Name: Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del Enterococcus spp. E lumano fecale associata HF183 Marker in Waters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Scopri il saggio PCR digitale duplex per quantificare simultaneamente Enterococcus spp. e il marcatore HF183 nelle acque ricreative. Questo metodo elimina le curve standard e riduce i bias per un monitoraggio accurato della qualità idrica.

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1. test di mescole <ol><li> Fare le concentrazioni di 100 micromol / L stock per tutti i primer in acqua grado molecolare e sonde a TE pH 8 tampone [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. Nota: Sonde per i due obiettivi sono fluorescente con diversi fluorofori 7 come indicato nella lista dei materiali / attrezzature. </li><li> Preparare master mix mescolando, per reazione prevista, 12 ml digitale mix PCR (2x magazzino, vedere elenco dei materiali / attrezzature), 0.216 ml ciascuno in avanti e di fondo, 0,06 ml ciascuna sonda fluorescente inversa, e 5.016 ml di acqua priva di nucleasi (concentrazione finale : 900 nM ogni primer, 250 nm ogni sonda). Pipettare su e giù almeno 10 volte per mescolare tenendo attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria nella soluzione. </li><li> Pipettare 18 ml Master Mix (dal punto 1.2) in un normale tubo di PCR o piatto, mescolando in DNA stampo 6 ml (estratto come descritto Precesly 13) per rendere la miscela test per la generazione di goccioline. Se si esegue i campioni in duplicato, pipetta 36 ml di master mix e 12 stampo di DNA microlitri in tutti i pozzetti. Lasciare le corrispondenti pozzi replicati vuoto sul piatto. Includere controlli positivi (vedi elenco dei materiali / attrezzature) ei controlli NTC (NTC) (cioè con acqua di grado molecolare utilizzato come modello). Nota: Controllo positivo è necessario assicurare il test viene eseguito correttamente e il NTC è necessaria per garantire che non vi è alcuna contaminazione all&#39;interno della piastra e per impostare la linea di base fluorescente successiva analisi dei dati. Prima dell&#39;uso si consiglia di utilizzare entrambi i campioni di DNA non diluiti e diluito. </li></ol> 2. Generation Droplet e configurazione Piastra PCR <ol><li> Mescolare le miscele di analisi pipettando su verso il basso di circa 15 volte con una pipetta multicanale. Assicurarsi che la punta della pipetta rimane all&#39;interno del liquido per evitare di fare le bolle in eccesso all&#39;interno della miscela. </li><li> inscartuccia ert 1 (contenente 8 pozzetti) in un contenitore della cartuccia bianca e fare clic sul supporto della cartuccia chiusa. Cartuccia 1 è ora saldamente in posizione e non può essere staccato dal suo supporto durante la generazione di goccioline. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire delicatamente 20 l di miscela test in posizione centrale della cartuccia indicata &#39;campione&#39; senza introdurre bolle d&#39;aria. </li><li> Pipettare in 70 ml di olio di generazione gocciolina al lato sinistro della cartuccia (contrassegnati &#39;olio&#39;). </li><li> Cartuccia copertura con una guarnizione assicurandosi che la guarnizione sia piana e tenuto in modo uniforme dal 4 zecche verso il bordo della cartuccia. Premere il tasto verde illuminato sul generatore droplet per aprire e inserire la cartuccia. Premere il tasto verde-illuminato di nuovo per chiudere il generatore. Nota: Una volta che la porta si chiude, il pulsante non è attivo, la porta non può essere riaperta e la generazione di goccioline inizia immediatamente proseguendo per circa 1 minuto. </li><li> Se facendo più di 8 reazioni, posto cartuccia 2 in una secondaportacartuccia bianco e preparare nella stessa maniera come cartuccia 1 mentre la generazione delle goccioline è in corso di risparmiare del tempo di programmazione. </li><li> Aprire la porta generatore gocciolina quando il pulsante dim illuminato diventa verde che indica il completamento della generazione di goccioline. Rimuovere il supporto bianco cartuccia contenente la cartuccia 1, messo da parte, e la cartuccia posto 2 sul generatore di goccia. </li><li> Rimuovere la guarnizione dalla cartuccia 1 e scartare. trasferire delicatamente il volume totale (circa 40 ml) di goccioline generate dalla terza colonna della cartuccia (contrassegnata &#39;Goccioline&#39;) su una piastra PCR finale (mantenuta a temperatura ambiente) per cicli termici. Nota: Non deselezionare il supporto della cartuccia bianca come l&#39;azione potrebbe rompersi le goccioline appena generato; aperto solo il supporto della cartuccia dopo le goccioline sono stati trasferiti al piatto finale. