Name: Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Impara il metodo EPA 1615 per rilevare enterovirus e norovirus in campioni d'acqua mediante RT-qPCR. Questa tecnica standardizzata utilizza ultrafiltrazione centrifuga ed estrazione di acidi nucleici per garantire risultati accurati nella valutazione della qualità idrica.

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Gli autori ringraziano il Dr. Eric Rhodes per aver preparato i cloni utilizzati nello sviluppo del reagente della curva standard, Brian McMinn per l'assistenza nell'elaborazione dei campioni, Larry Wymer per l'analisi statistica, il Dr. Mark Borchardt, Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, Marshfield, WI, per aver fornito il sierotipo 3 del poliovirus Sabin utilizzato in questo studio e il Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, per il norovirus murino. Gli autori ringraziano anche Gretchen Sullivan per l'assistenza nella preparazione dei reagenti di laboratorio, il Dr. Mohammad Karim per la propagazione dei ceppi di norovirus murino e i proprietari di pozzi privati locali e i servizi pubblici per averci permesso di raccogliere campioni d'acqua. Sebbene questo lavoro sia stato esaminato dall'EPA e approvato per la pubblicazione, potrebbe non riflettere necessariamente la politica ufficiale dell'Agenzia. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso.

Nota: utilizzare schede di monitorare tutte le fasi del protocollo; schede esempio dati sono riportati nel materiale supplementare Tabelle S2-S4. 1. Curva Preparazione standard <ol><li> Preparare uno stock di lavoro del reagente curva standard (ad esempio, Armored RNA EPA-1615) diluendo dalla concentrazione fornita dal produttore ad una concentrazione di 2,5 x 10 8 particelle / ml (2,5 x 10 8 GC / ml) utilizzando TSM tampone III. Dividere il brodo di lavoro in 250 aliquote microlitri utilizzando provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C. NOTA: vedere supplementare protocollo materiali Passo S1 per le istruzioni sulle preparare scorte di lavoro dei virus e plasmidi per l&#39;uso come reagenti curva standard alternativi. </li><li> Scongelare una o più delle stock aliquote di lavoro. Preparare cinque diluizioni seriali di 10 volte utilizzando provette da 1,5 ml microcentrifuga, dando concentrazioni di 2,5 x 10 7, 2,5 x 10 6, 2.5 x10 5, 2,5 x 10 4, e 2,5 x 10 3 GC / ml. <ol><li> Preparare la prima diluizione con l&#39;aggiunta di 25 ml di / ml di brodo di lavoro 2,5 x 10 8 GC a 225 ml di buffer di TSM III. Mescolare per 5-15 secondi utilizzando un vortex. </li><li> Preparare la diluizione successiva con l&#39;aggiunta di 25 ml di diluizione preparata al punto 1.2.1 a 225 ml di buffer di TSM III. Mescolare di nuovo e continuare un processo simile per preparare i prossimi tre diluizioni 10-fold. </li></ol></li><li> Estrarre l&#39;RNA dallo stock di lavoro curva standard e cinque diluizioni immediatamente utilizzando la procedura nella sezione 3. </li></ol> 2. Concentrazione Terziario <ol><li> Preparare un concentratore centrifugo (30.000 molecolare cutoff peso) per ciascun campione raccolto aggiungendo almeno 10 ml di PBS 1x, 0,2% di albumina di siero bovino (BSA) per camera campione superiore. Assicurarsi che la soluzione ha riempito la sottile camera di concentrazione di canali, e quindi tenere O / N a 4 ° C. <ol><li&gt; Eliminare il fluido. Risciacquare il concentratore una volta con almeno 10 ml di acqua per reagenti sterile per rimuovere l&#39;eccesso di BSA e quindi eliminare l&#39;acqua. </li></ol></li><li> Aggiungere una quantità di concentrato acqua secondari di ogni campione di prova pari a S, il saggio Volume campione in concentratori centrifughi separati. <ol><li> Calcola S con l&#39;equazione 1, <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Dove D è il volume di Campione d&#39;acqua originale dosati, TSV è il volume del campione totale e FCSV è la Finale concentrato volume del campione. Vedere materiali supplementari S2 per un esempio di calcolo del S. </li></ol></li><li> Centrifugare ogni campione sottoposto ad 3,000-6,000 xga 4 ° C in un rotore bucket oscillante per 20 - 30 min. Controllare il volume nel sottile camera di concentrazione di canali. <ol><li> Se il volume è superiore a 400 ml, centrifugare nuovamente per 20 minuti o più. Continuare centrifugazione fino a quando il campione in the camera di concentrazione canale sottile è stato ridotto a meno di 400 ml. Non rimuovere il surnatante. </li></ol></li><li> Lavare lati del concentratore centrifugo con 1 ml di soluzione sterile di fosfato di sodio 0,15 M, pH 7-7,5 per aumentare il recupero virus. Centrifugare nuovamente a 3,000-6,000 xg e 4 ° C fino a quando il campione è stato ridotto a meno di 400 microlitri. Ripetere questa fase di lavaggio una volta in più. </li><li> Usando una micropipetta 100-200 microlitri, misurare accuratamente e trasferire ciascun campione concentrato in una provetta da 1,5 ml (cioè, trasferire 200 ul alla provetta e quindi misurare il concentrato rimanente regolando la micropipetta finché il liquido rimanente può essere completamente elaborata nella punta