Name: Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Scopri l'imaging in tempo reale dei segnali di calcio e glutammato in Arabidopsis thaliana per studiare le risposte alle ferite. Questo metodo offre nuove prospettive sui meccanismi di difesa delle piante.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 e 18H05491) a MT, dalla National Science Foundation (IOS1557899 e MCB2016177) e dalla National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G e 80NSSC19K0126) a SG.

1. Preparazione del materiale vegetale
<ol><li>In un microtubo da 1,5 mL, sterilizzare in superficie i semi della pianta arabidopsis thaliana (adesione Col-0) esprimendo GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR tremando con il 20% (v/v) NaClO per 3 minuti e quindi lavare 5 volte con acqua distillata sterile. NOTA: Le linee transgeniche di Arabidopsis che esprimono GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR sono state descritte in precedenza6.</li>
	<li>In un cappuccio sterile, seminare 13 semi sterilizzati in superficie su una piastra di Petri di plastica quadrata di 10 cm riempita con 30 mL sterile (autoclavato) Murashige e Skoog (MS) medium [1x SALI MS, 1% (w/v) saccarosio, 0,01% (w/v) mioinositolo, 0,05% (w/v) MES e 0,5% (w/v) gomma gellan; pH 5,7 regolato con 1N KOH]. Sostituire il coperchio e avvolgere con nastro chirurgico.</li>
	<li>Dopo l'incubazione al buio a 4 °C per 2 giorni, posizionare le piastre orizzontalmente a 22 °C in una camera di crescita sotto luce continua (90-100 μmol m-2 s-1)per circa 2 settimane prima dell'uso. Dopo 2 settimane, conta il numero di foglie di Arabidopsis dal più vecchio al più giovane44 (Figura 1). Le risposte alle ferite si spostano preferenzialmente dalla foglia danneggiata (n) alle foglie numerate n ± 3 e n ± 56. NOTA: In questo protocollo, la piastra di Petri sarà aperta per l'imaging degli effetti della ferita e del glutammato al microscopio a fluorescenza. Pertanto, le fasi successive di questo esperimento devono essere condotte in condizioni di ambiente controllate da temperatura e umidità. Questo perché i segnali Ca2+ sono anche provocati da cambiamenti in queste condizioni ambientali. È anche noto che la luce blu, emessa dal microscopio durante la registrazione per l'eccitazione della fluorescenza della proteina biosensore, può provocare un aumento della concentrazione citosolica di Ca2 + 45 e quindi la pianta deve essere acclimatata all'irradiazione della luce blu per diversi minuti prima di iniziare l'esperimento.</li>
</ol>2. Preparazione chimica
<ol><li>Sciogliere L-glutammato in un mezzo di crescita liquido [1/2x MS sali, 1% (w/v) saccarosio e 0,05% (w/v) MES; pH 5.1 regolato con 1N KOH] per fare una soluzione di lavoro da 100 mM. NOTA: Evitare l'uso di sali di glutammato come il glutammato di sodio per prevenire potenziali effetti correlati al catione sulla dinamica Ca2+.</li>
</ol>3. Impostazione del microscopio e conduzione di immagini in tempo reale
<ol><li>Accendere lo stereomicroscopio a fluorescenza motorizzata dotato di un obiettivo 1x (NA = 0,156) e di una fotocamera sCMOS (Figura 2) e configurare le impostazioni del dispositivo per irradiare con una luce di eccitazione di 470/40 nm e acquisire una luce di emissione che passa attraverso un filtro da 535/50 nm. NOTA: Qualsiasi microscopio a fluorescenza sensibile alla GFP può essere utilizzato per rilevare segnali GCaMP3 e iGluSnFR in tempo reale, ma si consiglia un obiettivo a bassa potenza e una fotocamera altamente sensibile con un ampio chip sCMOS per acquisire segnali dall'intero impianto. L'obiettivo a bassa potenza consente di imaging della risposta di un intero impianto arabidopsis e l'uso di una telecamera altamente sensibile consente la rapida acquisizione dei dati necessaria per catturare il rapido decorso del tempo dell'onda Ca2 + innescata dalla ferita. Per il microscopio a fluorescenza utilizzato in questo studio, i valori massimi del campo visivo e della risoluzione temporale sono rispettivamente di 3 cm x 3 cm e 30 fotogrammi al secondo (fps).</li>
	<li>Rimuovere il coperchio e posizionare il piatto sotto l'obiettivo.</li>
