Name: HSV-mediata Transgene Espressione di chimerici costrutti di studio comportamentale funzione di GPCR Heteromers nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Scopri come il trasferimento genico mediato da virus influenza i fenotipi comportamentali legati all'eterodimerizzazione dei recettori accoppiati a proteine G nei modelli murini. Questo metodo permette di studiare le interazioni tra recettori 5-HT2A e mGlu2.

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NIH R01MH084894 partecipato al finanziamento di questo studio. Vorremmo ringraziare il Dott. Yasmin Hurd e Scott Russo al Mount Sinai School of Medicine per la donazione di topi e l&#39;uso dei loro chirurgia e comportamento strutture durante le riprese di questo lavoro.

NOTA: Tutte le procedure per l&#39;allevamento degli animali e le cure sono state condotte secondo la norma istituzionale cura e l&#39;uso Comitato Animal (IACUC) di Icahn Scuola di Medicina Mount Sinai. Assicurarsi di utilizzare guanti sterili durante tutta la procedura. 1. droga e Virus Preparazione <ol><li> Drug Preparazione <ol><li> Preparare 15,0 ml di ketamina / xilazina anestetico sciogliendo 1,35 ml di 100 mg / ml ketamina e 0,75 ml di 20 mg / xilazina ml in 12,9 ml di 0,9% di soluzione salina. Mescolare bene la soluzione. </li></ol></li><li> Virus Preparazione <ol><li> Clonare il mGlu2 e mGlu2ΔTM4N costruisce in un vettore bicistronico virus herpes simplex (HSV) a seguito di protocolli standard precedentemente descritti 6. Pacchetto le particelle virali come descritto in precedenza 6,13,14. Sostituzione di residui Ala-677 4.40, Ala-681 4.44 e 4.48 Ala685 in mGlu2 per Ser686 4.40, PhE690 4.44 e Gly-694 4.48 in mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) sono state descritte in precedenza 6. NOTA: E &#39;stato precedentemente dimostrato che il chimerico costrutto HA-mGlu2ΔTM4N è espressa a livello della membrana plasmatica con G intatti proteina-dipendente di segnalazione 6. </li><li> Conservare vettori virali -80 ° C quando non in uso. Disgelo vettore virale su ghiaccio, e quindi un&#39;aliquota in 10 microlitri aliquote. Per la procedura chirurgica, tenere su ghiaccio. </li></ol></li></ol> 2. Chirurgia <ol><li> Preparazione Chirurgia <ol><li> Pesare il mouse e iniettare il mouse con la dose appropriata di cocktail di ketamina / xylazina (per i dettagli, vedere 1.1.1). </li><li> Controllare mouse per vedere se adeguatamente anestetizzato, spremere piede e la coda per la risposta del dolore, se non è possibile ottenere una risposta, il mouse è adeguatamente anestetizzato. </li><li> Radersi la testa del mouse dalla base del cranio alla punta del naso con tagliaunghie. Applicare il gel oftalmico per l&#39;AF del mouseterward per prevenire la cecità del mouse. </li><li> Caricare ogni siringa sul telaio stereotassico. Poi inclinare porzione perpendicolare di ciascun braccio del telaio stereotassico modo che siano 10 gradi dalla normale. Assicurarsi che i bracci sono inclinati, in modo tale che gli aghi sono di fronte all&#39;altra. </li><li> Pulire ogni siringa riempiendo l&#39;ago con il 70% di etanolo. Riempire l&#39;ago almeno tre volte per assicurare che la siringa è pulito. </li><li> Una volta che l&#39;ago è stato pulito, lavare l&#39;ago riempiendo l&#39;ago con doppia H 2 O. distillata Una volta lavata, riempire ogni ago con 1,3 ml di doppia H 2 O. distillata Ruotare lo stantuffo della siringa per rilasciare 0,3 ml di doppia H 2 O. distillata Se perle d&#39;acqua sulla punta dell&#39;ago, accuratamente spazzare via l&#39;acqua. Se non viene fuori niente della siringa, spingere lo stantuffo fino in fondo e poi ripetere la pulizia della siringa. </li><li> Dopo il riempimento con acqua, poi tirare la siringa riempire la siringa con0,5 ml di aria. </li><li> Una volta che l&#39;aria e l&#39;acqua sono nella siringa, riempire accuratamente la siringa con 1,3 ml di soluzione di virus. A questo punto assicurarsi che il volume totale nella siringa è di 2,8 microlitri. Ancora ruotare la punta della siringa per rilasciare 0,3 ml di virus. Se perle liquide alla punta dell&#39;ago, accuratamente spazzare via liquido. Se non viene fuori niente della siringa, spingere lo stantuffo fino in fondo e poi ripetere la pulizia della siringa. </li></ol></li><li> Chirurgia <ol><li> Collegare il mouse al telaio stereotassico, avendo cura di regolare il telaio stereotassico in modo che il cranio è di livello e piatta. Applicare povodine-iodio al cuoio capelluto esposto. Usando un bisturi, fare una incisione sagittale lungo la linea mediana del cranio all&#39;interno dell&#39;area rasata esposta. Quindi collegare i morsetti Buret alla pelle al sito di incisione per assicurarsi che il cranio rimane esposto. </li><li> Utilizzare H 2 O 2 al dissolversi periostio per esporre le suture dellacranio. Ora che il bregma e suture sono visibili, assicurarsi di regolare il telaio stereotassico per assicurarsi che il teschio sia a livello. </li><li> Allineare le punte degli aghi delle siringhe con bregma e registrare le coordinate del bregma. Calcolare le coordinate del dove gli aghi stanno per essere inserito. <ol><li> Per il piano Rostral-Cauldal (RC), aggiungere 1,6 mm ai registrate RC coordinate bregma (+1,6 da Bregma). Per il piano dorso-ventrale (DV), sottrarre 2,4 millimetri dalle coordinate bregma DV registrate (-2,4 da Bregma). </li><li> Infine, per il piano mediale laterale (ML), aggiungere 2,6 mm ai registrate ML coordinate bregma (+2,6 da Bregma). Per