Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la microcircolazione nel cervello del topo mediante microscopia intravitale, che consente di monitorare i cambiamenti dinamici nei marcatori emodinamici e infiammatori nella microcircolazione piale per periodi prolungati di tempo. Questa tecnica è stata sviluppata presso l'Istituto di Bioingegneria di La Jolla, dove è stata utilizzata per molti tipi di studi. Ad esempio, il monitoraggio dei cambiamenti emodinamici durante il decorso dell'infezione da plasmodium berghei e nel momento dell'espressione della malaria cerebrale.

Questo viene effettuato innanzitutto impiantando una finestra cranica cronica due settimane prima degli studi di microscopia intravitale. Il secondo passaggio della procedura consiste nel registrare la morfologia complessiva della finestra cranica mediante un'immagine digitale ad alta risoluzione a basso ingrandimento. Il terzo passaggio della procedura è acquisire immagini di microscopia intravitale utilizzando illuminazione convenzionale e fluorescente, e selezionare specifici siti di studio per misurazioni in tempo reale del diametro dei vasi e della velocità dei globuli rossi.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'eseguire un'analisi intravitale dell'adesione di leucociti e piastrine nei vasi piliferi mediante anticorpi specifici marcati con fluorescenza. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano in vivo modifiche microcircolatorie in modelli cerebrali che rispecchiano condizioni fisiologiche, patofisiologiche o patologiche, attraverso la microscopia intravitale cerebrale, al fine di stabilire i cambiamenti emodinamici associati a tali condizioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette di osservare il cervello nel suo ambiente fisiologico senza esporlo ad agenti esterni o a mezzi artificiali; rispetto alla risonanza magnetica e all'angiografia, la microscopia intravitale offre risoluzioni spaziale e temporale elevate e ci consente di osservare dal livello macroscopico a quello microscopico.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla fisiologia e la fisiopatologia della microcircolazione cerebrale, come ad esempio i cambiamenti emodinamici e infiammatori durante malattie acute e croniche. Da due a tre settimane prima della microscopia intravitale, viene eseguita una craniotomia su topi di età compresa tra otto e dieci settimane, come precedentemente dimostrato, con l’unica differenza che una barra di titanio non viene posizionata sulla testa dell’animale. La finestra cranica cronica costituisce una preparazione stabile, che permette l’esame della microcircolazione del parenchima anche mesi dopo l’impianto, nel giorno dell’esperimento.

Prima di tutto, verificare la temperatura corporea dell'animale prima di posizionare l'animale in un telaio stereotassico, infondendo globuli rossi precedentemente marcati con fluorescenza attraverso la vena della coda del topo. Questo permetterà il tracciamento dei globuli rossi, che verrà dimostrato in seguito. Quindi anestetizzare leggermente il topo con isoflurano.

4% per l'induzione, dall'1 al 2% per il mantenimento. Successivamente, posizionare l'animale in posizione prona all'interno di un telaio stereotassico su un tappetino riscaldante. Fissare attentamente la testa utilizzando le barre auricolari e regolare il livello mediante le leve destra e sinistra.

Pulire delicatamente il vetrino della finestra cranica con un bastoncino di cotone inumidito con olio minerale. Quindi, utilizzando un microscopio stereoscopico collegato a una fotocamera digitale, acquisire alcune fotografie panoramiche dei vasi situati sotto la finestra. Dopo aver trasferito le immagini panoramiche su un computer, selezionare quella migliore da stampare, identificare e datare.

Questa foto verrà utilizzata come mappa per le misurazioni del diametro dei vasi e della velocità dei globuli rossi, che saranno dimostrate successivamente per iniziare la microscopia intravitale. Trasferire il topo su un supporto microscopico intravitale personalizzato. Applicare una goccia d'acqua sulla finestra cranica sfruttando la camera formata dall'acrilico dentale.

Si utilizza un obiettivo ad immersione in acqua 20x con apertura numerica di 0,5. Le immagini vengono registrate mediante due telecamere: una telecamera digitale ad alta sensibilità, bassa luminosità e alta velocità collegata a un computer e a un monitor, e una telecamera analogica a bassa luminosità collegata a un registratore video (VCR), a un dispositivo di marcatura temporale e a un monitor a colori. Prima di selezionare i vasi da misurare, controllare i vasi per valutare la qualità del preparato e verificare che il sangue circoli in tutti i vasi; quindi selezionare i vasi da misurare. Questi dovrebbero includere vene e arterie di diverso diametro e coprire diverse posizioni all'interno dell'area esposta dalla finestra.