	<li>Controllare il segnale di fluorescenza dalla pianta e quindi attendere circa 30 minuti al buio fino a quando le piante non vengono adattate alle nuove condizioni ambientali. Questo passaggio di adattamento è necessario perché i cambiamenti nell'umidità provocano [Ca2+]elevazione del cito nelle piante che possono interferire con qualsiasi evento correlato alla ferita.</li>
	<li>Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento per vedere l'intera pianta nel campo visivo. Nel protocollo corrente è stato utilizzato un ingrandimento 0,63x.</li>
	<li>Prima di iniziare l'imaging in tempo reale, impostare i parametri di acquisizione per rilevare i segnali di fluorescenza utilizzando il software di imaging al microscopio. Le impostazioni per l'imaging nel protocollo corrente sono: tempi di esposizione e intervallo impostati rispettivamente su 1,8 s e 2 s (cioè 0,5 fps). Impostare il tempo di registrazione su 11 min.</li>
	<li>Immagine per 5 minuti prima di iniziare l'esperimento per acclimatare la pianta all'irradiazione della luce blu dal microscopio,quindi iniziare a registrare facendo clic su Run Now o sul comando equivalente nel software del microscopio utilizzato. Per determinare la fluorescenza media di base, registrare almeno 10 fotogrammi (cioè almeno 20 s nel protocollo corrente) prima di ferire o applicazione di glutammato (vedere sezione 4).<ol>
<li>Per l'imaging in tempo reale delcito indotto dalla ferita [Ca2+] e [Glu]apo cambia, tagliare il picciolo o la regione centrale della foglia L1 con le forbici(Figura 3 e Figura 4).</li>
		<li>Per l'imaging in tempo reale dei cambi dicit innescati dal glutammato [Ca2+], tagliare il bordo (circa 1 mm dalla punta) della foglia 1 attraverso la vena principale con le forbici. Dopo almeno 20 minuti di recupero, applicare 10 μL di glutammato da 100 mM sulla superficie tagliata della foglia (Figura 5). NOTA: Questo pre-taglio era necessario per consentire l'accesso del glutammato all'apoplasto fogliare al fine di innescare risposte. Inoltre, l'applicazione di una goccia di acqua distillata sulla superficie tagliata della foglia L1 è stata trovata fondamentale per evitare che i campioni si desiccano durante il recupero prima di applicare il glutammato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo aver terminato la registrazione di 11 minuti, salvare i dati.</li>
</ol>4. Analisi dei dati
<ol><li>Per l'analisi dell'intensità della fluorescenza nel tempo, definire una regione di interesse (ROI) nel luogo in cui deve essere analizzata l'intensità della fluorescenza(Figura 6 e Figura 7). Per il calcolo della velocità dell'onda Ca2+, definire 2 ROI (ROI1 e ROI2) per l'analisi. Nel software di imaging, fare clic su Misurazione del tempo | Definisci | Cerchio. Misurare la distanza tra ROI1 e ROI2 facendo clic su Annotazioni e misure | Lunghezza | Linea semplice (figura 6).</li>
	<li>Misurare i valori di fluorescenza grezza (F) in ogni ROI nel tempo facendo clic su Misura. Esportare i dati grezzi in un software per fogli di calcolo per convertire il segnale di fluorescenza in numeri in ogni momento facendo clic su Tutti in Excel | Esportazione.</li>
	<li>Determinare il valore di fluorescenza di base, definito come F0, calcolando la media di F sui primi 10 fotogrammi (cioè prima del trattamento) nei dati registrati.</li>
	<li>Normalizzare i dati F (calcolando ΔF/F) usando l'equazione ΔF/F = (F−F0)/F0, dove ΔF è la variazione di fluorescenza dipendente dal tempo.</li>
	<li>Per l'analisi dell'onda di velocità d'onda Ca2+, definire un significativo punto di aumento del segnale al di sopra dei valori pre-stimolati comerappresentazione del rilevamento di un aumento ca 2+ in ogni ROI (t1 e t2) usando il criterio di un aumento a 2× la deviazione standard (2x SD) che viene calcolata dai dati F0 utilizzando software statistico. Il 95% dei dati F0 rientra in 2x SD dalla media, indicando che un aumento del segnale al di sopra di questo livello per caso è ≤5%. Calcolare la differenza di tempo dell'aumento ca2+ tra ROI1 e ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] e misurare la distanza tra ROI1 e ROI2, quindi determinare le velocità di qualsiasi onda Ca2+.</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