pipetta). Aggiungere 0,15 M di fosfato di sodio, pH 7-7,5, per regolare il volume finale a 400 ± 2 microlitri. </li><li> Estrarre acido nucleico immediatamente procedendo al punto 3. Tenere i campioni concentrati che non possono essere Processid immediatamente a 4 ° C per non più di 24 ore. </li></ol> Isolamento 3. acidi nucleici <ol><li> Aggiungere 200 ml di tampone di estrazione preparato come descritto al punto 3.3 e 200 ml di concentrato terziaria da ogni campione di prova dal punto 2.5 o diluizione curva standard dal punto 1.3 per isolare etichettato 1,5 ml microprovette. Congelare rimanendo concentrati terziarie pari o inferiore a -70 ° C. Estrarre i acidi nucleici da ciascun campione secondo le istruzioni del kit del produttore estrazione degli acidi nucleici per il protocollo di rotazione per i campioni di sangue con le seguenti eccezioni. </li><li> Non aggiungere proteasi ai campioni di acqua o utilizzare il tampone di estrazione fornita con il kit estrazione degli acidi nucleici. </li><li> Preparare tampone di estrazione con carrier RNA <ol><li> Aggiungere 310 pl di tampone di diluizione carrier RNA ad una fiala contenente 310 mg di carrier RNA. Mescolare per sciogliere e poi dividere in 6 aliquote contenenti circa 50 ml. Conservare a -20° C. </li><li> Aggiungere 28 ml di scongelati carrier RNA per ml di tampone di estrazione per ottenere una concentrazione carrier RNA di 0,027 mg / mL. Utilizzare il tampone di estrazione RNA modificato vettore al posto di quella fornita con il kit di estrazione. </li></ol></li><li> Preparare una soluzione maestro di tampone di eluizione aggiungendo ribonucleasi (RNasi) Inhibitor ad una concentrazione finale di 400 unità / ml per il tampone di eluizione fornito con il kit di estrazione. <ol><li> Eluire RNA dall&#39;acido nucleico vincolante Spin Column ponendo 50 ml di tampone di eluizione con RNasi inibitore nella colonna. Attendere per 1 min, e quindi si centrifuga a 6000 xg per 1 min a RT. </li><li> Ripetere il passaggio 3.4.1 e poi rimuovere ed eliminare la colonna. </li></ol></li><li> Preparare aliquote degli estratti di RNA dal punto 3.4.2. Preparare 6 aliquote dello stock di lavoro curva standard e ogni diluizione curva standard contenente almeno 15 ml ciascuno. Preparare 4 aliquote di tutti gli altri campioni di RNA contenenti almeno22 ml ciascuno. Conservare un&#39;aliquota di ciascun campione e curva standard di controlli a 4 ° C, se possono essere elaborati mediante trascrizione inversa entro 4 ore; altrimenti, memorizzare tutti aliquote pari o inferiore a -70 ° C. </li></ol> 4. trascrizione inversa (RT) <ol><li> Preparare 100 mM soluzioni madre di ciascun primer oligonucleotide e sonda elencati nella Tabella 1 aggiungendo un volume di acqua PCR-grade ad ogni flacone utilizzando una quantità (in microlitri) pari a dieci volte il numero di nanomoli (nmol) di oligonucleotide presenti nel fiala (come indicato sull&#39;etichetta del flacone o nella scheda tecnica del produttore (ad esempio, risospendere un primer contenente 36,3 nmol in 363 ml). Mescolare per sciogliere. <ol><li> Diluire 100 micron soluzioni 1:10 con acqua PCR-grade per preparare 10 micron soluzioni di lavoro. </li></ol></li><li> Preparare RT Master Mix 1 e 2 in una camera pulita utilizzando la guida nella tabella 2. Dispensare 16,5 ml di RT MasteR Mix 1 per ogni piastra PCR bene con una pipetta multicanale. </li><li> Thaw, se bloccato, gli estratti acidi nucleici da ciascun campione di campo e di laboratorio fortificata matrice del campione (LFSM, cioè, campione di matrice acqua testa di serie). <ol><li> Diluire ciascun campo e LFSM campione 1: 5 e 1:25 in tampone di eluizione contenente 400 unità / ml di inibitore RNasi. </li><li> Thaw, se congelato, ma non diluire Lab fortificato Blank (LFB, cioè un controllo di qualità positivo con acqua distillata teste di serie), Lab reagente Bianco (LRB, cioè, un controllo negativo di qualità con acqua distillata), Performance Evaluation (PE , cioè campioni di acqua distillata seminato utilizzati per valutare le prestazioni di laboratorio prima dell&#39;inizio di uno studio), Performance Test (PT, cioè campioni di acqua di grado reagente seminato con titoli sconosciuti a un analista che vengono utilizzati per valutare le prestazioni di laboratorio durante uno studio ), NA batch di controllo di estrazione negativo, o RNA estratto dal set curva standard. </li></ol&gt; </li><li> Mettere 6.7 ml di RNA da ogni campione di prova, controllo e curva standard in pozzetti separati piastra PCR, utilizzando pozzi triplicato per i campioni di test e controlli e pozzetti duplicati per le curve standard (vedi Figura S1 per un esempio piatto RT). <ol><li> Mettere 6.7 ml di tampone di eluizione in diversi pozzetti della piastra PCR per controlli NTC (NTC). Includere 2-8 NTC per piastra RT, utilizzando due per il primo campione e quindi più di due per ogni quarto campione aggiuntivo. </li><li> Distribuire l&#39;estrazione controlli negativi e NTC tutta la piastra. </li></ol></li><li> Sigillare la piastra PCR con un piatto resistente al sigillante di calore. Mescolare i campioni per 5-10 secondi e