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,7 per i campioni supplementari. </li><li> Quando tutte le goccioline sono nella piastra finale PCR, posizionare un perforabilepellicola di copertura sulla parte superiore della piastra e posizionarlo su un foglio sigillante. Impostare il sigillante a 180 ° C, premere &#39;Play&#39; sul sigillante e lasciare tenuta per 10 sec. </li></ol> 3. ciclismo termica e Reading Droplet <ol><li> Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore, uno compatibile con la piastra PCR finale utilizzato nella fase 2.7, e una velocità di rampa di temperatura di 2,0 ° C / sec. </li><li> Eseguire programma termica come segue: 10 min a 95 ° C, seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 ° C e 60 secondi a 60 ° C, seguito da 10 min stretta a 98 ° C (opzionale: stretta finale a 4 o 15 ° C). </li><li> Al termine del ciclismo, trasferire la piastra ad un lettore di goccioline per la misurazione automatica della fluorescenza in ciascuna goccia in ciascun pozzetto. In alternativa, conservare la piastra a 4 ° C per un massimo di 3 giorni prima della lettura delle gocce. Assicurarsi che le goccioline siano a temperatura ambiente prima di procedere con la lettura. <ol><li> Aprire il software che accompagna per impostare la lettura delle gocce. Inil menu di default &#39;Setup&#39; contiene uno schema di una piastra da 96 pozzetti vuoto, fare doppio clic sul pozzetto A1 per aprire il menu che contiene tre sezioni: &#39;Campione,&#39; &#39;Saggio 1&#39; e &#39;Assay 2.&#39; </li><li> Nella sezione &#39;Sample&#39; digitare l&#39;ID campione nella casella &#39;Nome&#39; e premere Invio o controllare la casella a destra segnato &#39;Apply&#39;. Quindi, fai clic sul menu a discesa con l&#39;etichetta &#39;esperimento&#39; e scegliere &#39;Red&#39; (rilevamento di un evento raro) e premere Invio. </li><li> Spostare alla sezione indicata &#39;test 1.&#39; Nella sezione &#39;Nome&#39; compilare il test (ad esempio Enterococcus) e premere Invio. Nella casella sotto l&#39;etichetta &#39;Tipo&#39; fai clic sul menu a tendina e selezionare l &#39;Channel 1 Unknown&#39; e premere Invio. </li><li> Spostare alla sezione indicata &#39;Assay 2.&#39; Nella sezione &#39;Nome&#39; compilare il test (ad esempio, HF183) e premere Invio. Nella casella sotto l&#39;etichetta &#39;Tipo&#39; fai clic sul menu a discesa unad Scegliere &#39;Channel 2 Unknown&#39; e premere Invio. Tutte le informazioni da Piazza 3.3.2 a 3.3.4 è ora presente in ben A1. </li><li> Nome tutti i pozzetti successivi contenenti goccioline. Per risparmiare tempo di installazione totale, fare clic su &#39;Shift&#39; o &#39;Ctrl&#39;, di scegliere pozzi multipli contemporaneamente. </li><li> Quando la rappresentazione digitale della piastra rispecchia la piastra fisica, premere &#39;OK&#39; in basso a destra del menu. Nel nuovo menu che appare nella parte superiore dello schema piatto, sotto la sezione &#39;Modello&#39; scegliere &#39;Salva con nome&#39; e il nome e salvare la piastra. </li><li> A sinistra dello schermo, fare clic su &#39;Esegui&#39; e selezionare appropriate Dye Set nella finestra pop-out &quot;Opzioni di esecuzione&quot;. La raccolta dei dati inizia e viene visualizzata in tempo reale nel software. </li></ol></li></ol> 4. Analisi dei dati e reporting <ol><li> Quando il lettore è finito e un dialogo che affermando &#39;corsa completa&#39;, cliccare su &#39;OK&#39;. Nota: La morbidaware visualizza il file di dati finale nella sezione &#39;Analisi&#39; del software. In questa prospettiva, il software ha tutti i pozzetti della piastra selezionati e le impostazioni predefinite per tracciare i dati del &#39;2D Amplitude&#39;. </li><li> Controllare la separazione tra le goccioline positivi e negativi. Assicurarsi che la fluorescenza in tutte le goccioline nei pozzetti NTC sono vicino al basale. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;Eventi&#39;. A destra dell&#39;istogramma presentato clic sulla casella denominata &#39;Total&#39; e la casella denominata &quot;single&quot; in basso per visualizzare il numero totale di gocce accettati per pozzetto. Escludere i pozzetti contenenti &lt;10.000 goccioline 7 tenendo premuto il tasto Ctrl e facendo clic sul bene (s) da escludere. </li><li> Fare clic sul pulsante indicato come &#39;1D Amplitude&#39; per impostare la soglia di fluorescenza a circa una deviazione standard (500-700 unità di fluorescenza) sopra le goccioline negativi nei pozzi NTC per entrambi gli obiettivi. Al molto a sinistra dello schermo unof the &#39;Auto Analyze&#39; che mostra due pulsanti di soglia, scegliere l&#39;icona a destra che ha una linea orizzontale di colore rosa solido che l&#39;attraversa. </li><li> Fare clic nella casella a sinistra di &#39;soglia impostata&#39; sotto ciascuno dei grafici di ampiezza e di inserire i valori di soglia di fluorescenza appropriati. Le concentrazioni target di copia per reazione microlitri vengono calcolati automaticamente. Nota: Le soglie non devono essere identiche per i diversi target. </li><li> Esportare i risultati in un file .csv facendo clic sul pulsante &#39;Export&#39; nell&#39;angolo in alto a sinistra dello schermo 1D ampiezza. Nel file .csv, moltiplicare la concentrazione target esportati da 4 per la conversione da copia del bersaglio (23S gene di Enterococcus spp. O il marcatore HF183) per reazione microlitri per copiare del target per microlitri DNA stampo. </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, la miscelazione delle miscele test può essere difficile, perché il master mix è più viscoso rispetto ai tradizionali Master Mix qPCR. Semplice vortex può portare a scarsa miscelazione, che a sua volta porta alla distribuzione non uniforme dei modelli di DNA nelle miscele di saggio e successivamente nelle goccioline. La tecnica di miscelazione-by-pipettaggio descritto nel protocollo deve essere seguita per garantire accurata quantificazione dPCR. In secondo ...