tutte le coordinate essere sicuri di registrare sia le coordinate sinistra e destra, come questo è un iniezione bilaterale. </li></ol></li><li> Portare gli aghi per le coordinate desiderate. Segnare i luoghi di cui gli aghi stanno per essere inserito e con un trapano, trapano aree contrassegnate. </li><li> Con una punta di cotone dell&#39;applicatore wipe via qualsiasi sangue o del midollo frammento di eccesso. </li><li> Portare gli aghi al cranio dove le punte degli aghi sono toccare la superficie del cervello. Quindi abbassare gli aghi per le coordinate desiderate lentamente abbassando. </li><li> Una volta che gli aghi sono sulle coordinate volute, iniettare lentamente il contenuto della siringa ruotandolo lo stantuffo dell&#39;ago 0,1 microlitri al minuto nel corso di 5 minuti (in totale 0,5 microlitri). </li><li> Dopo l&#39;iniezione è stata fatta lasciare la siringa nella corteccia per altri 5 minuti. </li></ol></li><li> Chiusura Up / Care <ol><li> Rimuovere gli aghi dalla corteccia del mouse costantemente e lentamente. Quindi rimuovere il mouse dal telaio stereotassico. </li><li> Applicare cianoacrilato (colla cutanea) per i lembi di pelle di base dall&#39;incisione e poi con una pinza afferrare i lembi di pelle e metterli insieme. </li><li> Lasciare che il cianoacrilato asciugare. Posizionare il mouse nella gabbia sopra una piastra elettrica (rilievo di riscaldamento è facoltativo se l&#39;surgSuite ical viene mantenuta sotto RT di 37 ° C - altrimenti non necessario). Assicurarsi di posizionare il mouse su un tovagliolo di carta per fare in modo che nel letto non aderisce al sito chirurgico. </li><li> A seconda della lunghezza della procedura chirurgica, assicurarsi che i topi è fuori di anestesia in 30 - 60 min dopo la procedura. Dopo l&#39;intervento chirurgico, l&#39;animale viene posto nella sua gabbia e monitorato fino diventa consapevole prima di tornare alla camera per recuperare. Non si usano analgesici post-operatorio, perché possono alterare i risultati dei nostri esperimenti, modificando alcune delle vie biochimiche del cervello. Tuttavia, gli animali vengono controllati fino a quando si riprendono dall&#39;anestesia il giorno della chirurgia, e post-operazione al giorno per segni di infezione e di valutazione del dolore / disagio. </li></ol></li></ol> Esperimento 3. Capo Twitch Risposta <ol><li> Impostare <ol><li> Effettuare tutti i test comportamentali 10:00-14:00, 2 - 3 giorni dopo stereotaCTIC iniezione di particelle virali. </li><li> Sciogliere (±) -1- (2,5-dimetossi-4-iodofenil) cloridrato -2-aminopropano (DOI) in una soluzione salina allo 0,9% e 2,0 mg / kg. Anche preparare una soluzione salina allo 0,9%. </li><li> Preparare una gabbia di casa (28 x 18 x 15 cm) senza biancheria da letto e l&#39;utilizzo di un tri-pod, regolare una macchina fotografica in modo che la vista della telecamera si trova direttamente sopra la gabbia casa. </li><li> Abituare i topi al ambiente per almeno 4 ore prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Impostare una videocamera per registrare la contrazione testa. </li></ol></li><li> Sperimentare <ol><li> Posizionare la telecamera in modo che sia direttamente sopra una gabbia casa. Calibrare la telecamera in modo che l&#39;intera gabbia è nel campo visivo. </li><li> Pesare il mouse e iniettare il mouse intraperitoneale con la dose appropriata di 0,9% soluzione salina o DOI (0,01 ml / g). NOTA: Se un mouse pesa 25 grammi, somministrare la dose per un volume totale di 0,25 ml. </li><li> Mettete ogni mouse avanti nella loro gabbia casa FOR 10 min. Dopo 10 min, posto mouse al centro della gabbia casa vuota e convalidare che non ci sono punti ciechi nel campo visivo della telecamera. Premere RECORD sulla videocamera. Lascia la stanza. NOTA: i movimenti del mouse e le varie risposte comportamentali in esso (... La testa a contrazione, zero orecchio, ecc Si prega di fare riferimento alla tabella di dati supplementari 1 di Gonzalez-Maeso et al 2007 per la lista completa di risposte comportamentali indotte da DOI) 3, saranno registrate per 30 minuti. Pertanto, è importante non ci sono punti ciechi nel campo visivo registrata. </li><li> Dopo 30 min interrompere la registrazione sul mouse videocamera e posto di nuovo in gabbia casa originale. Ripetere questo processo per ogni mouse. </li></ol></li><li> Revisione <ol><li> Avere ogni revisione arbitro i nastri cieco alle condizioni sperimentali di mouse (es., Farmaci utilizzati durante la testa contrarsi esperimento o virus usato durante l&#39;iniezione intracranica)). registrare manualmente ogni testa contrazione througHout video. NOTA: Head-contrazione è definito come un movimento della testa scossa rapida condotta da un mouse (video supplementare). </li><li> Per ogni mouse, media la risposta HTR finale dai tre totali degli arbitri ciechi. Poi gruppo di questi valori di condizione sperimentale ed eseguire analisi statistiche (ad es., T-test o ANOVA). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Insieme con i precedenti risultati in mGlu2-KO topi 5, i risultati con mGlu2 e mGlu2 / mGlu3 costrutti chimerici che non formano la 5-HT complesso recettoriale 2A -mGlu2 in cellule in coltura suggeriscono che la 2A 5-HT -mGlu2 eteromerico complesso recettoriale in topo corteccia frontale è necessario per indurre comportamenti testa contrazione da allucinogeni 5-HT 2A agonisti del recettore LSD-like. Una limitazione di questo metodo è che non misura prossimità molecolare a live...

