcati con Texas Red rivela un elevato numero di leucociti aderenti ai vasi sanguigni di un topo infettato con Plasmodium berghei. Questa procedura ha un'ampia gamma di applicazioni oltre a quella illustrata qui oggi. Qualsiasi tecnica ottica utilizzabile in vivo può essere adattata a questo modello, e parametri come il tessuto, il livello di ossigeno tissutale, il pH, le specie reattive dell'ossigeno e l'interazione endoteliale con i leucociti possono essere studiati in questo modello.

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Corticale dinamiche di flusso di sangue possono essere studiati in vivo attraverso l'immagine fluorescente coloranti destrano iniettato nella vena della coda di roditori con 2-fotone microscopia. Questo video mostra come la dinamica del flusso ematico immagine in neocorteccia di topi attraverso un vetro coperto di preparazione finestra cranica.

Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

In questo video, eseguiamo l'imaging intravitale di cellule tumorali pre-iniettate in un modello murino tramite una finestra cranica impiantata. Questa tecnica di imaging time-lapse ad alta risoluzione consente lo studio del comportamento dinamico delle cellule tumorali nel topo vivo.

Imaging intravitale basato su finestra cranica in un modello murino: una tecnica di imaging per studiare il comportamento delle cellule tumorali pre-iniettate nel cervello di un modello murino

Fonte: Sweeney, A. M., et al. Imaging in vivo del trasporto del liquido cerebrospinale attraverso il cranio di topo intatto mediante macroscopia a fluorescenza. (2019)Questo video dimostra il processo di visualizzazione del flusso del liquido cerebrospinale (CSF) nel cervello di un topo utilizzando l'imaging a fluorescenza. Un tracciante fluorescente viene iniettato nella cisterna magna (CM), consentendo di tracciare il suo movimento con il liquido cerebrospinale attraverso gli spazi...

Imaging in vivo del trasporto del liquido cerebrospinale in un cervello di topo mediante macroscopia a fluorescenza

l'occlusione chirurgica di un ramo distale dell'arteria cerebrale media (MCAO) è un modello di uso frequente nella ricerca ictus sperimentale. Questo manoscritto descrive la tecnica base di MCAO permanente, combinata con l'inserimento di una finestra cranica laterale, che offre la possibilità di longitudinale microscopia intravitale nei topi.

Laterale cronica cranica finestra Preparazione Attiva In Vivo Condizioni seguito distale Medio occlusione dell'arteria cerebrale nei topi

Questo manoscritto descrive una procedura per monitorare il rimodellamento del cerebrovasculature durante accumulo di placca amiloide in vivo utilizzando longitudinale microscopia a due fotoni. Una preparazione assottigliato-teschio consente la visualizzazione di coloranti fluorescenti per valutare la progressione del danno cerebrale in un modello murino della malattia di Alzheimer.

Longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del Cerebrovasculature: Rilevanza per le malattie del sistema nervoso centrale

L'imaging ottico transcranico consente l'imaging ad ampio campo del trasporto di fluidi cerebrospinali nella corteccia di topi vivi attraverso un cranio intatto.

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Questo studio dimostra la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica ripetitiva ai topi e l'impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale di un EGFP espresso da neuroni utilizzando la microscopia a due fotoni.

Imaging intravitale dell'espressione di proteine fluorescenti nei topi con una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso e una finestra cranica utilizzando un microscopio a due fotoni

Questo protocollo contiene una descrizione dettagliata di un approccio passo dopo passo per un modello murino a finestra cranica cronica e embolia microvascolare, ottimizzato per la microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti al polistirene.

Modello murino per embolia microvascolare per microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti di polistirene

Scopri la microscopia intravitale per studiare la microcircolazione cerebrale nel topo usando finestre craniche croniche. Questa tecnica consente di tracciare cambiamenti emodinamici e risposte infiammatorie in vivo nel tempo.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

Esplora altri video