La segnalazione sistemica è importante per le piante per rispondere agli stimoli ambientali esterni localizzati e quindi per mantenere la loro omeostasi a un intero livello di impianto. Sebbene non siano dotati di un sistema nervoso avanzato come gli animali, impiegano una comunicazione rapida sia all'interno che tra gli organi sulla base di fattori come segnali elettrici mobili (ed eventualmente idraulici) e onde di propagazione di ROS e Ca2 +46,47. I...

Le piante non possono sfuggire agli stress biotici, ad esempio gli insetti che si nutrono di loro, quindi hanno sviluppato sofisticati sistemi di rilevamento dello stress e trasduzione del segnale per rilevare e quindi proteggersi da sfide come l'erbivoro1. Al momento del mento o dell'attacco di erbivoro, le piante avviano risposte rapide di difesa tra cui l'accumulo dell'acido jasmonico fitoormone (JA) non solo nel sito ferito ma anche negli organi distale non danneggiati2. Questo JA quindi innesca risposte di difesa nei tessuti direttamente danneggiati e induce preemptive difese nelle parti non danneggiate della pianta. In Arabidopsis, l'accumulo di JA indotto dal mento è stato rilevato in foglie distale e intatte entro pochi minuti dai danni altrove nella pianta suggerendo che un segnale rapido e a lunga distanza viene trasmesso dalla fogliaferita 3. Diversi candidati, come Ca2+,specie reattive dell'ossigeno (ROS) e segnali elettrici, sono stati proposti per servire come questi segnali di ferita a lunga distanza nellepiante 4,5.
Ca2+ è uno dei secondi elementi messaggeri più versatili e onnipresenti negli organismi eucarioti. Nelle piante, la masticazione del bruco e il mento meccanico causano drastici aumenti della concentrazione citosolica di Ca2 + ([Ca2+]cyt) sia nella foglia ferita che nelle foglie lontane non liche6,7. Questo segnale ca2+ sistemico viene ricevuto dalle proteine intracellulari ca2+,che portano all'attivazione di vie di segnalazione della difesa a valle, tra cui biosintesi JA8,9. Nonostante numerosi rapporti di questo tipo supportano l'importanza dei segnali Ca2+ nelle risposte delle ferite delle piante, le informazioni sulle caratteristiche spaziali e temporali dei segnali Ca2+ indotti dal ferimento sono limitate.
L'imaging in tempo reale utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati è un potente strumento per monitorare e quantificare la dinamica spaziale e temporale dei segnali Ca2+. Ad oggi, sono state sviluppate versioni di tali sensori che consentono la visualizzazione di segnali Ca2 + a livello di una singola cellula, a tessuti, organi e persino piante intere10. Il primo biosensore geneticamente codificato per Ca2+ utilizzato nelle piante è stata l'aequorina proteica bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea victoria11. Sebbene questa proteina chemiluminescente sia stata utilizzata per rilevare cambiamenti Ca2+ in risposta a varie sollecitazioni nelle piante12,13,14,15,16,17,18, non è adatta per l'imaging in tempo reale a causa del segnale luminescente estremamente basso che produce. Gli indicatori Ca2+ basati su Förster Resonance Energy Transfer (FRET), come i camelioni gialli, sono stati utilizzati con successo anche per indagare la dinamica di una serie di eventidi segnalazione Ca 2 + negliimpianti 19,20,21,22,23,24. Questi sensori sono compatibili con gli approcci di imaging e più comunemente sono composti dalla calmodulina proteica legante Ca2+ (CaM) e da un peptide legante CaM (M13) da una chinasi della catena leggera della miosina, tutti fusi tra due proteine fluorofori, generalmente una proteina fluorescente ciano (CFP) e una variante della proteina fluorescente gialla (YFP)10. L'associazione Ca2+ a CaM favorisce l'interazione tra CaM e M13 portando a un cambiamento conformazionale del sensore. Questo cambiamento promuove il trasferimento di energia tra la PCP e l'YFP, il che aumenta l'intensità di fluorescenza dell'YFP riducendo al contempo le emissioni di fluorescenza della PCP. Il monitoraggio di questo passaggio dalla PCP alla fluorescenza YFP fornisce quindi una misura dell'aumento del livello Ca2+. Oltre a questi sensori FRET, i biosensori Ca2+ a base di proteine fluorescenti singole (FP), come GCaMP e R-GECO, sono anche compatibili con gli approcci di imaging vegetale e sono ampiamente utilizzati per studiare [Ca2+]cambiamenti del cito a causa della loro elevata sensibilità e facilità d'uso25,26,27,28,29,30. I GCAMP contengono un singolo GFP permutato circolare (cp), nuovamente fuso a CaM e al peptide M13. L'interazione dipendente da Ca2+tra CaM e M13 provoca un cambiamento conformazionale nel sensore che promuove uno spostamento dello stato di protonazione del cpGFP, migliorando il suo segnale fluorescente. Pertanto, conl'aumento dei livelli di Ca 2+, il segnale cpGFP aumenta.
