Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la concentrazione di enterovirus e norovirus nell'acqua, utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa. Ciò si ottiene mediante concentrazione terziaria di particelle virali da campioni d'acqua concentrati utilizzando l'ultrafiltrazione centrifuga. Quindi, i reagenti della curva standard vengono preparati come descritto nel protocollo.

Segue l'estrazione con acido nucleico di concentrati virali e la curva standard. Quindi l'RNA virale e le diluizioni da una a cinque e da una a venticinque volte dell'RNA vengono trascritte inversamente utilizzando primer casuali e trascrittasi inversa. Infine, l'amplificazione del cDNA virale viene effettuata utilizzando primer e sonde specifici per virus in un termociclatore in tempo reale, seguita da calcoli di copia genomica del campione basati sulla curva standard.

Il vantaggio principale del metodo EPA 1615 rispetto ad altri metodi standardizzati come l'ISO 15216 è che è progettato specificamente per i campioni d'acqua e include un test dell'enterovirus. Questo metodo può fornire ai valutatori del rischio nel campo della microbiologia ambientale i dati attuali per determinare il rischio da virus e bere nelle acque ricreative. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la standardizzazione incorporata nel metodo.

Il metodo è molto dettagliato e deve essere seguito in modo esplicito. La dimostrazione visiva del metodo è fondamentale perché anche lievi variazioni nel metodo possono causare conseguenze negative. A dimostrare la procedura oggi sono Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin, e io, Shay Fout.

Siamo tutti membri dello staff professionale del laboratorio nazionale di esposizione dell'EPA a Cincinnati, Ohio. Dopo aver preparato una curva standard secondo il protocollo di testo, preparare un concentratore centrifugo per ogni campione raccolto aggiungendo almeno 10 millilitri di 1X PBS e 2%BSA alla camera superiore del campione. Dopo l'incubazione per una notte, il lavaggio, quindi l'aggiunta dei campioni come indicato nel protocollo di testo, centrifugare ogni campione di prova in un rotore a secchio oscillante a 3000 6000 volte g e quattro gradi Celsius per venti o trenta minuti.

Una volta che il campione è stato adeguatamente concentrato e trasferito in una nuova provetta da microcentrifuga, aggiungere 15 molari di tampone fosfato di sodio per regolare il volume finale a 400 microlitri più o meno due microlitri. Per estrarre gli acidi nucleici, aggiungere 200 microlitri di tampone di estrazione per un controllo di estrazione negativo e 200 microlitri di concentrato terziario per ogni campione di prova o diluizione della curva standard per separare le provette della microcentrifuga ed estrarre l'RNA secondo le modifiche nel protocollo di testo delle istruzioni del produttore del kit di estrazione. Dopo la preparazione dei primer e delle sonde come indicato nel protocollo, preparare le miscele master di trascrizione inversa uno e due in una camera bianca, come mostrato qui.

Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 16,5 microlitri di RT master mix one nei pozzetti di ciascuna piastra PCR. Successivamente, con il tampone di eluizione del kit di estrazione dell'acido nucleico contenente 400 unità per millilitro di inibitore dell'RNAsi, diluire il campo scongelato e la matrice del campione fortificata in laboratorio o i campioni LSFM da uno a cinque e da uno a venticinque. Trasferire 6,7 microlitri di acidi nucleici da ogni campione di prova, controllo e curva standard in pozzetti per piastre PCR separati utilizzando pozzetti triplicati per campioni di test e controlli e pozzetti duplicati per curve standard.

Aggiungere 6,7 microlitri di tampone di eluizione in pozzetti NTC o senza controllo del modello. Includere da due a otto NTC per piastra RT, utilizzandone due per il primo campione e poi due o più per ogni quarto campione aggiuntivo, distribuendo i controlli negativi su tutta la piastra. Utilizzare il sigillante per piastre resistente al calore per sigillare la piastra PCR, assicurandosi che ogni pozzetto sia ben sigillato.

Quindi, mescolare i campioni per cinque-dieci secondi prima di centrifugare brevemente a una dose maggiore o uguale a 500 volte g. In un termociclatore, incubare la piastra a 99 gradi Celsius per quattro minuti. Portare la piastra a quattro gradi Celsius e poi centrifugare brevemente una seconda volta.

Quindi, rimuovere con cautela il sigillo della piastra e aggiungere 16,8 microlitri di RT master mix due a ciascun pozzetto. Dopo aver sigillato la piastra e aver brevemente mescolato e centrifugato, posizionare la piastra nel termociclatore e farla funzionare a 25 gradi Celsius per 15 minuti, seguiti da 42 gradi Celsius per 60 minuti, 99 gradi Celsius a cinque minuti e, infine, mantenere a 4 gradi Celsius per un massimo di otto ore o conservare i campioni a 70 gradi Celsius per un periodo più lungo. In una camera bianca, preparare le master mix PCR quantitative utilizzando le guide per enterovirus, norovirus genogruppo uno, novovirus genogruppo due ed epatite G.Mescolare ciascuna miscela master e centrifugare brevemente.

