Un Test PCR duplex digitale per simultanea quantificazione del Enterococcus spp. E l'umano fecale associata HF183 Marker in Waters

L'obiettivo generale di questo test di PCR digitale duplex è quello di quantificare simultaneamente la contaminazione fecale generale e umana associata nelle acque. Questo test può aiutare a rispondere a domande chiave nel monitoraggio della qualità dell'acqua ricreativa, come ad esempio la quantità di indicatore fecale generale, ad esempio l'enterococco e, soprattutto, il marcatore HF183 associato alle feci umane nelle acque.

Il vantaggio principale di questo test è che quantifica due bersagli in un'unica reazione e, rispetto alla qPCR, elimina la necessità di eseguire curve standard e quindi la distorsione e la variabilità associate. A dimostrare la procedura sarà Meredith Raith, il nostro tecnico di ricerca senior. Per iniziare questa procedura, preparare prima concentrazioni di 100 micromoli per litro per tutti i primer in acqua di grado molecolare e le sonde in tampone TEPH 8 come descritto nel testo del protocollo.

Successivamente, preparare una Master Mix mescolando quantità appropriate di miscela Digital PCR, primer diretti e inversi, la sonda fluorescente e l'acqua priva di nucleasi. Pipettare su e giù almeno 10 volte per miscelare, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione. Poiché la dPCR Master Mix è più viscosa della qPCR Master Mix convenzionale, è necessario utilizzare la tecnica della miscelazione mediante pipettaggio per creare una soluzione omogenea.

Ciò consente un'accurata quantificazione della dPCR a valle. Per preparare la miscela di analisi per la generazione di goccioline per campioni in esecuzione in duplicato, pipettare 36 microlitri di Master Mix in una normale piastra PCR. A ciascuna delle Master Mix da 36 microlitri, miscelare 12 microlitri di DNA stampo lasciando vuoti i pozzetti di replica corrispondenti sulla piastra.

Includere controlli positivi per garantire che il test funzioni correttamente. Non includere controlli di modello o NTC per garantire che non vi siano contaminazioni all'interno della piastra e per impostare la linea di base fluorescente in un secondo momento per l'analisi dei dati. Prima di configurare il generatore di gocce, miscelare le miscele di saggi utilizzando una pipetta multicanale per pipettare le miscele su e giù per circa 15 volte.

Assicurarsi che la punta della pipetta rimanga all'interno del liquido per evitare che si formino bolle di accesso all'interno della miscela. Quindi, inserire la cartuccia uno contenente otto pozzetti in un supporto per cartucce bianco e chiudere il supporto per cartuccia. La cartuccia uno è ora saldamente in posizione e non può essere rimossa dal supporto durante la generazione di goccioline.

Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire delicatamente 20 microlitri della miscela di saggio nella posizione centrale del campione contrassegnato con la cartuccia senza introdurre bolle d'aria. Pipettare in 70 microlitri di olio Droplet Generation sul lato sinistro della cartuccia contrassegnata con olio. Coprire la cartuccia con una guarnizione assicurandosi che la guarnizione sia piatta e tenuta uniformemente dai quattro segni di spunta verso il bordo della cartuccia.

Premere il pulsante verde sul generatore di gocce per aprire lo sportello e posizionare la cartuccia. Premere nuovamente il pulsante per chiudere il generatore. Una volta che la porta si chiude, il pulsante verde è disattivato e la porta non può essere riaperta.

La generazione di goccioline inizierà immediatamente e continuerà per circa un minuto. Mentre è in corso la generazione di gocce, posizionare la cartuccia due in un secondo supporto bianco e prepararla allo stesso modo della cartuccia uno. Al termine della generazione di droplet, il pulsante scarsamente illuminato diventa verde.

Aprire lo sportello del generatore di gocce, rimuovere il supporto della cartuccia bianco contenente la cartuccia uno e metterlo da parte. Posizionare la cartuccia due nel generatore di gocce. Rimuovere la guarnizione dalla cartuccia uno e gettarla.

Non sganciare il supporto della cartuccia bianco poiché l'azione potrebbe rompere le goccioline appena generate. Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 40 microlitri, inserire i puntali nella terza colonna della cartuccia con gocce contrassegnate con un angolo di 45 gradi e pipettare lentamente tutte le goccioline. Trasferirli nella piastra PCR finale posizionando la punta della pipetta contro la parete del pozzetto a circa metà ed espellendo lentamente le goccioline.

Allo stesso modo, al termine della generazione delle goccioline per la cartuccia due, rimuovere la guarnizione dalla cartuccia due e trasferire le goccioline generate sulla piastra PCR finale. Posizionare un coperchio di alluminio perforabile sopra la piastra e posizionarlo su una sigillante per piastre. Impostare il sigillante a 180 gradi Celsius, premere play sul sigillante e sigillare per 10 secondi.

Per iniziare questa procedura, posizionare la piastra PCR finale sigillata nel termociclatore. Utilizzare un termociclatore compatibile con la piastra PCR finale e con una velocità di rampa della temperatura di due gradi Celsius al secondo. Eseguire il seguente programma termico: dieci minuti a 95 gradi Celsius, seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 gradi Celsius e 60 secondi a 60 gradi Celsius, seguiti da una pausa di dieci minuti a 98 gradi Celsius.

Al termine del ciclo, trasferire la piastra in un lettore di gocce per la misurazione automatica delle fluorescenze in ciascuna gocciolina in ciascun pozzetto. Assicurarsi che le goccioline siano a temperatura ambiente prima di procedere con la lettura delle goccioline. Inizia aprendo il software in dotazione per impostare la lettura delle gocce.