poi centrifugare a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Incubare la piastra per 4 min a 99 ° C e poi raffreddare rapidamente a 4 ° C in un termociclatore. Centrifugare di nuovo a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Rimuovere con cautela la guarnizione della piastra e poi aggiungere 16,8 ml di RT Master Mix 2 di ogni bene. Seal piatto di nuovo con un foglio sigillante resistente al calore, seguita da miscelazione e una breve centrifugazione a ≥ 500 x g. </li><li> Porre la piastra in un termociclatore ed eseguire per 15 min a 25 ° C, seguita da 60 minuti a 42 ° C, 5 min a 99 ° C, e poi da un 4 ° ciclo C attesa. </li><li> Processo immediatamente o entro 8 ore dalla qPCR (punto 5), o conservare i campioni pari o inferiore a -70 ° C fino a che non può essere elaborato. Conservare i campioni che possono essere elaborati entro 8 ore a 4 ° C. </li></ol> 5. Real-time PCR quantitativa (qPCR) <ol><li> Determinare la media epatite valore di G Cq per ogni lotto di epatite G reagente prima di eseguire eventuali campioni di prova. <ol><li> Eseguire un test RT utilizzando 10 replicati preparato come descritto per i controlli NTC (Fase 4.1.1). Eseguire l&#39;epatite G qPCR saggio come descritto di seguito (i passaggi da 5.2 a 5.5.3). Calcolare il valore medio Cq delle 10 repliche. </li><li> Regolare l&#39;epatite G quantità di reagente in RT Master Mix 1 (tabella 2), Se necessario, per ottenere un valore medio Cq tra 25 e 32 unità. Compensare l&#39;importo sollevato o abbassato modificando il volume di acqua aggiunta per mantenere il RT Master Mix 1 volume finale di 16,5 ml per saggio. </li><li> Confermare le regolazioni ripetendo i punti da 5.1.1 a 5.1.2 e al cambiamento tabella 2 in modo da riflettere i quantitativi corretti. </li></ol></li><li> Preparare qPCR Master Mix in una stanza pulita utilizzando le guide nella Tabella 3 per enterovirus, Tabella 4 e Tabella 5 per norovirus genogruppo I, tabella 6 per norovirus genogruppo II, Tabella 7 per norovirus murino (norovirus genogruppo V), e la Tabella 8 per l&#39;epatite G. Mix ogni master mix e poi centrifugare a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Aggiungere i Master Mix PCR nei rispettivi pozzetti di una piastra di reazione ottica etichetta, utilizzando 14 microlitri per bene e piatti separati per ciascun saggio qPCR (si veda la Figura S2 </strong&gt; per un possibile layout per un saggio qPCR base alla disposizione RT in Figura S1). </li><li> Scongelare la piastra RT dal punto 4.8 a temperatura ambiente, se congelato. Mescolare con un mixer piatto e poi centrifugare a ≥ 500 xg brevemente. </li><li> Dispensare 6 ml di cDNA adeguato alle pozzetti, all&#39;interno della piastra di reazione ottica. Mescolare i campioni nella piastra di reazione ottica e centrifugare a ≥ 500 xg brevemente. <ol><li> Eseguire l&#39;epatite G qPCR test sul campo non diluito e diluito e campioni LFSM prima di eseguire tutti gli altri saggi qPCR. Utilizzare la diluizione più basso di campo o campione LFSM che è &lt;1 valore Cq maggiore del valore medio epatite G Cq per gli enterovirus e norovirus saggi qPCR. </li><li> Impostare il software termociclatore PCR quantitativa in base alle istruzioni del produttore. Identificare i campioni della curva standard come standard e per ogni diluizione curva standard, inserire i valori di copia genomici indicati nella tabella 9. </li><li&gt; eseguire il piatto nel termociclatore PCR quantitativa per 10 min a 95 ° C, seguita da 45 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. </li></ol></li><li> Determinare se ogni curva standard soddisfa i valori accettabili indicati nella tabella 10. Vedere la sezione materiali supplementari S3 per gli esempi. <ol><li> Calcolare la deviazione standard globale (StdDev) per la curva standard utilizzando Equazione 2, <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> dove Cq è il valore riportato per ciascun replicato curva standard, Cq è il valore medio per ogni serie di repliche, #Cq è il numero totale di valori Cq per tutte le repliche di controllo standard che hanno valori positivi (cioè non indeterminato), e # Stds è il numero di controlli standard che hanno valori positivi. </li><li> Se il software termociclatore PCR quantitativa non calcola la pendenza per ogni curva standard, calcolare la pendenza utilizzando equazione 3,60; <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> dove Cq è il valore medio delle diluizioni alti e più bassi utilizzati e log GC è il registro del valore di copia genomica per le diluizioni alti e più bassi utilizzati dalla tabella 9. </li><li> Calcolare il valore di R 2 usando l&#39;equazione 4. <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> dove Cq è la media di tutti i valori Cq e Log GC è il valore medio registro GC per ogni replica. </li><li> Calcolare l&#39;efficienza% utilizzando Equazione 5: <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Registrare i valori GC calcolati dal software termociclatore per tutti i campioni di prova basati su curve standard che soddisfano i criteri specificati nella Tabella 10 ei valori GC medi per ogni