Allucinogeni, come l&#39;LSD, psilocibina e mescalina provocano significativi cambiamenti nella coscienza umana, cognizione ed emozione 7-9. L&#39;inattivazione della serotonina 5-HT 2A recettore segnalazioni da approcci sia genetici o farmacologici cause notevolmente attenuato le risposte comportamentali a allucinogeni in entrambi i modelli di roditori 3,10 e gli esseri umani 11. Anche se allucinogeni legano altri sottotipi di recettori 8, il recettore 5-HT 2A è considerato come necessario per l&#39;attività comportamentale unica di queste sostanze chimiche. Gruppo II recettori metabotropici del glutammato (es., MGlu2 e mGlu3) sono stati oggetto di considerevole attenzione per quanto riguarda il meccanismo molecolare di allucinogeni e il loro ruolo fondamentale sottostante psicosi 12. In precedenza, è stato dimostrato che topi con nessuna espressione di proteine ​​mGlu2 (topi mGlu2-KO) sono insensibili agli effetti cellulari e comportamentali di hallucinogens 5. È stato anche suggerito che la 5-HT 2A e recettori mGlu2 formano un complesso specifico eteromerico attraverso cui serotonina e glutammato ligandi modulano il modello dell&#39;accoppiamento proteina G nelle cellule viventi 1,2. Strutturalmente, transmembrana (TM) domini 4 e 5 di mGlu2 giocano un ruolo fondamentale nella formazione eteromerico con la 5-HT 2A recettore 5. Inoltre, ulteriori indagini hanno dimostrato che tre residui si trovano alla fine intracellulare di TM4 di mGlu2 sono necessari per formare il 5-HT 2A -mGlu2 recettore eterocomplesso nelle cellule viventi 6. Sulla base di questi risultati osservati in sistemi di espressione eterologa, qui si descrive l&#39;uso di espressione HSV-mediata di tipo selvaggio mGlu2 e mGlu2 / mGlu3 costrutti chimerici nella corteccia frontale di topi mGlu2-KO per verificare se la formazione eteromerico tra 5-HT 2A e mGlu2 è necessario per ilcomportamento testa contrazione indotta da allucinogeni 5-HT 2A agonisti del recettore.