Per indagare la dinamica dei segnali Ca2+ generati in risposta a ferite meccaniche o alimentazione di erbivori, abbiamo utilizzato piante transgeniche arabidopsis thaliana che esprimono una variante GCaMP, GCaMP3, e un microscopio a fluorescenza a campolargo 6. Questo approccio è riuscito a visualizzare la trasmissione rapida di un segnale Ca2+ a lunga distanza dal sito della ferita su una foglia a tutta la pianta. Pertanto, un aumento del cito [Ca2+]è stato immediatamente rilevato nel sito della ferita, ma questo segnale Ca2 + è stato poi propagato alle foglie vicine attraverso la vascucolatura entro pochi minuti dal mento. Inoltre, abbiamo scoperto che la trasmissione di questo rapido segnale di ferita sistemica è abolita nelle piante arabidopsis con mutazioni in due geni simili al recettore del glutammato, Glutammato Recettore Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.66. I GLR sembrano funzionare come canali Ca2+ recintati da amminoacidi coinvolti in diversi processi fisiologici, tra cui rispostaalle ferite 3,crescita del tubo di polline31,sviluppo delle radici32,risposta alfreddo 33e immunità innata34. Nonostante questa ben compresa, ampia funzione fisiologica dei GLR, le informazioni sulle loro proprietà funzionali, come la loro specificità ligando, la selettività ioniche e la localizzazione subcellulare, sonolimitate 35. Tuttavia, studi recenti hanno riferito che GLR3.3 e GLR3.6 sono localizzati rispettivamente nel phloem e nello xilema. I GLR vegetali hanno somiglianze con i recettori del glutammato ionotropico (iGluRs)36 nei mammiferi, che vengono attivati dagli amminoacidi, come glutammato, glicina e D-serina nel sistema nervoso dei mammiferi37. Infatti, abbiamo dimostrato che l'applicazione di glutammato di 100 mM, ma non di altri amminoacidi, nel sito della ferita induce un segnale Ca2 + rapido e a lunga distanza in Arabidopsis, indicando che il glutammato extracellulare agisce probabilmente come un segnale di ferita nelle piante6. Questa risposta è abolita nel mutante glr3.3/glr3.6 suggerendo che il glutammato possa agire attraverso uno o entrambi questi canali simili a recettori e, in effetti, AtGLR3.6 è stato recentemente dimostrato essere gated da questi livelli di glutammato38.
Nelle piante, oltre al suo ruolo di amminoacido strutturale, il glutammato è stato proposto anche come regolatore chiave dello sviluppo39; tuttavia, le sue dinamiche spaziali e temporali sono poco comprese. Proprio come per Ca2+,sono stati sviluppati diversi indicatori geneticamente codificati per il glutammato per monitorare la dinamica di questo amminoacido nelle celluleviventi 40,41. iGluSnFR è un biosensore glutammato single-FP basato su GFP composto da cpGFP e una proteina legante il glutammato (GltI) di Escherichia coli42,43. Il cambiamento conformazionale di iGluSnFR, indotto dal legame del glutammato con GltI, si traduce in una maggiore emissione di fluorescenza GFP. Per indagare se il glutammato extracellulare agisce come una molecola di segnalazione nella risposta della ferita vegetale, abbiamo collegato la sequenza iGluSnFR con la sequenza di secrezione peptidica del segnale chitinasio di base (CHIB-iGluSnFR) per localizzare questo biosensore nello spazio apoplastico6. Questo approccio ha permesso di imaging di eventuali cambiamenti nella concentrazione di glutammato apoplastico ([Glu]apo) utilizzando piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono questo sensore. Abbiamo rilevato rapidi aumenti del segnale iGluSnFR nel sito di wounding. Questi dati supportano l'idea che il glutammato fuoriesi dalle cellule / tessuti danneggiati all'apoplasto al momento del mento e agisce come un segnale di danno attivando i GLR e portando al segnale Ca2 + a lunga distanza nelle piante6.
Qui, descriviamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale utilizzando biosensori geneticamente codificati per monitorare e analizzare la dinamica dei segnali ca2+ a lunga distanza e glutammato extracellulare in risposta almento 6. La disponibilità di microscopia a fluorescenza a campo largo e piante transgeniche che esprimono biosensori geneticamente codificati fornisce un approccio potente ma facilmente implementato per rilevare segnali a lunga distanza trasmessi rapidamente, come le onde Ca2+.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis esprime GCaMP3</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis esprime CHIB-iGluSnFR</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutammato</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00501</td><td>Disciolto in un terreno di coltura liquido [1/2x sali MS, 1% (p/v) di saccarosio e 0,05% (p/v) MES; pH 5,1 regolato con 1N KOH].</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) medium</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>392-00591</td><td>composizione: 1x sali MS, 1% (p/v) saccarosio, 0,01% (p/v) mioinositolo, 0,05% (p/v) MES e 0,5% (p/v) gomma di gellano; pH 5,7 regolato con 1N KOH.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Nikon SMZ25</td><td>Analisi AR Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Obiettivo Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x (P2-SHR PLAN APO)Fotocamera</td> <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri quadrata in plastica</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in arabidopsis