Nel menu di configurazione predefinito contenente uno schema di una piastra vuota da 96 pozzetti, fare doppio clic sul pozzetto A1 per aprire il menu contenente tre sezioni, Campione, Saggio 1 e Saggio 2. Nella sezione Esempio, digita l'ID campione nella casella Nome e seleziona la casella a destra contrassegnata con Applica. Quindi, fai clic sul menu a discesa con l'etichetta esperimento, scegli ROSSO per il rilevamento di eventi rari e fai clic su Invio.

Passare alla sezione indicata con il saggio 1. Nella sezione Nome, compila il test e fai clic su Invio. Nella casella sottostante con l'etichetta Tipo, fare clic sul menu a discesa, scegliere Canale 1 Sconosciuto e fare clic su Invio.

Passare alla sezione indicata con il saggio 2. Nella sezione Nome, compila il test e fai clic su Invio. Nella casella sottostante con l'etichetta Tipo, fare clic sul menu a discesa, scegliere Canale 2 Sconosciuto e fare clic su Invio.

Tutte le informazioni delle fasi precedenti sono ora presenti nel pozzetto A1.Name tutti i pozzetti successivi contenenti goccioline. Per risparmiare il tempo totale di configurazione, fare clic su Maiusc o Ctrl per scegliere più pozzetti contemporaneamente. Quando la rappresentazione digitale della lastra rispecchia la lastra fisica, premere OK in basso a destra del menu.

Nel nuovo menu che appare nella parte superiore dello schema della targa, sotto il modello scegli Salva con nome e assegna un nome e salva la targa. A sinistra dello schermo, fare clic su Esegui e selezionare il set di coloranti appropriato nella finestra a comparsa Opzioni di esecuzione. La raccolta dei dati verrà avviata e visualizzata in tempo reale nel software.

Al termine del lettore e quando viene visualizzata una casella che indica Esecuzione completata, fare clic su OK. Controllare la separazione tra le goccioline positive e negative. Assicurarsi che le lampade fluorescenti in tutte le goccioline nei pozzetti NTC siano vicine alla linea di base. Fare clic sul pulsante con l'etichetta Eventi.

In basso, fai clic sulla casella denominata Singolo e, a destra dell'istogramma presentato, fai clic sulla casella denominata Totale per visualizzare il numero totale di goccioline accettate per pozzetto. Escludere tutti i pozzetti contenenti meno di 10.000 goccioline tenendo premuto il tasto Ctrl e facendo clic sui pozzetti da escludere. Fare clic sul pulsante indicato con l'ampiezza 1D per impostare la soglia fluorescente a circa una deviazione standard delle goccioline negative nei pozzetti NTC per entrambi i target.

All'estrema sinistra dello schermo, sotto l'Analizza automatica che mostra due pulsanti di soglia, scegli l'icona a destra che ha una linea orizzontale rosa continua che la attraversa. Fare clic sulla casella a sinistra di Imposta soglia sotto ciascuno dei grafici di ampiezza e inserire i valori di soglia di fluorescenza appropriati. Le concentrazioni target nella reazione copia per microlitro vengono quindi calcolate automaticamente.

Esporta i risultati in un file CSV facendo clic sul pulsante Esporta nell'angolo in alto a sinistra nella schermata Ampiezza 1D. Nel file CSV, moltiplicare per quattro la concentrazione target esportata per convertirla dalla copia della reazione target per microlitro alla copia del modello di DNA target per microlitro. Questa figura confronta i formati duplex e simplex del test PCR digitale.

I pannelli sinistro e destro visualizzano rispettivamente la quantificazione di Enterococcus e HF183 con i corrispondenti coefficienti di correlazione tra i risultati duplex e simplex. Le linee continue indicano le linee di regressione e l'ombreggiatura grigia indica gli errori standard corrispondenti. Diversi tipi di campioni sono indicati dai simboli.

I risultati sono altamente coerenti e spesso indistinguibili sia che Enterococcus e HF183 siano misurati contemporaneamente in una reazione o separatamente in due reazioni. Il test PCR digitale può anche tollerare l'inibitore a concentrazioni da uno a due ordini di grandezza superiori a quelle tollerate dalle sue controparti qPCR. Questa figura mostra la qPCR e la PCR digitale Quantificazione del marcatore HF183 nel DNA delle acque reflue pulite con aumento delle concentrazioni di acido umico che inibisce la PCR.

La quantificazione attesa di HF183 in assenza di inibitori è definita come un'interfoglia di confidenza del 95% tra le due linee tratteggiate orizzontali. La PCR digitale, indicata da triangoli, continua a fornire una quantificazione accurata fino a una concentrazione di acido umico di 15 nanogrammi per microlitro di reazione, mentre la qPCR, indicata da croci, inizia a sottostimare a un nanogrammo per microlitro e diventa completamente inibita a cinque nanogrammi per microlitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire questo test PCR digitale a gocce duplex HF183 enterale o un altro test simile utilizzando diversi primer e sonde.

Dallo sviluppo di questo test Duplex, pubblicato su Water Research nel 2015, abbiamo sviluppato e convalidato una serie di altri test PCR digitali che prendono di mira i batteri indicatori fecali generali, i marcatori di tracciamento microbico e i patogeni presenti nell'acqua. Questi saggi forniscono una quantificazione diretta e imparziale del loro target e stanno diventando utili alternative ai saggi qPCR nel campo dei test di qualità dell'acqua.