campione. Eseguire nuovamente tutti i campioni con le curve standard che non soddisfano i criteri di cui <strong&gt; Tabella 10 o dove vi siano controlli negativi (LRB, NA batch di controllo di estrazione negativo, o NTC) sono positivi. Rielaborare i campioni che non soddisfano i criteri o sono controlli falsi positivi durante la ripetizione. </li><li> Determinare il GC per litro (GC L) per ciascun campione usando Equazione 6: <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> dove GC è la media del numero di copie genomico dal punto 5.7, il fattore &#39;199&#39; è il fattore di diluizione totale delle riduzioni di volume che si verificano durante la concentrazione terziaria, estrazione di RNA e gradini RT-qPCR, DF è il fattore di diluizione che compensa l&#39;inibizione , e D è il volume di campione originale dosati in litri. Vedere materiali supplementari sezione S4 per un esempio di calcolo del GC L. </li><li> Calcolare il GC totale di LFB e LRB campioni moltiplicando il valore GC media dal punto 5.5 da 199 e dividendo per 0,3. </li></ol>

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<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li>
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<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Larga scala studi nazionali di contaminazione virale di acque di fonte e bere richiedono l&#39;utilizzo di più laboratori di analisi. In queste condizioni è necessario un metodo standard per garantire che i dati generati dai diversi laboratori è paragonabile. Ci sono molti metodi molecolari pubblicati di individuazione del virus, ma molto pochi metodi molecolari standardizzati. Metodo EPA 1615 è un metodo standardizzato specificamente progettato per il rilevamento di enterovirus e norovirus in matrici di acqua mediante RT-qPCR. Metodi molecolari standardizzati sono disponibili per il rilevamento di virus negli alimenti (CEN / TS 15216-1 e ISO CEN / TS 15216-2 ISO, 7 Aprile 2013) 16,17 e sono state applicate al rilevamento di virus dell&#39;epatite A e norovirus in primavera acqua 16. Tutti i metodi standard devono comprendere controlli delle prestazioni di qualità e criteri per ridurre al minimo inter- e variazione intra-laboratorio e dati falsi positivi dovuti a contaminazione da laboratorio. Per ridurre ulteriormente i dati falsi, EMetodo PA 1615 segue la guida di EPA sui metodi molecolari, 18, ​​che prevede la separazione del lavoro durante la lavorazione e un modo flusso di lavoro. Esso comprende una epatite G 1,19 procedure di controllo e di ridurre al minimo risultati falsi negativi a causa di inibitori della RT-qPCR 15 interno. Esso utilizza analisi quantitative con volumi standardizzati sia di acqua campionata e acqua analizzata in modo che tutti i dati di campo è espressa in copie genomiche per litro del campo o di bere acqua campionata. Sebbene efficiente tubo singolo (one-step) saggi di RT-PCR sono disponibili in commercio, il metodo utilizza intenzionalmente test separati. Questo ha lo svantaggio di minimizzare la quantità di campione che può essere analizzato in ciascuna reazione, ma offre una maggiore flessibilità di impiego di più set di primer. Saggi di RT-qPCR sono limitati da e solo buono come primer e le sonde utilizzati e probabilmente senza primer rileveranno tutte le varianti del virus all&#39;interno di un gruppo. Il set di primer enterovirus è stato scelto perchéesso si rivolge la regione codificante 5&#39;-non conservati, 20,21 rileva una vasta gamma di sierotipi enterovirus e virus rilevati da esso sono associate con effetti sulla salute dal consumo di acque sotterranee non trattate 1. Due set di primer sono utilizzati per il rilevamento di genogruppo I norovirus 22,23. Il primo è stato scelto a causa della forte correlazione tra gli effetti sulla salute nei bambini e rilevato il virus 1. Il secondo genogruppo I set di primer e il set di primer utilizzato per genogruppo II norovirus sono stati scelti perché rilevano la più ampia varietà di ceppi 24,25. Nonostante i principali vantaggi di procedure qPCR e RT-qPCR per la rilevazione di RNA virale in acqua, ci sono diverse limitazioni. In primo luogo, entrambe le particelle virali infettive e non infettive, comprese quelle inattivato da disinfettanti, possono essere amplificati da tali regimi. I risultati di Borchardt suggeriscono che si tratta di meno di un problema per le acque sotterranee non trattate facquiferi rom simili a quelli nelle comunità studiate che per le acque superficiali disinfettati 1. Per i virus coltivabili questo problema può essere superato utilizzando PCR in combinazione con la cultura 26,27. Il problema è stato affrontato anche per alcuni virus attraverso l&#39;uso di acido nucleico reticolanti agenti 28-30. Quest&#39;ultimo approccio è più efficace per i virus inattivati ​​ipoclorito e non efficaci per coloro inattivato da UV. Una seconda limitazione di queste procedure molecolari è che il volume di campione concentrato che possono essere analizzati in genere è molto più piccolo di quello utilizzato per le procedure di coltura 6,31. Questo problema è spesso effettuata o sostituendo una