Metodi quantitativi PCR (qPCR) sono stati ampiamente utilizzati per il monitoraggio della qualità delle acque di ricreazione e microbiche applicazioni di tracciamento fonte perché sono più veloci, più flessibili e specifiche rispetto ai metodi di coltura a base di tradizionali. Di conseguenza, qPCR è consigliato per il raggiungimento di risultati di monitoraggio delle acque rapidi per gli indicatori fecali generali come Enterococcus spp. Nelle riviste USEPA ACQUATICI criteri di qualità 1. Molti saggi qPCR sono stati sviluppati e validati per identificare le fonti di contaminazione fecale nelle acque ambientali 2. Tra questi, i saggi marcatori HF183 sono tra le più frequentemente utilizzate per identificare la contaminazione fecale umana associata 3. Tuttavia, i risultati qPCR possono spesso essere prevenuto perché si basano su curve standard per la quantificazione. qPCR quantifica le concentrazioni sconosciute di bersaglio nei campioni interpolando il loro ciclo di quantificazione (CQ) da una stanCurva dard che descrive una relazione lineare tra Cq e quantità logaritmica di una serie di norme in serie diluiti. La mancanza di materiale di riferimento standard affidabile e coerente può quindi notevolmente BiAS risultati qPCR. Gli studi hanno dimostrato che i risultati qPCR differivano di circa mezzo di registro utilizzando standard di diversi fornitori di 4 e 2 volte con diversi lotti di standard dello stesso fornitore 5. La tecnologia digitale PCR (dPCR) quantifica un campione sconosciuto contando la frequenza di positivi in un gran numero di PCR in miniatura che vengono generati dal partizionamento di un qPCR massa in migliaia o milioni di nanolitro uniforme o reazioni picolitri 6. E &#39;indicato come gocciolina PCR digitali (cioè, questo articolo) o camera PCR digitali, rispettivamente se le partizioni sono acqua-in-olio gocce (ovvero questo articolo) o piccole camere su un chip. Una concentrazione più elevata del campione comporterà presenza di DNA bersaglio(PCR quindi positivo) in una proporzione maggiore di partizioni, una relazione approssimata dalla distribuzione di Poisson. Come tali, i risultati binari (PCR positiva o negativa) sono registrate e la frequenza delle goccioline positivi viene utilizzato per calcolare le concentrazioni dei campioni sconosciuti direttamente tramite Poisson approssimazione, eliminando la necessità di una curva standard come in qPCR. Questa natura binaria di quantificazione PCR digitale offre vantaggi supplementari rispetto qPCR 7. Poiché l&#39;amplificazione ritardato può ancora produrre un PCR positivo, dPCR quantificazione è più robusto contro l&#39;inibizione che riduce l&#39;efficienza di amplificazione. Analogamente, dPCR quantificazione non è influenzato dalla variabilità dei valori Cq come qPCR, portando ad una maggiore precisione di dPCR rispetto al qPCR 8-10. Inoltre, il processo di partizionamento assicura una piccola quantità di DNA bersaglio presente in ogni gocciolina, minimizzando efficace concorrenza substrato (durante amplification di differenti target di DNA) che sono ostacoli comuni al raggiungimento fronte-retro (cioè un saggio misura contemporaneamente due obiettivi di DNA) in qPCR. Come tale, eseguita in duplex o simplex (cioè un target viene misurato in un singolo test) dPCR produce quantificazione quasi indistinguibile di entrambi gli obiettivi 7,11. L&#39;obiettivo del test PCR digitale (EntHF183 dPCR) descritto in questo articolo è quello di ottenere una quantificazione diretta simultanea dell&#39;indicatore fecale generale Enterococcus spp. E il marcatore HF183 umano-fecale associata con una migliore precisione, la riproducibilità e la robustezza contro l&#39;inibizione rispetto al suo qPCR controparti. Questo test è stato utilizzato con successo per quantificare la contaminazione fecale in acqua dolce ambientale, acqua marina, e vario materiale fecale 7, ma può anche essere applicato a qualsiasi altro tipo di acque e acque di scarico. Questo test rappresenta una grande promessa per l&#39;analisi di sedimenti o suoli a causa di essas elevata tolleranza alla inibizione, ma ulteriori test è necessario a causa della complessità di inibitore mescola in questi tipi di campioni.