Quindi, come mostrato in questo esempio, aggiungere 14 microlitri delle miscele master PCR ai pozzetti appropriati di una piastra di reazione ottica etichettata utilizzando piastre separate per ciascun test qPCR. Erogare sei microlitri di cDNA appropriato nei pozzetti appropriati. Quindi mescolare i campioni e centrifugare brevemente.

Configurare il software del termociclatore come descritto nel protocollo ed eseguire il test qPCR per l'epatite G sulla matrice di campioni fortificati sul campo non diluiti e diluiti e sui campioni fortificati in laboratorio o sui campioni LFSM prima di eseguire tutti gli altri test qPCR. Confrontare il valore medio Cq di ciascun campione con il valore medio Cq dell'epatite G predeterminato per ogni nuovo lotto di reagente per l'epatite G. Utilizzare la diluizione più bassa del campione di campo o LDF che sia inferiore a un valore Cq superiore al valore medio Cq dell'epatite G per i test qPCR di enterovirus e norovirus.

Configurare il software del termociclatore PCR quantitativo secondo le istruzioni del produttore. Identificare i campioni della curva standard come standard e per ogni diluizione della curva standard, inserire i valori di copia genomica mostrati qui. Far funzionare la piastra a 95 gradi Celsius per dieci minuti, seguiti da 45 cicli di 90 gradi Celsius per 15 secondi e 60 gradi Celsius per un minuto.

Determinare se ogni curva standard soddisfa i valori accettabili indicati in questa tabella. Dopo aver calcolato la deviazione standard, la pendenza, l'R al quadrato e l'efficienza percentuale in base alle equazioni del protocollo di testo, registrare la copia genomica o i valori GC calcolati dal software del termociclatore per tutti i campioni di prova in base a curve standard che soddisfano i criteri specificati in questa tabella e i valori medi GC per ciascun campione. Determinare il GC per litro per ciascun campione di prova utilizzando la seguente equazione, dove GC è il numero medio di copie genomiche appena calcolato.

Il fattore 199 è il fattore di diluizione totale per le reazioni di volume che si sono verificate durante le concentrazioni terziarie. L'estrazione dell'RNA e la RT-qPCR sono passaggi. DF è il fattore di diluizione che compensa l'inibizione e D è il volume del campione d'acqua originale in litri.

Infine, calcolare il GC totale del bianco fortificato sul campo di laboratorio o LFB e del bianco reagente di laboratorio o dei campioni LRB moltiplicando il valore medio del GC precedentemente determinato per 199 e dividendo per 3. Nel complesso, il recupero del virus è stato determinato utilizzando campioni di acque sotterranee LFSM sul campo accoppiati da un totale di sette set di campioni recuperati da tre piani di trattamento pubblici e da un pozzo privato. I livelli di semi per i campioni LSFM erano tre milioni di MPN di sette poliovirus di tipo tre e cinque milioni di PFU di norovirus murino.

Il norovirus murino è stato utilizzato per la valutazione iniziale di laboratorio del metodo EPA 1615 perché il reagente della curva standard non era disponibile all'epoca. Per i campioni di acque sotterranee, il recupero medio del poliovirus è stato del 20% con un errore standard del 2%, mentre il recupero medio del norovirus murino è stato del 30% con un errore standard del 3%. I campioni di bianco fortificato di laboratorio o LFB e di reagenti di laboratorio o LRB sono stati misurati utilizzando acqua di reagente con e senza semi.

Il recupero dal poliovirus è stato in media del 44% con un errore standard dell'1%, mentre il recupero dal norovirus murino è stato in media del 4% con un errore standard del 5%. La curva del genogruppo due del novovirus soddisfa i criteri della curva standard con un valore R al quadrato di 9987, una deviazione standard complessiva del 14 e un'efficienza del 101%. La curva dell'enterovirus soddisfa i criteri di prestazione della curva standard con un valore R al quadrato di 9874, una deviazione standard complessiva di 58 e un'efficienza del 103%, ma ha una sensibilità circa 100 volte inferiore e quindi un limite di rilevamento più elevato rispetto alle curve del norovirus.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come concentrare e rilevare l'enterovirus e il norovirus presenti nell'acqua utilizzando la RT-qPCR. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore per campioni a bassa torbidità. Per i campioni con torbidità più elevata, possono richiedere più tempo, soprattutto nella fase di concentrazione terziaria.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante proteggere i campioni dalla contaminazione da RNAsi prima della trascrizione inversa. Non dimenticare che la PCR è una tecnica molto potente e utile. Precauzioni come la separazione delle postazioni di lavoro e l'uso di controlli adeguati sono necessarie per ridurre al minimo i risultati falsi positivi e falsi negativi.