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Gli impianti rispondono a sollecitazioni meccaniche come ferite ed erbivori inducendo risposte di difesa sia nelle parti danneggiate che in quelle non danneggiate. Al momento del mento di una foglia, si verifica un aumento della concentrazione citosolica di ioni di calcio (segnale Ca2 +) nel sito della ferita. Questo segnale viene rapidamente trasmesso a foglie non danneggiate, dove vengono attivate le risposte della difesa. La nostra recente ricerca ha rivelato che il glutammato che fuorie' dalle cellule ferite della foglia nell'apoplasto che li circonda serve come segnale di ferita. Questo glutammato attiva canali permeabili Ca2+ simili al recettore del glutammato, che quindi porta alla propagazione del segnale Ca2+ a lunga distanza in tutta la pianta. Le caratteristiche spaziali e temporali di questi eventi possono essere catturate con l'imaging in tempo reale di piante viventi che esprimono biosensori fluorescenti geneticamente codificati. Qui introduciamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale per monitorare la dinamica dei segnali Ca2 + e i cambiamenti nel glutammato apoplastico che si verificano in risposta al mento. Questo approccio utilizza un microscopio a fluorescenza a campo ampio e piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono biosensori Ca2+ a base di proteina fluorescente verde (GFP) e biosensori glutammati. Inoltre, presentiamo una metodologia per suscitare facilmente la propagazione del segnale Ca2+ indotta da ferite, innescata dal glutammato e rapida e a lunga distanza. Questo protocollo può anche essere applicato a studi su altre sollecitazioni dell'impianto per aiutare a studiare come la segnalazione sistemica degli impianti potrebbe essere coinvolta nelle loro reti di segnalazione e risposta.