procedura basata glicole-polietilene per la concentrazione secondaria standard con flocculazione organica, che permette al campione da risospeso in un volume più piccolo, o con l&#39;aggiunta di una concentrazione del campione terziaria passo 6,32,33 . Metodo 1615 utilizza centrifultrafiltrazione ugal per fornire la concentrazione terziaria. Ultrafiltrazione centrifuga rimuove l&#39;acqua e componenti meno di 30.000 Daltons conseguente sia la concentrazione di qualsiasi virus in campioni di prova e una riduzione in piccoli inibitori peso molecolare di saggi molecolari. Questo terziarie risultati fase di concentrazione in un fattore di concentrazione&gt; 10 5 per qualsiasi virus che era presente nell&#39;acqua in fase di test. Una terza limitazione è la presenza di inibitori di procedure molecolari in campioni ambientali. Sebbene siano stati sviluppati numerosi approcci per rimuovere inibitori, nessun metodo è efficace per tutte le matrici acqua e virus tipi 6,34,35, rendendo l&#39;uso di controlli interni volti a stimare il livello di inibizione essenziale. Il reagente epatite G utilizzata in questo metodo soddisfa questa esigenza fornendo un livello costante di RNA virale in tutte le reazioni e un saggio RT-qPCR per stimare inibizione. Quando il meglio di tegli inibitore approcci rimozione non riescono a rimuovere l&#39;inibizione, concentrati campione possono essere diluiti fino a quando le concentrazioni di virus sono più alti di inibitori concentrazioni 14,15. La procedura curva standard qui descritta presenta vantaggi e una limitazione importante. Un vantaggio è che il reagente utilizzato fornisce tutti i componenti necessari in un unico reattivo, consentendo un unico comando da utilizzare per tutti i saggi. Questo reagente è particolarmente un vantaggio per le analisi norovirus. Norovirus particelle possono essere ottenuti solo da individui infetti che rende molto difficile ottenere particelle virali per l&#39;uso come standard. Un altro importante vantaggio è che fornisce uno standard per tutti i virus RNA RNA target in un reagente, come avente un livello di RNA è essenziale per la quantificazione accurata di RNA 36. Tuttavia, la sua capacità di quantificare virus precisione è limitata dal fatto che gli effetti di matrice non vengono presi in considerazione. Ciò significa che la copia genomicaI valori numerici non possono essere considerati assoluta e devono essere considerati solo in termini relativi. Si raccomanda che un numero sufficiente di curva standard di Stock Working aliquote (punto 1.2) essere pronta a coprire studi completi. Per esempio, ogni 250 microlitri aliquota fornisce reagente sufficiente per 6 piastre RT. Se è noto che uno studio richiederà analisi di 500 campioni, sarebbe necessario un minimo di 12 aliquote (500 campioni / 7 campioni per piastra RT / 6 piatti RT per aliquota). Metodo EPA 1615 è un metodo basato sulle prestazioni. Molti produttori fanno reagenti equivalenti a quelle specificate e questi reagenti possono essere sostituiti a condizione che siano rispettati i criteri di performance. La curva standard, che serve anche come controllo positivo RT-qPCR, è di valore in problemi di prestazioni di risoluzione dei problemi. Le prestazioni possono diminuire a causa di degradazione dell&#39;RNA, shelf life del reagente, il fallimento di congelatori, calibrazione dello strumento, e errore tecnico. Problemi di prestazioni devono essere sospettied se curve standard differisce da quella illustrata nella figura 4 o se non sono conformi alle specifiche prestazioni per curve standard. Il test RT-qPCR è abbastanza robusto; completo fallimento è probabilmente dovuto a un uso improprio di RNA o errore tecnico (ad esempio, un reagente mancante). Grande cura dovrebbe essere presa in gestione di campioni di RNA tra l&#39;estrazione e il passo RT per ridurre la degradazione dell&#39;RNA da ribonucleasi. Recuperi poliovirus di acque sotterranee e di grado reagente e recuperi norovirus murini dalla falda incontrato il metodo EPA 1615 criteri di accettazione delle prestazioni (Tabella 11), e sono simili a quelli riportati da altri 33,37,38. Recuperi norovirus murini da campioni LFB erano molto inferiori a quelli dei poliovirus e non avrebbero soddisfatto i criteri di accettazione specifici poliovirus. Le ragioni di basso recupero norovirus murino di acqua distillata sono sconosciuti. Simili ai risultati nel presente documento, Karim e Colleagues segnalato un recupero per norovirus GI.1 del 4% da acqua di rubinetto 39. Lee et al. 37 riportato recuperi medi di norovirus murino e GII.4 norovirus umana del 18% e il 26% da acqua distillata con filtri a disco, rispettivamente. Utilizzando condizioni simili a Lee e colleghi, Kim e Ko osservato recuperi del 46% e del 43% per questi virus, rispettivamente, 38. Gibbons et al. 40 ottengono circa 100% di recupero di GII.4 norovirus umana da acqua di mare, ma Kim e Ko 38 hanno trovato che l&#39;aggiunta di sale e l&#39;acqua distillata a concentrazioni simili o superiori di mare significativamente ridotta recuperi del virus murino e portato in una riduzione di due volte nel recupero GII.4.