<table><tbody><tr><td>Microprovette a basso legame</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>Per la conservazione di reagenti, campioni/produzione di miscele master</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE tampone pH 8</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>Hardshell Piastra a 96 pozzetti</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>Per la miscelazione master iniziale e l'inoculazione del campione</td></tr><tr><td>Film sigillante</td> <td>in alluminioBioRad</td><td>359-0133</td><td>Per sigillare la piastra del campione</td></tr><tr><td>Generatore di gocce</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>Olio per la generazione di goccioline</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Supporto per cartuccia</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; l. puntali per pipette</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>Per il trasferimento di campioni/master mix a cartidge</td></tr><tr><td>200 &#956; l puntali per pipette</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>Per il trasferimento di goccioline alla piastra finale Twin.Tec</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>Per il ciclo termico e la lettura delle goccioline finali</td></tr><tr><td>Lamina termosaldante perforabile</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>Per sigillare la piastra Twin.Tec prima del ciclo termico</td></tr><tr><td>PX1 Sigillante per piastre PCR BioRad</td><td></td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Thermalcycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96 e C1000</td><td>È necessario solo il termociclatore, nessuna ottica Lettore di</td></tr><tr><td>gocce QX100</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>Olio per lettore di gocce</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>PCR a gocce Supermix&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>i.e. la miscela PCR digitale nel software manoscritto</td></tr><tr><td>QuantaSoft (v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>Per la visualizzazione, l'analisi e l'esportazione dei dati ddPCR</td></tr><tr><td>Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>È possibile utilizzare un fornitore alternativo</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATT</td><td>È possibile utilizzare un fornitore alternativo</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>È possibile utilizzare un fornitore alternativo, ma il floroforo deve essere FAM</td></tr><tr><td>HF183 Forward Primer ( HF183-1)</td><td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>È possibile utilizzare un fornitore alternativo</td></tr><tr><td>HF183 Reverse Primer (BthetR1)</td><td>Operon</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGT</td><td>È possibile utilizzare un fornitore alternativo</td></tr><tr><td>HF183 Probe (BthetP1)</td><td>Operon</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>È possibile utilizzare un fornitore alternativo, ma il floroforo deve essere HEX (se si utilizza VIC, è necessario scegliere la compensazione matric appropriata. &nbsp;</td></tr><tr><td>Controllo</td><td></td><td></td> positivo <td>Miscela di DNA genomico E. faecalis e plasmide standard HF183 (ordinato da IDT). Per i metodi dettagliati nella coltura di E. faecalis e le sequenze del plasmide HF183 ordinato, si veda Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Gli standard del DNA Enterococcus disponibili in commercio (ATCC 29212Q-FZ) possono essere utilizzati anche nel controllo positivo al posto del DNA genomico E. faecalis preparato in laboratorio.</td></tr></tbody></table>