<table><tbody><tr><td>mGlu2 vettore bicitronico del virus dell'herpes simplex (HSV)&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 e mGlu2DTM4N sono stati subclonati nel vettore virale bicistronico HSV-GFP p1005+ HSV che esprime GFP sotto il controllo del promotore CMV. Le particelle virali sono state prodotte dalla Viral Core Facility del McGovern Institute (MIT). Per ulteriori informazioni, contattare la direttrice, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta; Vettore TM4N bicitronico del virus dell'herpes simplex (HSV)&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 e mGlu2DTM4N sono stati subclonati nel vettore virale bicistronico HSV-GFP p1005+ HSV che esprime GFP sotto il controllo del promotore CMV. Le particelle virali sono state prodotte dalla Viral Core Facility del McGovern Institute (MIT). Per ulteriori informazioni, si prega di contattare il direttore, la dott.ssa Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>GFP vettore bicitronico del virus dell'herpes simplex (HSV)&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 e mGlu2DTM4N sono stati subclonati nel vettore virale bicistronico HSV-GFP p1005+ HSV che esprime GFP sotto il controllo del promotore CMV. Le particelle virali sono state prodotte dalla Viral Core Facility del McGovern Institute (MIT). Per ulteriori informazioni, si prega di contattare il direttore, la dottoressa Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>Xilazina.</td><td>Lloyd</td><td>List no. 4811-20ml, NADA #139-236, codice NDC: 61311-481-10</td><td>1,35 ml di ketamina (100 mg/ml) + 0,75 ml di xilazina (20 mg/ml) sono diluiti in 12,0 ml di soluzione salina allo 0,9%</td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp;</td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Codice/i: 50989-161-06</td><td>1,35 ml di ketamina (100 mg/ml) + 0,75 ml di xilazina (20 mg/ml) sono diluiti in 12,0 ml di soluzione salina allo 0,9%</td></tr><tr><td>Gel oftalmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Clip per burret</td><td>Fisher Scientific NC9268369</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica Feather</td><td>Fisher Scientific NC9032736</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Perossido</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&trade; Aghi rimovibili con mozzo piccolo (33 ga)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14816206</td><td></td></tr><tr><td>Micro trapano a batteria</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond adesivo dermico</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-1-(2,5-Dimetossi-4-iodofenil)-2-amminopropano cloridrato (DOI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42203-78-1</td><td>Disciolto in soluzione salina allo 0,9% alla concentrazione di 2,0 mg/kg</td></tr></tbody></table>

