Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del

L'obiettivo generale di questo saggio di PCR digitale duplex è quantificare simultaneamente la contaminazione fecale generica e quella associata all'uomo nelle acque. Questo saggio può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel monitoraggio della qualità delle acque ricreative, come ad esempio: quanta indicatore fecale generica, ovvero Enterococcus, e, cosa più importante, quanta marcatura HF183 associata alle feci umane è presente nelle acque?

Il vantaggio principale di questo saggio è che consente la quantificazione di due bersagli in una singola reazione e, rispetto alla qPCR, elimina la necessità di eseguire curve standard, riducendo così il bias e la variabilità associati. A illustrare la procedura sarà Meredith Raith, la nostra Tecnica Senior di Ricerca. Per iniziare questa procedura, preparare innanzitutto delle concentrazioni stock di 100 micromoli per litro di tutti i primer in acqua di grado molecolare e delle sonde in tampone TEPH 8, come descritto nel testo del protocollo.

Successivamente, preparare un Master Mix mescolando le quantità appropriate di mix per Digital PCR, primer forward e reverse, la sonda fluorescente e acqua priva di nucleasi. Pipettare su e giù almeno 10 volte per mescolare, avendo cura di non introdurre bolle d'aria nella soluzione. Poiché il Master Mix per dPCR è più viscoso del Master Mix convenzionale per qPCR, è necessario utilizzare la tecnica di mescolamento mediante pipettaggio per ottenere una soluzione omogenea.

Questo consente una quantificazione precisa mediante dPCR in fasi successive. Per preparare la miscela di saggio per la generazione di goccioline, al fine di eseguire i campioni in duplicato, pipettare 36 microlitri del Master Mix in una piastra PCR standard. A ciascuno dei 36 microlitri di Master Mix, aggiungere 12 microlitri di stampo di DNA, lasciando vuoti i pozzetti corrispondenti ai duplicati sulla piastra.

Includere controlli positivi per assicurare che il saggio funzioni correttamente. Includere controlli senza stampo (No Template Controls o NTC) per verificare l’assenza di contaminazione nella piastra e per impostare successivamente la linea di base della fluorescenza durante l’analisi dei dati. Prima di preparare il Droplet Generator, mescolare le miscele di saggio utilizzando una pipetta multicanale, aspirando e dispensando le miscele su e giù circa 15 volte.

Assicurarsi che la punta della pipetta rimanga all'interno del liquido per evitare la formazione di bolle d'aria nella miscela. Successivamente, inserire la cartuccia uno contenente otto pozzetti in un supporto per cartucce bianco e chiudere il supporto con un clic. La cartuccia uno è ora saldamente al suo posto e non può essere rimossa dal supporto durante la generazione delle goccioline.

Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire delicatamente 20 microlitri della miscela per il saggio nella posizione centrale della cartuccia contrassegnata come campione, senza introdurre bolle d'aria. Pipettare 70 microlitri di olio per la generazione di gocce nel lato sinistro della cartuccia contrassegnato come olio. Coprire la cartuccia con una guarnizione, assicurandosi che sia piatta e ben tenuta dai quattro riferimenti situati sul bordo della cartuccia.

Premere il pulsante illuminato di verde sul Generatore di gocce per aprire la porta e inserire la cartuccia. Premere nuovamente il pulsante per chiudere il generatore. Una volta chiusa la porta, il pulsante verde si attenua e la porta non può essere riaperta.

La generazione delle goccioline inizierà immediatamente e continuerà per circa un minuto. Mentre la generazione delle goccioline è in corso, posizionare la cartuccia due in un secondo supporto bianco per cartucce e prepararla nello stesso modo utilizzato per la cartuccia uno. Al termine della generazione delle goccioline, il pulsante precedentemente spento diventerà verde.

Aprire la porta del Generatore di Gocce, rimuovere il supporto bianco del cartuccia contenente la cartuccia uno e metterlo da parte. Inserire la cartuccia due nel Generatore di Gocce. Rimuovere la guarnizione dalla cartuccia uno e smaltirla.

Non disinserire il supporto bianco del cartuccia perché questa azione potrebbe rompere le goccioline appena generate. Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 40 microlitri, inserire le punte nella terza colonna della cartuccia contrassegnata come goccioline, con un angolo di 45 gradi, ed aspirare lentamente tutte le goccioline. Trasferirle nella piastra PCR finale appoggiando la punta della pipetta contro la parete del pozzetto all'incirca a metà altezza ed espellendo lentamente le goccioline.

Nello stesso modo, al termine della generazione delle goccioline per la cartuccia due, rimuovere la guarnizione dalla cartuccia due e trasferire le goccioline generate nella piastra PCR finale. Posizionare un coperchio in foglio metallico forabile sulla piastra e appoggiarla su un sigillatore per piastre. Impostare il sigillatore a 180 gradi celsius, premere il tasto di avvio e sigillare per 10 secondi.

Per iniziare questa procedura, posizionare la piastra PCR sigillata nel termociclatore. Utilizzare un termociclatore compatibile con la piastra PCR finale e con una velocità di variazione della temperatura di due gradi celsius al secondo. Eseguire il seguente programma termico: dieci minuti a 95 gradi celsius, seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 gradi celsius e 60 secondi a 60 gradi celsius, seguiti da un mantenimento di dieci minuti a 98 gradi celsius.

Al termine del ciclo, trasferire la piastra su un Droplet Reader per la misurazione automatica della fluorescenza in ciascun droplet di ogni pozzetto. Assicurarsi che i droplet siano a temperatura ambiente prima di procedere con la lettura dei droplet. Iniziare aprendo il software fornito per configurare la lettura dei droplet.