un test pcr duplex digitale per simultanea quantificazione del<em&gt; enterococcus spp.</em&gt; e l&#39;umano fecale associata hf183 marker in waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Questo manoscritto descrive una PCR digitale duplex (EntHF183 dPCR) per la quantificazione simultanea di Enterococcus spp. E il marcatore HF183 fecale-associata umana. Il EntHF183 duplex dPCR (denominato come EntHF183 dPCR esso contenute) saggio utilizza gli stessi primer e sonda sequenze come le sue singole controparti pubblicati PCR quantitativa (qPCR). Allo stesso modo, le stesse procedure di filtrazione dell&#39;acqua e di estrazione del DNA come eseguita prima di qPCR sono seguiti prima di eseguire dPCR. Tuttavia, il test dPCR duplex ha diversi vantaggi rispetto ai saggi qPCR. Più importante, il dosaggio dPCR elimina la necessità per l&#39;esecuzione di una curva standard e, quindi, la distorsione e variabilità associata, dalla quantificazione diretta dei suoi obiettivi. Inoltre, mentre la stampa duplex (ovvero la quantificazione simultanea) Enterococcus e HF183 in qPCR spesso porta a grave sottovalutazione del target meno abbondanti in un campione, dPCR fornisce la quantificazione coerente di entrambi gli obiettivi, stuzzicarela quantificato singolarmente o contemporaneamente nella stessa reazione. Il dosaggio dPCR è anche in grado di tollerare concentrazioni di inibitori di PCR che sono uno o due ordini di grandezza superiori a quelle tollerate dal qPCR. Questi vantaggi rendono il saggio EntHF183 dPCR particolarmente interessante perché fornisce contemporaneamente informazioni precise e ripetibili sia contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ambientali senza la necessità di eseguire due saggi qPCR separati. Nonostante i suoi vantaggi rispetto qPCR, il limite superiore quantificazione del test dPCR con strumentazione attualmente disponibile è di circa quattro ordini di grandezza inferiore a quella ottenibile con qPCR. Di conseguenza, la diluizione è necessaria per la misura di concentrazioni elevate di organismi bersaglio come quelli tipicamente osservati dopo fuoriuscite di liquami.

Una buona corsa EntHF183 duplex dPCR dovrebbe risultare in numero relativamente elevato di goccioline accettati (circa 10,000-17,000) e differenza relativamente grande (circa 5.000) tra i valori di fluorescenza per le goccioline negativi e positivi 7. Insolitamente basso numero di goccioline probabilmente indica problemi nel processo di generazione delle gocce, e un taglio di 10.000 goccioline è suggerito basato su dati empirici dal sistema dPCR gocciolina ut...

Questo manoscritto descrive un saggio PCR duplex digitale che può essere utilizzato per quantificare contemporaneamente Enterococcus spp. E marcatori genetici HF183 come indicatori di contaminazione fecale generale e umana associati nelle acque ricreative.

Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; E l&#39;umano fecale associata HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

L'obiettivo generale di questo saggio di PCR digitale duplex è quantificare simultaneamente la contaminazione fecale generica e quella associata all'uomo nelle acque. Questo saggio può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel monitoraggio della qualità delle acque ricreative, come ad esempio: quanta indicatore fecale generica, ovvero Enterococcus, e, cosa più importante, quanta marcatura HF183 associata alle feci umane è presente nelle acque?Il vantaggio principale di questo saggio è che consente la quantificazione di due bersagli in una singola reazione e, rispetto alla qPCR, elimina la necessità di eseguire curve standard, riducendo così il bias e la variabilità associati. A illustrare la procedura sarà Meredith Raith, la nostra Tecnica Senior di Ricerca. Per iniziare questa procedura, preparare innanzitutto delle concentrazioni stock di 100 micromoli per litro di tutti i primer in acqua di grado molecolare e delle sonde in tampone TEPH 8, come descritto nel testo del protocollo.Successivamente, preparare un Master Mix mescolando le quantità appropriate di mix per Digital PCR, primer forward e reverse, la sonda fluorescente e acqua priva di nucleasi. Pipettare su e gi&ugrave;

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Descriviamo un metodo multiplex per la rilevazione di microrganismi in un campione con oligonucleotide ad accoppiamento perline fluorescenti. Amplificato da tutti gli organismi in un campione è ibridato ad un pannello di sonda-perline accoppiate. Uno strumento Luminex o Bio-Plex è usato per interrogare ogni perla per il tipo di perline e segnale di ibridazione.

Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Questo protocollo descrive l'uso di un flusso tangenziale a fibre cave sistema di concentrazione del campione di ultrafiltrazione ed una dissociazione calore come procedura alternativa per la rilevazione di...

Un metodo modificato EPA 1623 che utilizza flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione e di calore passi dissociazione per rilevare Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia spp.</em

In questo video, dimostriamo la tecnica della PCR digitale duplex (ddPCR), una modifica della tradizionale tecnica PCR utile per rilevare contemporaneamente due diversi marcatori genetici. Una singola reazione PCR viene suddivisa in goccioline emulsionate di dimensioni nanolitrometriche che vengono amplificate in modo indipendente e il rilevamento di segnali di amplificazione della fluorescenza di colore diverso dalla frazione di goccioline viene utilizzato per calcolare la concentrazione...

PCR digitale duplex per la quantificazione simultanea di doppi marcatori genetici

Un test qPCR è stato sviluppato per il rilevamento di Escherichia coli O157: H7 mira un marcatore genetico unico, Z3276. La qPCR è stato combinato con propidio monoazide (PMA) Trattamento per il rilevamento di cellule vive. Questo protocollo è stato modificato e adattato ad un formato piastra a 96 pozzetti per maneggevolezza e coerente di numerosi campioni...

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

Viene presentato qui un protocollo che coinvolge la concentrazione integrata, l'arricchimento e il rilevamento colorimetrico end-point di agenti patogeni di origine alimentare in grandi volumi di acqua agricola.  L'acqua viene filtrata attraverso tamponi di Moore modificati (MMS), arricchiti con terreni selettivi o non selettivi, e il rilevamento viene eseguito utilizzando dispositivi analitici a base di carta (μPAD) incorporati con substrati colorimetrici indicativi dei batteri.

Colorimetrico carta a base di rilevamento di<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp., E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Da grandi volumi di acqua agricolo

Qui presentiamo una procedura per quantificare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa. Il recupero medio del virus dalle acque sotterranee con questa procedura standardizzata del metodo EPA 1615 è stato del 20% per il poliovirus e del 30% per il norovirus murino.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

I test del DNA ambientale richiedono una progettazione, un test, un'ottimizzazione e una convalida rigorosi prima che possa iniziare la raccolta dei dati sul campo. Qui, presentiamo un protocollo per portare gli utenti attraverso ogni fase della progettazione di un saggio qPCR specifico per specie e basato su sonda per il rilevamento e la quantificazione di un DNA di specie bersaglio da campioni ambientali.

Sviluppo e test di test quantitativi PCR specifici per specie per applicazioni del DNA ambientale

Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato su un chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un metodo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio.

Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare

Scopri il saggio PCR digitale duplex per quantificare simultaneamente Enterococcus spp. e il marcatore HF183 nelle acque ricreative. Questo metodo elimina le curve standard e riduce i bias per un monitoraggio accurato della qualità idrica.

Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del Enterococcus spp. E lumano fecale associata HF183 Marker in Waters (Video) | JoVE Journal

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