La propagazione del segnale di [Ca2+]cyt e [Glu]apo in risposta al collare è presentata nella Figura 3, Figura 4, Filmato S1e Filmato S2. Il taglio del picciolo della foglia 1 nelle piante che esprimono GCaMP3 (a 0 s) ha portato a un aumento significativo delcit [Ca2+] che è stato rapidamente indotto localmente attraverso la vascucolatura (a ...

La segnalazione sistemica del calcio extracellulare innescata dal glutammato è fondamentale per l'induzione delle risposte della difesa delle piante al mento meccanico e all'attacco di erbivoro nelle piante. Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la dinamica spaziale e temporale di entrambi questi fattori utilizzando piante di thaliana arabidopsis che esprimono biosensori fluorescenti sensibili al calcio e al glutammato.

Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Questo protocollo consente l'imaging in tempo reale a livello vegetale dell'attività del sistema di segnalazione sistemica vegetale attraverso il monitoraggio della dinamica del glutammato di calcio e apoplastico in risposta al mento. Questo metodo di imaging in tempo reale a livello di impianto fornisce uno strumento robusto per comprendere la dinamica dei segnali rapidi e a lunga distanza nelle piante, combinando un'elevata risoluzione temporale spaziale e facilità d'uso. Questo protocollo offre il potenziale per fornire una nuova visione delle caratteristiche spaziali e temporali del sistema di segnalazione del calcio sia nelle risposte di stress biotico che abiotico in altre specie di piante.A dimostrare la procedura sarà Takuya Uemura, un dottoranda del mio laboratorio. Inizia accendendo il microscopio stereo fluorescente motorizzato, dotato di un obiettivo 1X e di una fotocamera sCMOS. Configurare le impostazioni del dispositivo per l'irradiazione con luce di eccitazione centrata su 470 nanometri, selezionata utilizzando un filtro che trasmette luce tra 450 e 490 nanometri.Acquisire luce di emissione utilizzando un filtro che trasmette tra 510 e 560 nanometri. Rimuovere il coperchio dal piatto contenente la pianta e posizionarlo sotto l'obiettivo. Controllare il segnale fluorescente dalla pianta.Quindi attendere circa 30 minuti al buio fino a quando le piante non sono adattate alle nuove condizioni ambientali. Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento per vedere l'intera pianta nel campo visivo. Quindi impostare i parametri di acquisizione per rilevare i segnali fluorescenti utilizzando il software di imaging al microscopio.Impostare il tempo di registrazione su 11 minuti. Immagine per cinque minuti prima di iniziare l'esperimento per acclimatare la pianta all'irradiazione della luce blu dal microscopio, quindi iniziare a registrare. Per determinare la media della fluorescenza basale registrare almeno 10 fotogrammi prima del rilevamento o dell'applicazione del glutammato.Per l'imaging in tempo reale dello ione calcio citosolico indotto dalla ferita e dei cambiamenti di concentrazione di glutammato apoplastico, tagliare il picciolo o la regione centrale della foglia L1 con le forbici. Per l'imaging in tempo reale del glutammato ha innescato cambiamenti di calcio citosolico, tagliare circa un millimetro dalla punta della foglia L1 attraverso la vena principale con le forbici. Dopo almeno 20 minuti applicare 10 microlitri di glutammato millimolare sulla superficie tagliata della foglia.Per l'analisi dell'intensità della fluorescenza nel tempo, definire una regione di interesse nel luogo in cui deve essere analizzata l'intensità della fluorescenza. Definire due ROM per il calcolo della velocità dell'onda di calcio. Nel software di imaging fare clic sulla misurazione del tempo, definire e cerchiare.Misurare la distanza tra le due regioni facendo clic su annotazioni e misure, lunghezza e linea semplice. Misurare i valori di florescence grezzi in ogni ROI nel tempo facendo clic sulla misura, quindi esportare i dati grezzi nel software del foglio di calcolo, per convertire il segnale fluorescente in numeri in ogni punto di tempo. Determinare il valore di fluorescenza di base, che è intuito come F zero, calcolando la F media sui primi 10 fotogrammi nei dati registrati, quindi normalizzare i dati F come descritto nel manoscritto testuale.Per l'analisi delle onde di velocità del calcio, definire un significativo punto di aumento del segnale al di sopra dei valori pre-stimolati come rappresentazione del rilevamento di un aumento del calcio in ogni ROI. Calcola la differenza di tempo nell'aumento del calcio tra le due ROM e la distanza tra loro per determinare le velocità di qualsiasi ondata di calcio. La propagazione di un cambiamento innescato da ferite nelle concentrazioni dello ione calcio citosolico e del glutammato apoplastico è mostrata qui.Tagliare il picceolo di una foglia nelle piante che esprimono GCaMP-3 ha portato a un aumento significativo del calcio. È stato indotto localmente e poi diffuso in tutta la vascucolatura. Il segnale si propagava rapidamente alle foglie vicine in pochi minuti.Dopo aver tagliato una foglia e piante che esprimono lo sniffer di colla chitinasi I di base, è stato osservato un rapido aumento del glutammato apoplastico intorno alla regione tagliata. Nel giro di pochi minuti, il segnale si propagava anche attraverso la vascucolatura. Per l'imaging in tempo reale della propagazione del segnale di calcio innescata dall'applicazione del glutammato, è stato tagliato il bordo di una foglia nelle piante che esprimono CCaMP-3.Ciò causò un aumento della concentrazione locale di ioni di calcio citosolico, ma il segnale scomparve in pochi minuti. Dopo circa 10 minuti, il glutammato è stato applicato sulla superficie tagliata, causando un rapido aumento locale della concentrazione di calcio citosolico e quindi la propagazione di questo segnale alle foglie distali. Per misurare i cambiamenti all'interno di una concentrazione solida di calcio indotta dallo ingrato nella foglia sistemica, il cambio di rotta del tempo dell'intensità del segnale GCaMP-3 è stato misurato in due regioni di interesse.Sono stati misurati anche i cambiamenti di concentrazione di glutammato apoplastico in risposta ai danni meccanici. La firma del glutammato mostrava un singolo picco a circa 100 secondi dopo il mento. Questo esperimento deve essere condotto in condizioni controllate da temperatura e umidità perché sono elevati da cambiamenti in queste condizioni ambientali.Questo protocollo offre un potenziale per fornire informazioni sui meccanismi molecolari alla base della segnalazione a lunga distanza attraverso l'uso di mutanti che gli elementi difettosi e putativi del sistema di segnalazione di laboratorio.