PCR quantitativa (qPCR; vedi materiali supplementari per le definizioni dei termini utilizzati in questo manoscritto) e trascrizione inversa-qPCR (RT-qPCR) sono strumenti preziosi per il rilevamento e la quantificazione dei virus enterici umani in ambientale e acque potabili, e soprattutto per molti virus che fanno Non replicare o replicare male in sistemi di colture cellulari. Entrambi gli strumenti hanno dimostrato che molti tipi di virus sono presenti nelle acque potabili ambientali e in tutto il mondo 1-6. Il loro utilizzo insieme con il sequenziamento dei frammenti genomici amplificati durante indagini sui focolai di malattie ha fornito prove per la trasmissione del virus per via d&#39;acqua, come hanno dimostrato che il virus trovato in acqua potabile è identica a quella capannone dai pazienti scoppio 7-10. Sia qPCR e RT-qPCR sono utili strumenti di sanità pubblica. Ad esempio, i dati provenienti da studi condotti dalla US Environmental Protection Agency (EPA) ha dimostrato una forte relazione siale misure degli indicatori tween di qPCR e gli effetti sulla salute nelle acque ad uso ricreativo. Come risultato, finale 2012 Criteri di Qualità dell&#39;acqua ricreativo dell&#39;EPA include un metodo qPCR per monitorare le spiagge ricreativi 11,12. Borchardt e colleghi hanno anche trovato una forte relazione tra gastroenterite acuta in comunità con le acque sotterranee non trattate e il virus nelle acque sotterranee, come misurato mediante RT-qPCR 1. Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere la componente analisi molecolare del metodo EPA 1615 13,14. Questo test utilizza RT-qPCR per fornire una stima quantitativa di enterovirus e copie genomiche norovirus (GC) per litro in base al volume originale di acqua ambientale o bere passato attraverso un filtro elettropositivo. Una panoramica della procedura molecolare è mostrato in Figura 1 punto. Protocollo 1 particolari le procedure per preparare la curva standard. Questi standard sono preparati da un reagente che contiene un RNUna copia della sequenza target per tutti i set di primer / sonda. Sezione 2 descrive la procedura di concentrazione terziaria. Sezione 3 illustra la procedura per estrarre RNA da campioni di acqua e di controllo concentrati. L&#39;RNA da ogni campione viene inversione trascritto mediante saggi in triplo e primer casuali per innescare la trascrizione (sezione 4). Il cDNA da ogni reazione trascrizione inversa è suddiviso in cinque saggi specifici per il virus separate che vengono analizzati in triplice copia da qPCR (sezione 5; Figura 2). Il test utilizza primer e sonde dalla letteratura scientifica (Tabella 1) che sono progettati per rilevare molti enterovirus e norovirus e un reagente contenente epatite G RNA per identificare i campioni di prova che inibiscono RT-qPCR 15.

<table><tbody><tr><td>Camera provetta da 1,5 ml</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 ° C mattone freddo</td><td>Diversified Biotech</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Buffer II e 25-mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C congelatore</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Deve essere un congelatore con sbrinamento</td></tr> <tr><td>manuale-70 &deg; Congelatore C o più freddo</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>Camera a 96 pozzetti</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA corazzato EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Ordine personalizzato</td><td>Utilizzato per quantificare il test RT-qPCR</td></tr><tr><td>Virus dell'epatite G a RNA corazzato</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di biosicurezza</td><td>NuAir Fornitura di attrezzature da laboratorio</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Grado cristallino o superiore</td></tr><tr><td>Tampone AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>Carrier Tampone di diluizione dell'RNA</td></tr><tr><td>Buffer AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Estrazione tampone</td></tr><tr><td>Carrier RNA</td><td>Qiagen</td><td>Non applicabile</td><td>Utilizzare l'RNA vettore fornito con il tampone AVL</td></tr><tr><td>Flaconi per centrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 o 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Rotori per centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di sicurezza Diversified</td><td>Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; 480 Probes Master kit</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Utilizzare provette prive di ribonucleasi e desossiribonucleasi con tappi a scatto</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Film Microseal 'A'</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories HSA5001</td><td>Heat resistente</td></tr><tr><td>Film Microseal 'F'</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSA1001</td><td>Resistente al congelatore</td></tr><tr><td>Filatore per minipiastre</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Camera multitubo</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di reazione ottica</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>4314320</tr><tr><td>Miscela nucleotidica per PCR</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado PCR</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore per piastre</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex gelatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Include tamponi AW1 (primo tampone di lavaggio), AW2 (secondo tampone di lavaggio), AE (tampone di eluizione); l'etanolo deve essere aggiunto ai tamponi AW1 e AW2 prima dell'uso; Non utilizzare il tampone AL fornito con il kit</td></tr><tr><td>Termociclatore per PCR quantitativa</td><td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Primer casuale</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>Promega</td><td>N2515 o N2615</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di riferimento ROX</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II o III Trascrittasi inversa</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 o 18080044</td><td></td></tr><tr><td>Guanti chirurgici</td><td>Fisher</td><td>Scientific 19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>base Trisma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Concentratori centrifughi Vivaspin 20</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo epa 1615. misura di enterovirus e norovirus presenza in water di cultura e rt-qpcr. parte iii. rilevamento virus mediante rt-qpcr

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Il metodo 1615 misura gli enterovirus e i norovirus presenti nelle acque ambientali e potabili. Questo metodo è stato sviluppato con l'obiettivo di avere un metodo standardizzato per l'uso in più laboratori di analisi durante il periodo di monitoraggio 3 della regola di monitoraggio dei contaminanti non regolamentati. Qui presentiamo il protocollo per l'estrazione dell'acido ribonucleico virale (RNA) da concentrati di campioni d'acqua e per misurare quantitativamente le concentrazioni di enterovirus e norovirus utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR). Le concentrazioni di virus per il test molecolare sono calcolate in termini di copie genomiche di RNA virale per litro sulla base di una curva standard. Il metodo utilizza una serie di controlli di qualità per aumentare la qualità dei dati e ridurre le variazioni interlaboratorio e intralaboratorio. Il metodo è stato valutato esaminando il recupero del virus da acque sotterranee e reagenti seminate con poliovirus di tipo 3 e norovirus murino come surrogato dei norovirus umani. I recuperi medi del poliovirus sono stati del 20% nelle acque sotterranee e del 44% nelle acque di grado reagente. I recuperi medi di norovirus murino con il test RT-qPCR sono stati del 30% nelle acque sotterranee e del 4% nell'acqua di grado reagente.