Nel menu di configurazione predefinito contenente lo schema di una piastra vuota a 96 pozzetti, fare doppio clic sul pozzetto A1 per aprire il menu suddiviso in tre sezioni: Campione, Saggio 1 e Saggio 2. Nella sezione Campione, inserire l'ID del campione nel campo etichettato come Nome e selezionare la casella di controllo a destra contrassegnata come Applica. Successivamente, fare clic sul menu a discesa etichettato come esperimento, scegliere RED per Rilevamento di Eventi Rari e fare clic su Invio.

Passare alla sezione denominata Assay 1. Nella sezione Nome, compilare il campo Assay e premere Invio. Nella casella sottostante etichettata Tipo, fare clic sul menu a discesa, selezionare Channel 1 Unknown e premere Invio.

Vai alla sezione indicata come Assay 2. Nella sezione Nome, compila il campo Assay e premi Invio. Nella casella sottostante etichettata Tipo, fai clic sul menu a discesa, seleziona Channel 2 Unknown e premi Invio.

Tutte le informazioni provenienti dai passaggi precedenti sono ora presenti nel pozzetto A1. Assegnare un nome a tutti i pozzetti successivi contenenti gocce. Per ridurre al minimo il tempo totale di configurazione, fare clic sui tasti Maiusc o Ctrl per selezionare contemporaneamente più pozzetti. Quando la rappresentazione digitale della piastra rispecchia esattamente la piastra fisica, premere OK in basso a destra nel menu.

Nel nuovo menu che appare in alto nello schema della piastra, sotto il campo Modello selezionare Salva come, quindi assegnare un nome e salvare la piastra. A sinistra dello schermo, fare clic su Esegui e selezionare il Set di coloranti appropriato nella finestra popup Opzioni di esecuzione. La raccolta dei dati verrà avviata e visualizzata in tempo reale nel software.

Quando la lettura è terminata e appare una finestra con la scritta Run Complete, fare clic su OK. Controllare la separazione tra le goccioline positive e negative. Assicurarsi che i segnali fluorescenti di tutte le goccioline nei pozzetti NTC siano prossimi al valore di baseline. Fare clic sul pulsante denominato Events.

In basso, fare clic sulla casella denominata Singola e, a destra dell'istogramma mostrato, fare clic sulla casella denominata Totale per visualizzare il numero totale di microgocce accettate per pozzetto. Escludere tutti i pozzetti contenenti meno di 10.000 microgocce tenendo premuto il tasto di controllo e facendo clic sui pozzetti da escludere. Fare clic sul pulsante indicato come Ampiezza 1D per impostare la soglia fluorescente a circa una deviazione standard delle microgocce negative nei pozzetti NTC per entrambe le sequenze bersaglio.

All'estrema sinistra dello schermo, sotto Auto Analizza che mostra due pulsanti di soglia, scegliere l'icona a destra con una linea orizzontale rosa solida al centro. Fare clic sulla casella a sinistra di Imposta soglia sotto ciascuno dei grafici di ampiezza ed inserire i corrispondenti valori di soglia della fluorescenza. Le concentrazioni target in copie per microlitro di reazione vengono quindi calcolate automaticamente.

Esportare i risultati in un file CSV cliccando sul pulsante Esporta nell'angolo superiore sinistro della schermata 1D Amplitude. Nel file CSV, moltiplicare la concentrazione del target esportata per quattro per convertirla da copie di target per microlitro di reazione a copie di target per microlitro di DNA stampo. Questa figura confronta i formati duplex e simplex del Saggio di PCR Digitale.

I pannelli sinistro e destro mostrano rispettivamente la quantificazione di Enterococcus e di HF183, con i corrispondenti coefficienti di correlazione tra i risultati ottenuti con metodo duplex e simplex. Le linee continue indicano le linee di regressione, mentre l'ombreggiatura grigia indica gli errori standard corrispondenti. I diversi tipi di campioni sono indicati dai simboli.

I risultati sono altamente coerenti e spesso indistinguibili, sia che Enterococcus e HF183 vengano misurati contemporaneamente in una singola reazione oppure separatamente in due reazioni. Il saggio di PCR digitale può inoltre tollerare inibitori a concentrazioni da uno a due ordini di grandezza superiori rispetto ai corrispettivi saggi qPCR. Questa figura mostra la quantificazione mediante qPCR e PCR digitale del marcatore HF183 in DNA di acque reflue purificate, arricchito con concentrazioni crescenti di acido umico, che inibisce la PCR.

La quantificazione attesa di HF183 in assenza di inibitori è definita come un intervallo di confidenza del 95% compreso tra le due linee tratteggiate orizzontali. La PCR digitale, indicata dai triangoli, continua a fornire una quantificazione accurata fino a una concentrazione di acido umico di 15 nanogrammi per microlitro di reazione, mentre la qPCR, indicata dalle croci, inizia a sottostimare a un nanogrammo per microlitro e risulta completamente inibita a cinque nanogrammi per microlitro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire questo saggio entero di HF183 con Duplex Droplet Digital PCR o altri saggi simili utilizzando diversi primer e sonde.

Da quando è stato sviluppato questo Saggio in Duplex, pubblicato su Water Research nel 2015, abbiamo sviluppato e validato una serie di altri Saggi di PCR Digitale che mirano a batteri indicatori fecali generici, marcatori di tracciamento microbico e patogeni veicolati dall'acqua. Questi saggi forniscono una quantificazione diretta e priva di bias dei loro bersagli e stanno diventando alternative utili ai saggi qPCR nel campo dei test sulla qualità dell'acqua.