Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la microcircolazione nel cervello del topo mediante microscopia intravitale, che consente di monitorare i cambiamenti dinamici nei marcatori emodinamici e infiammatori nella microcircolazione delle emorroidi per lunghi periodi di tempo. Questa tecnica è stata sviluppata presso l'Istituto di Bioingegneria di La Jolla, dove è stata utilizzata per molti tipi di studi. Ad esempio, il follow-up dei cambiamenti emodinamici durante il decorso dell'infezione da plasmodium burgi onca e al momento dell'espressione della malaria cerebrale.

Ciò si ottiene impiantando per la prima volta una finestra cranica cronica due settimane prima degli studi di microscopia intravitale. Il secondo passo della procedura consiste nel registrare la morfologia complessiva della finestra cranica utilizzando un'immagine digitale ad alta risoluzione a basso ingrandimento. La terza fase della procedura consiste nell'acquisire immagini di microscopia intravitale utilizzando l'illuminazione convenzionale e fluorescente e selezionare siti di studio specifici per le misurazioni online del diametro del vaso e della velocità dei globuli rossi.

La fase finale della procedura consiste nell'eseguire l'analisi intravitale dell'aderenza dei leucociti e delle piastrine nei vasi del pilo tramite anticorpi specifici marcati con fluorescenza. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano in vivo cambiamenti microcircolatori in modelli di rispecchiamento cerebrale di condizioni fisiopatologiche o malate attraverso la microscopia intravitale cerebrale per stabilire i cambiamenti emodinamici associati a queste condizioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che osserviamo il cervello nel suo ambiente fisiologico senza esporlo ad agenti esterni o mezzi artificiali, la microscopia intravitale, rispetto alla risonanza magnetica per immagini e l'angiografia, ha una risoluzione spaziale e temporale e ci permette di guardare dal livello microscopico a quello microscopico.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella fisiologia e nella fisiopatologia della microcircolazione cerebrale, come il cambiamento emodinamico e infiammatorio durante la malattia acuta e cronica Due o tre settimane prima della microscopia intravitale. Una craniotomia viene eseguita in topi di età compresa tra 8 e 10 settimane è stata precedentemente dimostrata, tranne per il fatto che una barra di titanio non è posizionata nella testa dell'animale. La finestra cranica cronica è una preparazione stabile, che consente l'esame del microcircolo emorroico anche mesi dopo essere stato impiantato il giorno dell'esperimento.

Innanzitutto, controllare la temperatura corporea dell'animale prima di posizionare l'animale in un telaio stereotassico infuso precedentemente preparato con eritrociti marcati in fluorescenza attraverso la vena caudale del topo. Ciò consentirà il tracciamento degli eritrociti, che verrà dimostrato in seguito. Quindi anestetizzare leggermente il topo con fluoro.

4% per induzione, da uno a 2% per mantenimento. Quindi, posiziona l'animale in posizione prona in un telaio stereotassico su un termoforo. Fissare con cura la testa utilizzando le barre auricolari e regolare il livello utilizzando le leve destra e sinistra.

Pulire delicatamente il vetrino coprioggetti sulla finestra cranica con un batuffolo di cotone inumidito con olio minerale. Quindi, utilizzando uno stereomicroscopio collegato a una fotocamera digitale, scatta alcune fotografie panoramiche delle navi sotto la finestra. Dopo aver trasferito le foto panoramiche su un computer, seleziona quella migliore da stampare, identificare e datare.

Questa foto verrà utilizzata come mappa per le misurazioni del diametro dei vasi sanguigni e delle velocità dei globuli rossi, che verranno dimostrate successivamente all'inizio della microscopia intravitale. Trasferire il mouse su un tavolino per microscopio intravitale personalizzato. Posizionare una goccia d'acqua sulla finestra cranica sfruttando il pozzo formato dall'acrilico dentale.

Viene utilizzato un obiettivo a immersione in acqua 20 x con apertura numerica di 0,5. Le immagini vengono registrate utilizzando due telecamere, una digitale in condizioni di scarsa illuminazione, una telecamera ad alta velocità collegata a un computer e un monitor e una telecamera analogica in condizioni di scarsa illuminazione collegata a un nastro videoregistratore, un timestamp e un monitor a colori prima di selezionare i recipienti per la misurazione, controllare i vasi per valutare la qualità della preparazione e se il sangue scorre in tutti i vasi, Quindi selezionare i recipienti da misurare. Dovrebbero includere sedi e arterie di diverso diametro e coprire diverse posizioni all'interno dell'area esposta dalla finestra.

