Melhorar 2D e 3D Pele

O objetivo geral deste procedimento é potencializar a deposição da matriz extracelular e aprimorar os modelos atuais de pele 2D e 3D utilizando o efeito de empacotamento macromolecular. O empacotamento melhora a formação de matrizes derivadas de células e culturas organotípicas maduras em um período de tempo reduzido. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da engenharia de tecidos, pois oferece formas aprimoradas de gerar matrizes extracelulares derivadas de células para a bioengenharia da pele e de outros tecidos.

A principal vantagem desta técnica é que matrizes derivadas de células e construtos cutâneos organotípicos podem ser gerados em um período de tempo significativamente reduzido ao se aplicar o confinamento macromolecular a esses cultivos. A técnica de microscopia de reflexão por interferência permite visualizar a deposição total da matriz extracelular sem a necessidade de marcação com anticorpos. As aplicações dessas técnicas se estenderão desde estudos sobre a deposição de matriz extracelular por células da pele até terapias aprimoradas para feridas, especialmente com a geração de equivalentes cutâneos melhores e cultivos de tecidos para enxertos.

Para começar, semeie 50.000 fibroblastos primários, queratinócitos primários ou uma co-cultura de ambos em um mililitro de meio por poço, nos poços de uma placa de 24 poços. Deixe as células aderirem durante a noite em um incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, descarte o meio antigo e substitua por um mililitro de meio fresco contendo agentes de empacotamento macromolecular e ácido ascórbico a 100-micromolar.

Incube as culturas por seis dias, trocando o meio a cada dois dias. Realize imunofluorescência e Western blot de acordo com o protocolo descrito no texto. Para produzir e utilizar uma matriz derivada de células, após cultivar as células por seis dias com agentes de empacotamento molecular e ácido ascórbico conforme demonstrado anteriormente, descelularize as camadas celulares para obter uma matriz derivada de células, lavando primeiro as camadas celulares duas vezes com PBS 1X.

Aspire o PBS e, em seguida, adicione 250 microlitros de desoxicolanato de sódio 0,5% e incube no gelo por 10 minutos. Aspire o lisado celular, então adicione mais 250 microlitros de desoxicolanato de sódio 0,5% e repita a incubação e aspiração de 10 minutos mais duas vezes. Use água destilada para lavar a matriz derivada de células duas vezes.

Aspire a água e, em seguida, adicione PBS 1X. Armazene a matriz a quatro graus Celsius por até uma semana. Para preparar uma suspensão secundária de células, aspire o PBS da matriz e semeie 50.000 queratinócitos sobre a matriz F, por exemplo.

Deixe as células aderirem durante a noite. Para realizar a microscopia de reflexão por interferência, ou RIM, em uma matriz derivada de células, realize a aquisição de imagens usando um microscópio confocal de acordo com o protocolo descrito. Para confeccionar um gel de colágeno com fibroblastos encapsulados em um inserto de cultura celular, alíquota 10 mililitros de colágeno tipo um de cauda de rato em um béquer frio.

Adicione um mililitro de DMEM frio e 0,5 mililitro de hidróxido de sódio um molar para neutralizar o colágeno ácido. Em seguida, adicione 0,5 mililitro da suspensão de fibroblastos. Usando uma pipeta fria, divida uniformemente os 12 mililitros da solução em insertos de cultura celular em uma placa de cultura de seis poços.

Incube o gel a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante uma hora. Uma vez que o gel tenha solidificado, submerja-o em meio de fibroblastos ou FM. Após incubação por 24 horas, aspire o FM. Utilize quatro mililitros de meio fresco contendo agentes de empacotamento macromolecular para substituir o FM antigo, adicionando dois mililitros ao interior do inserto de cultura celular e dois mililitros ao exterior do inserto de cultura celular. Após uma incubação de 24 horas, utilize agente de dissociação com tripsina 0,125% para tripsinizar os queratinócitos.

Toque suavemente as laterais do frasco para desprender as células e adicione meio contendo soro para neutralizar a tripsina. Após a contagem das células, prepare uma suspensão de queratinócitos. Em seguida, aspire o meio dos insertos de cultura celular e adicione os queratinócitos sobre a parte superior do gel.

Incube o gel por uma hora. Após as queratinócitos terem aderido à superfície do gel, utilize dois mililitros de KSFM ou meio sem soro CTN-57 para submergir a célula dentro do inserto de cultura em gel e adicione dois mililitros de FM ao exterior do inserto de cultura celular. Após uma incubação de 24 horas, descarte o meio antigo e substitua-o por meio fresco contendo agentes de empacotamento macromolecular.

Após sete dias em cultura submersa, para elevar a cultura até uma interface ar-líquido, transfira o inserto de cultura celular para uma placa de poços profundos. Adicione 10 mililitros de meio de estratificação na parte externa do inserto de cultura celular, mantendo o interior do inserto seco. Por fim, incube as culturas e troque o meio a cada três dias durante 14 dias.

Colete e processe-os de acordo com o protocolo descrito no texto. Como mostrado aqui, o confinamento macromolecular permitiu que os fibroblastos depositassem mais matriz extracelular ou ECM em comparação com culturas controle. Após a secularização, ficou evidente que os fibroblastos eram os principais depositadores de colágeno tipo um, colágeno tipo quatro e fibronectina.

Esta figura demonstra que foram os fibroblastos, e não os queratinócitos, que foram os principais depositadores do colágeno sete, e este é o primeiro relato de deposição bem-sucedida do colágeno sete in vitro. Utilizando a RIM, foi capturada a extensão total da matriz derivada das células. Uma sobreposição da imagem de RIM com a marcação por anticorpo mostra a quantidade relativa desse componente da MEC em relação à quantidade total de MEC.

Em um modelo de pele in vitro tridimensional, o confinamento macromolecular, ou MMC, reduziu o tempo de cultivo de cinco semanas para três, a fim de obter um co-cultivo cutâneo organotípico maduro. Como observado aqui, por meio da coloração com hematoxilina e eosina, após três semanas, o cultivo com MMC consistia em uma epiderme multistratificada e uma derme com cristas estromais. Além disso, uma imunomarcação intensa e contínua para colágeno VII foi detectada na junção dérmico-epidérmica dos cultivos com células confinadas, em comparação com uma imunomarcação fraca e irregular para colágeno VII nos cultivos controle.

A microscopia eletrônica de transmissão também mostra a presença de fibrilas de ancoragem em culturas organotípicas geradas com MMC, evidenciando colágeno sete funcional. Matrizes derivadas de células poderiam ser utilizadas para semeadura secundária de células como um scaffold alternativo, já que a complexidade da matriz extracelular é mantida e é produzida pelas próprias células. Culturas organotípicas de pele, geradas sob condições de aglomeração macromolecular, poderiam ser usadas como um modelo de pele 3D aprimorado, pois contêm uma derme com cristas estromais, uma junção dérmico-epidérmica bem definida e uma epiderme pluristratificada.

Culturas organotípicas, ou equivalentes à pele geradas com agentes de empacotamento macromolecular, também podem ser usadas para enxertos de pele, pois apresentam uma junção dérmico-epidérmica mais bem desenvolvida, o que provavelmente melhora o sucesso do enxerto. Além do aumento no depósito de matriz extracelular, o empacotamento macromolecular pode ser aplicado a outros sistemas in vitro para potencializar reações limitadas por taxa, sem a necessidade de aumentar a quantidade de reagentes. Por exemplo, reações em cadeia da polimerase.