Qui presentiamo una procedura per quantificare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa. Il recupero medio del virus dalle acque sotterranee con questa procedura standardizzata del metodo EPA 1615 è stato del 20% per il poliovirus e del 30% per il norovirus murino.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la concentrazione di enterovirus e norovirus nell'acqua, utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa. Questo viene ottenuto mediante concentrazione terziaria delle particelle virali da campioni d'acqua concentrati, mediante ultrafiltrazione centrifuga. Successivamente, vengono preparati i reagenti per la curva standard come descritto nel protocollo. Segue l'estrazione degli acidi nucleici dai concentrati virali e dalla curva standard. Quindi, l'RNA virale, diluito da uno a cinque e da uno a venticinque volte, viene sottoposto a trascrizione inversa utilizzando primer casuali e trascrittasi inversa. Infine, l'amplificazione del cDNA virale viene eseguita utilizzando primer e sonde specifici per il virus in un termociclatore in tempo reale, seguita dal calcolo del numero di copie genomiche del campione basato sulla curva standard.Il vantaggio principale del metodo EPA 1615 rispetto ad altri metodi standardizzati come ISO 15216 è che è stato progettato specificamente per campioni di acqua e include un saggio per enterovirus. Questo metodo può fornire ai valutatori del rischio nel campo della microbiologia ambientale lo stato attuale delle conoscenze sulla determinazione del rischio da virus nelle acque potabili e ricreative. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà con la standardizzazione integrata nel procedimento. Il metodo è molto dettagliato e deve essere seguito esattamente. Una dimostrazione visiva del metodo è fondamentale poiché anche piccole variazioni possono causare conseguenze negative. A dimostrare la procedura oggi sono Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin e io stessa, Shay Fout. Siamo tutti membri del personale professionale del laboratorio nazionale di ricerca sull'esposizione dell'EPA di Cincinnati, Ohio. Dopo aver preparato una curva standard seguendo il protocollo indicato nel testo, preparare un concentratore centrifugo per ogni campione raccolto, aggiungendo almeno 10 millilitri di PBS 1X e 2% di BSA nella camera superiore del campione. Dopo un'incubazione notturna, lavaggio e aggiunta dei campioni come descritto nel protocollo del testo, centrifugare ogni campione in un rotore a cestello oscillante a 3000-6000 ×g e a quattro gradi Celsius per venti-trenta minuti.Una volta che il campione è stato opportunamente concentrato e trasferito in una nuova provetta da microcentrifuga, aggiungere tampone fosfato di sodio 0,15 molar per portare il volume finale a 400 microlitri più o meno due microlitri. Per estrarre gli acidi nucleici, aggiungere 200 microlitri di tampone di estrazione per un controllo negativo di estrazione e 200 microlitri del concentrato terziario per ciascun campione in esame o diluizione della curva standard, in provette da microcentrifuga separate, ed estrarre l'RNA seguendo le modifiche indicate nel protocollo testuale delle istruzioni del produttore del kit di estrazione. Dopo aver preparato primer e sonde come descritto nel protocollo, preparare in una stanza pulita i mix master per la trascrizione inversa uno e due, come mostrato qui.Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 16,5 microlitri del master mix di RT-PCR nei pozzetti di ciascuna piastra PCR. Successivamente, con il buffer di eluizione del kit di estrazione degli acidi nucleici contenente 400 unità per millilitro di inibitore della RNasi, diluire la matrice campione fortificata in campo e in laboratorio o i campioni LSFM uno a cinque e uno a venticinque. Trasferire 6,7 microlitri degli acidi nucleici da ogni campione in esame, controllo e curva standard in pozzetti separati della piastra PCR, utilizzando pozzetti triplicati per i campioni in esame e i controlli e pozzetti duplicati per le curve standard.Aggiungere 6,7 microlitri di tampone di eluizione nei pozzetti del controllo senza stampo o NTC. Includere da due a otto NTC per piastra di RT, utilizzandone due per il primo campione e quindi due o più ogni quattro campioni aggiuntivi, distribuendo i controlli negativi in tutta la piastra. Utilizzare il sigillante per piastre resistente al calore per sigillare la piastra PCR, assicurandosi che ogni pozzetto sia sigillato ermeticamente. Successivamente, mescolare i campioni per cinque-dieci secondi prima di centrifugare brevemente a una forza maggiore o uguale a 500 ×g.In un termociclatore, incubare la piastra a 99 gradi Celsius per quattro minuti. Portare la piastra a quattro gradi Celsius e quindi centrifugare brevemente una seconda volta. Successivamente, rimuovere con attenzione il sigillo della piastra e aggiungere 16,8 microlitri di RT master mix due in ogni pozzetto. Dopo aver sigillato la piastra e averla mescolata e centrifugata brevemente, posizionarla nel termociclatore ed eseguire un ciclo a 25 gradi Celsius per 15 minuti, seguito da 42 gradi Celsius per 60 minuti, 99 gradi Celsius per cinque minuti e, infine, mantenere a 4 gradi Celsius per un massimo di otto ore oppure conservare i campioni a meno 70 gradi Celsius per un periodo più lungo.In una stanza pulita, preparare le miscele master per la PCR quantitativa utilizzando le guide per enterovirus, norovirus del genogruppo uno, norovirus del genogruppo due ed epatite G. Mescolare ogni miscela master e centrifugare