Nel nostro esperimento, selezioniamo 12 vasi per la misurazione mentre si visualizzano vari campi all'interno della finestra cranica. Per selezionare i vasi, annotare la posizione precisa di ciascun punto da misurare nella foto del sistema vascolare PY che è stata scattata in precedenza per ogni punto, il diametro del vaso viene misurato utilizzando un dispositivo di taglio a immagini. Una volta selezionato il punto, l'immagine del recipiente viene allineata in posizione verticale e l'immagine viene tranciata fino al contrario.

Gli estremi sono allineati e la lettura è documentata. Per il tracciamento degli eritrociti, ogni punto viene registrato dalla fotocamera digitale per almeno 30 secondi e le immagini video vengono registrate a 150 fotogrammi al secondo. Questa velocità è impostata per ottenere da una a sei immagini di una cella su un fotogramma video per la determinazione di velocità fino a sei millimetri al secondo.

Una volta terminata la raccolta dei dati, rimuovere il topo dal telaio stereotassico e rimetterlo nella sua gabbia per riprendersi dall'anestesia utilizzando un software appropriato. Le immagini video acquisite vengono digitalizzate e XY. Si ottengono i dati delle coordinate per ogni immagine di cella. Le posizioni delle celle vengono determinate manualmente anziché tramite l'analisi delle immagini.

Dato che l'occhio di un osservatore addestrato fornisce una buona stima della posizione del centro di una cellula, che in generale corrisponde alla posizione della massima fluorescenza osservata. Per la maggior parte degli orientamenti delle celle, le determinazioni della posizione e della velocità vengono effettuate per 15 celle in ciascun recipiente. Una media per ottenere la velocità media dei globuli rossi una volta che sono disponibili le misurazioni del diametro del recipiente e della velocità dei globuli rossi.

Il calcolo del flusso sanguigno in ciascun vaso può essere effettuato utilizzando la formula Q uguale a D su due volte al quadrato PI per V dove Q è uguale al flusso sanguigno, V è uguale alla velocità dei globuli rossi e D è uguale al diametro dei vasi per la valutazione della profusione e l'analisi dell'aderenza dei leucociti nei vasi in pila. La microscopia intravitale viene eseguita su un animale infuso con una miscela di albumina marcata con FSE e anticorpi contro il marcatore leucocitario pan CD 45 marcato con Texas Red. L'albumina marcata con fluorescenza consente una migliore visualizzazione della rete vascolare, compresi i vasi penetranti, ed è particolarmente utile in stati patologici come la malaria cerebrale per verificare la presenza di vasi non perfusi o sottoperfusi.

Gli anticorpi anti CD 45 marcati con fluorescenza facilitano l'identificazione e la quantificazione del rotolamento dei leucociti e l'adesione ai vasi di pile. La quantificazione dell'adesione dei leucociti viene effettuata contando il numero di leucociti in una lunghezza del vaso di 100 micron. Il rotolamento viene quantificato contando il numero di leucociti che viaggiano a una velocità significativamente più lenta della velocità del sangue nella stessa lunghezza di 100 micron durante 30 secondi. Mostrato.

Ecco un esempio di misurazioni microvascolari della velocità dei globuli rossi mediante tracciamento cellulare dalla fluorescenza ad alta velocità. Le registrazioni video, le immagini da A a F sono immagini in sequenza del microcircolo. Ogni immagine rappresenta la posizione di un singolo globulo rosso che scorre, che viene catturato fotogramma per fotogramma dalla telecamera ad alta velocità.

Questo grafico di un esperimento rappresentativo mostra i cambiamenti nel flusso sanguigno delle emorroidi nel tempo. Nei topi infettati da plasmodium, burgi, onca e nei topi di controllo non infetti, mentre nei topi di controllo, il flusso sanguigno di pile è relativamente stabile nel tempo. I topi infetti da PBA mostrano una diminuzione del flusso sanguigno in un momento di sviluppo della malaria cerebrale.

Al sesto giorno, la colorazione con anticorpi anti CD 45, Texas red fluorescent rivela un gran numero di leucociti che aderiscono ai vasi di un topo infettato da plasmodium burgi onca. Questa procedura ha una vasta gamma di applicazioni oltre all'unico lavoro qui oggi. Qualsiasi tecnica ottica che può essere utilizzata in vivo può essere adattata a questo modello e in questo modello possono essere studiati parametri come il tessuto, il livello di ossigeno nel tessuto, le specie reattive al pH dell'ossigeno e l'interazione endoteliale con i leucociti.