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Questo protocollo descrive un metodo semplice per analizzare segnali di calcio negli impianti generati da insetti Pentatomomorfi, come gli afidi. Thaliana di Arabidopsis trasformate con il biosensore di calcio GFP GCaMP3 consentire per l'imaging in tempo reale in vivo della dinamica del calcio con un'alta risoluzione temporale e spaziale.

Registrazione in tempo reale In Vivo di Arabidopsis segnali di calcio durante l'alimentazione dell'insetto utilizzando un biosensore fluorescente

Diversi metodi comunemente usati sono introdotti qui per studiare gli eventi di traffico di membrana di una chinasi del recettore della membrana plasmatica. Questo manoscritto descrive protocolli dettagliati tra cui la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell'imaging confocale.

Metodi basati su immagini per studiare eventi di traffico di membrana in cellule di lignaggio stomatico

Qui, presentiamo un metodo semplice per l'osservazione diretta e la misurazione automatizzata delle risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana. Questo metodo sfrutta un dispositivo di imaging stomatico portatile, insieme a una pipeline di analisi delle immagini progettata per le immagini delle foglie catturate dal dispositivo.

Osservazione diretta e misurazione automatizzata delle risposte stomatiche a Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 in Arabidopsis thaliana

Scopri l'imaging in tempo reale dei segnali di calcio e glutammato in Arabidopsis thaliana per studiare le risposte alle ferite. Questo metodo offre nuove prospettive sui meccanismi di difesa delle piante.

Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

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