Nel nostro esperimento, selezioniamo 12 vasi per la misurazione mentre si osservano diversi campi all'interno della finestra cranica. Per selezionare i vasi, si annota la posizione precisa di ciascun punto da misurare sulla foto della vascolarizzazione PY, scattata in precedenza. Per ogni punto, il diametro del vaso viene misurato utilizzando un dispositivo di scorrimento dell'immagine. Una volta selezionato il punto, l'immagine del vaso viene allineata in posizione verticale e l'immagine viene scorsa fino ai bordi opposti.

Gli estremi vengono allineati e la lettura viene documentata. Per il tracciamento degli eritrociti, ogni punto viene registrato dalla fotocamera digitale per almeno 30 secondi e le immagini video vengono acquisite a 150 fotogrammi al secondo. Questa velocità è impostata per ottenere da uno a sei fotogrammi di una cellula su un singolo fotogramma video, al fine di determinare velocità fino a sei millimetri al secondo.

Una volta completata la raccolta dei dati, rimuovere il topo dal telaio stereotassico e riposizionarlo nella gabbia per farlo riprendere dall'anestesia utilizzando un software appropriato. Le immagini video acquisite vengono digitalizzate e vengono ottenuti i dati delle coordinate XY per ogni immagine cellulare. Le posizioni delle cellule vengono determinate manualmente, piuttosto che mediante analisi delle immagini.

Dato che l'occhio di un osservatore esperto fornisce una buona stima della posizione del centro di una cellula, che in generale corrisponde al punto di massima fluorescenza osservata, per la maggior parte delle orientazioni cellulari le determinazioni di posizione e velocità vengono effettuate su 15 cellule per ogni vaso. Si calcola una media per ottenere la velocità media dei globuli rossi una volta disponibili le misurazioni del diametro del vaso e della velocità dei globuli rossi.

Il calcolo del flusso ematico in ciascun vaso può essere effettuato utilizzando la formula Q uguale a D diviso due al quadrato per PI greco per V, dove Q corrisponde al flusso ematico, V alla velocità dei globuli rossi e D al diametro del vaso, per la valutazione della perfusione e l'analisi dell'adesione dei leucociti nei vasi affluenti. La microscopia intravitale viene eseguita su un animale infuso con una miscela di albumina marcata con FSE e anticorpi contro il marcatore pan-leucocitario CD 45 marcato con Texas Red. L'albumina marcata con fluorescenza permette una migliore visualizzazione della rete vascolare, inclusi i vasi penetranti, ed è particolarmente utile in condizioni patologiche come la malaria cerebrale per verificare la presenza di vasi non perfusi o ipoperfusi.

Gli anticorpi anti-CD45 marcati con fluorescenza permettono di identificare e quantificare facilmente il rotolamento e l'adesione dei leucociti ai vasi. La quantificazione dell'adesione dei leucociti avviene contando il numero di leucociti presenti in un tratto di vaso lungo 100 micron. Il rotolamento viene quantificato contando il numero di leucociti che si muovono a una velocità significativamente inferiore rispetto alla velocità del sangue nello stesso tratto di 100 micron durante un periodo di 30 secondi. Illustrato.

Di seguito è riportato un esempio di misurazioni della velocità dei globuli rossi nel microcircolo mediante tracciamento cellulare da video ad alta velocità in fluorescenza. Le immagini del video da A a F sono sequenze del microcircolo. Ogni immagine rappresenta la posizione di un singolo globulo rosso in movimento, acquisita fotogramma per fotogramma mediante una telecamera ad alta velocità.

Questo grafico proveniente da un esperimento rappresentativo mostra le variazioni nel flusso sanguigno del pene nel tempo. Nei topi infettati da plasmodium, burgi, onca e nei topi di controllo non infetti, mentre nei topi di controllo il flusso sanguigno del pene è relativamente stabile nel tempo. I topi infettati da PBA mostrano una marcata riduzione del flusso sanguigno in concomitanza con lo sviluppo della malaria cerebrale.

Al sesto giorno, la colorazione con anticorpi fluorescenti anti-CD45 marcati con Texas Red rivela un elevato numero di leucociti aderenti ai vasi sanguigni di un topo infettato con Plasmodium berghei. Questa procedura ha un'ampia gamma di applicazioni oltre a quella illustrata qui oggi. Qualsiasi tecnica ottica utilizzabile in vivo può essere adattata a questo modello, e parametri come il tessuto, il livello di ossigeno tissutale, il pH, le specie reattive dell'ossigeno e l'interazione endoteliale con i leucociti possono essere studiati in questo modello.