brevemente. Successivamente, come mostrato in questo esempio, aggiungere 14 microlitri delle miscele master PCR nelle pozzette appropriate di una piastra ottica per reazioni etichettata, utilizzando piastre separate per ogni saggio qPCR. Distribuire sei microlitri del cDNA appropriato nelle pozzette corrispondenti. Quindi mescolare i campioni e centrifugare brevemente.Configurare il software del termociclatore come descritto nel protocollo ed eseguire il saggio qPCR per l'epatite G sulla matrice di campioni di campo e di laboratorio fortificati non diluiti e diluiti, o sui campioni LFSM, prima di eseguire tutti gli altri saggi qPCR. Confrontare il valore medio di Cq di ciascun campione con il valore medio di Cq per l'epatite G predeterminato per ogni nuovo lotto di reagenti per l'epatite G. Utilizzare la diluizione più bassa del campione di campo o LDF il cui valore sia inferiore di meno di un'unità di Cq rispetto al valore medio di Cq per l'epatite G nei saggi qPCR per enterovirus e norovirus.Configurare il software del termociclatore per PCR quantitativa seguendo le istruzioni del produttore. Identificare i campioni della curva standard come standard e, per ogni diluizione della curva standard, inserire i valori di copie genomiche indicati qui. Eseguire la piastra a 95 gradi Celsius per dieci minuti, seguiti da 45 cicli di 90 gradi Celsius per 15 secondi e 60 gradi Celsius per un minuto.Stabilire se ogni curva standard soddisfa i valori accettabili indicati in questa tabella. Dopo aver calcolato la deviazione standard, la pendenza, il coefficiente di determinazione (R quadro) e la percentuale di efficienza secondo le equazioni riportate nel protocollo, registrare i valori di copie genomiche o GC calcolati dal software del termociclatore per tutti i campioni in esame, basandosi sulle curve standard che soddisfano i criteri specificati in questa tabella, e i valori medi di GC per ciascun campione. Determinare il numero di GC per litro per ciascun campione in esame utilizzando l'equazione seguente, in cui GC rappresenta il numero medio di copie genomiche appena calcolato.Il fattore 199 è il fattore di diluizione totale per le reazioni volumetriche che si sono verificate durante le concentrazioni terziarie, l'estrazione dell'RNA e i passaggi di RT-qPCR. DF è il fattore di diluizione che compensa l'inibizione e D è il volume del campione originale di acqua saggio in litri.Infine, calcolare il GC totale dei campioni di bianco fortificato in laboratorio (LFB) o di bianco del reagente di laboratorio (LRB) moltiplicando il valore medio di GC precedentemente determinato per 199 e dividendo per 0,3. Complessivamente, il recupero del virus è stato determinato utilizzando campioni appaiati di acqua sotterranea LFSM prelevati sul campo, provenienti da un totale di sette serie di campioni recuperati da tre impianti pubblici di trattamento e da un pozzo privato. I livelli di inoculo per i campioni LFSM erano di tre milioni di MPN di poliovirus di tipo tre e di cinque milioni di PFU di norovirus murino.Il virus norovirus murino è stato utilizzato per la valutazione iniziale in singolo laboratorio del metodo EPA 1615 poiché il reagente per la curva standard non era disponibile al momento. Per i campioni di acqua sotterranea, la resa media del poliovirus è stata del 20% con un errore standard del 2%, mentre la resa media del virus norovirus murino è stata del 30% con un errore standard del 3%. Il campione regolare di campo di acqua sotterranea per ciascun LFSM non ha mostrato alcun enterovirus o norovirus rilevabile. I campioni di bianco arricchito in laboratorio (LFB) e di bianco del reagente di laboratorio (LRB) sono stati analizzati utilizzando acqua di grado reagente inoculata e non inoculata.Il recupero del poliovirus ha avuto una media del 44% con un errore standard dell'1%, mentre il recupero del norovirus murino ha avuto una media del 4% con un errore standard dello 0,5%. Questa figura mostra le curve standard tipiche per l'enterovirus e il genogruppo due del norovirus. La curva del genogruppo due del norovirus soddisfa i criteri della curva standard con un valore di R quadro pari a 0,9987, una deviazione standard complessiva di 0,14 e un'efficienza del 101%. La curva dell'enterovirus soddisfa i criteri di prestazione della curva standard con un valore di R quadro pari a 0,9874, una deviazione standard complessiva di 0,58 e un'efficienza del 103%, ma presenta una sensibilità circa 100 volte inferiore e quindi un limite di rilevamento più alto rispetto alle curve del norovirus.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come concentrare e rilevare enterovirus e norovirus trasportati dall'acqua utilizzando la RT-qPCR. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore per campioni con bassa torbidità. Per campioni con torbidità più elevata, potrebbe essere necessario un tempo aggiuntivo, specialmente nella fase di concentrazione terziaria.Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale proteggere i campioni dalla contaminazione da RNasi prima della trascrizione inversa. Non dimenticare che la PCR è una tecnica molto potente e utile. Sono necessarie precauzioni come la separazione delle postazioni di lavoro e l'uso di controlli appropriati per ridurre al minimo i risultati falsi positivi e falsi negativi.

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Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR (Video) | JoVE Journal

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

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