hsv-mediata transgene espressione di chimerici costrutti di studio comportamentale funzione di gpcr heteromers nei topi

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

Il complesso recettoriale eteromerico tra 5-HT2A e mGlu2 è stato implicato in alcuni dei fenotipi comportamentali in modelli murini di psicosi1,2. Di conseguenza, lo studio dei dettagli strutturali dell'interazione tra 5-HT2A e mGlu2 che influenzano i comportamenti correlati alla schizofrenia rappresenta un potente strumento traduzionale. Come precedentemente dimostrato, la risposta alla contrazione della testa (HTR) nei topi è suscitata da droghe allucinogene e questa risposta comportamentale è assente nei topi 5-HT2A knockout (KO)3,4. Inoltre, esprimendo condizionatamente il recettore 5-HT2A solo nella corteccia, è stato dimostrato che le vie di segnalazione dipendenti dal recettore 5-HT2A sui neuroni piramidali corticali sono sufficienti per suscitare un comportamento di contrazione della testa in risposta a farmaci allucinogeni3. Infine, è stato dimostrato che la risposta comportamentale alla contrazione della testa indotta dagli allucinogeni DOI e dietilamide dell'acido lisergico (LSD) è significativamente diminuita nei topi mGlu2-KO5. Questi risultati suggeriscono che mGlu2 è almeno in parte necessario per gli effetti comportamentali psicosi-dipendenti dal recettore 5-HT2A indotti da droghe simili all'LSD. Tuttavia, questo non fornisce prove sul fatto che il complesso recettoriale 5-HT 2A-mGlu2 sia necessario per questo fenotipo comportamentale. Per rispondere a questa domanda, sono stati utilizzati costrutti del virus dell'herpes simplex (HSV) per esprimere mGlu2 o mGlu2ΔTM4N (costrutto chimerico mGlu2/mGlu3 che non forma il complesso recettoriale 5-HT2A-mGlu2) nella corteccia frontale di topi mGlu2-KO per esaminare se questo complesso eteromerico GPCR è necessario per gli effetti comportamentali indotti da farmaci simili all'LSD6.

Precedenti risultati dimostrano che la testa a contrazione risposta comportamentale murino è affidabile e robusto suscitata da allucinogeni, ed è assente in 5-HT 2A topi -Ko 3. Inoltre, è stato dimostrato che la risposta testa contrazione provocata dai allucinogeni 5-HT 2A agonisti DOI e LSD era significativamente diminuita in mGlu2-KO topi 5. Tuttavia, anche se i risultati precedenti dimostrano che convincente 2A 5-HT e mGlu2 sono m...

Questo articolo viene descritto come iniettare vettori virali nel mouse corteccia frontale per testare test comportamentali che richiedono la formazione eteromerico GPCR.

HSV-mediata Transgene Espressione di chimerici costrutti di studio comportamentale funzione di GPCR Heteromers nei topi

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

L'obiettivo generale di questo metodo è osservare come il trasferimento genico mediato da virus influisca sui fenotipi comportamentali che richiedono l'eterodimerizzazione di recettori accoppiati a proteine G in modelli murini. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurofarmacologia e psicofarmacologia, in particolare riguardo al modo in cui i recettori accoppiati a proteine G interagiscono tra loro a livello molecolare.Utilizzando questo metodo, possiamo comprendere come questa interazione influisca sul comportamento in modelli di disturbi psichiatrici, come la schizofrenia e la depressione. Mediante questo approccio, analizzeremo specificamente il recettore della serotonina 2a e il recettore metabotropico del glutammato 2, entrambi coinvolti nel meccanismo d'azione dei farmaci utilizzati per trattare pazienti affetti da schizofrenia. Iniziare anestetizzando correttamente il topo secondo metodi approvati.Assicurarsi che sia stato raggiunto un piano chirurgico di anestesia eseguendo una compressione del dito del piede e osservando l'assenza di risposta. Applicare quindi un gel oftalmico per proteggere gli occhi. Fissare il topo al telaio stereotassico, avendo cura di regolare l'inclinazione della testa in modo che il cranio sia in posizione orizzontale e piatta.Applicare iodopovidone sul cuoio capelluto esposto. Utilizzando un bisturi, eseguire un'incisione sagittale lungo la linea mediana del cranio nella zona rasata esposta. Quindi applicare pinze pureit ai lembi cutanei nel sito dell'incisione per assicurarsi che il cranio rimanga esposto.Applicare perossido di idrogeno per rimuovere il periostio ed esporre le suture del cranio. Ora che il bregma e le suture sono visibili, regolare con cura il telaio stereotassico per assicurarsi che il cranio sia in posizione orizzontale. Allineare le punte degli aghi delle siringhe con il bregma e registrare le coordinate del bregma.Per eseguire un'iniezione bilaterale della corteccia frontale, aggiungere 1,6 mm alla coordinata rostro-caudale registrata del bregma e 2,6 mm alla coordinata mediale-laterale registrata del bregma. Segnare i siti di iniezione sul cranio quindi praticare piccoli fori nei punti di iniezione. Con un applicatore a punta di cotone, rimuovere eventuali tracce di sangue o frammenti ossei.Portare l'ago fino alla superficie del cervello e abbassarlo alla profondità della coordinata dorso-ventrale. Iniettare quindi lentamente il contenuto della siringa ruotando lo stantuffo dell'ago per somministrare 0,1 microlitri al minuto per cinque minuti, per un'iniezione totale di 0,5 microlitri. Lasciare la siringa in posizione per cinque minuti.Trascorso il tempo previsto, rimuovere l'animale dalla stereotassia, chiudere l'incisione e posizionarlo su un tappetino riscaldante. Somministrare analgesia postoperatoria secondo il protocollo per animali approvato. Eseguire i test comportamentali due o tre giorni dopo l'iniezione stereotassica di particelle virali.Abituare i topi alla stanza per almeno quattro ore prima dell'inizio dell'esperimento. Iniziare sciogliendo il DOI in una soluzione salina allo 0,9 percento fino a due milligrammi per chilogrammo. Preparare una gabbia domestica senza lettiera e, utilizzando un treppiede, regolare una telecamera in modo che si trovi direttamente sopra la gabbia domestica.Calibrare la telecamera in modo che l'intera gabbia di casa sia nel campo visivo. Pesare il topo e iniettare intraperitonealmente la dose appropriata di soluzione salina allo 0,9 percento o di DOI. Rimettere il topo nella gabbia di casa per dieci minuti.Dopo dieci minuti, posizionare il topo al centro della gabbia domestica vuota e assicurarsi che non ci siano punti ciechi nel campo visivo della telecamera. Premere il tasto di registrazione sul videoregistratore e lasciare la stanza. Dopo 30 minuti, interrompere la registrazione e rimettere il topo nella gabbia domestica originale.Ripetere il test comportamentale sul topo successivo. Far rivedere i video al giudice in cieco rispetto alle condizioni sperimentali. Registrare manualmente ogni scatto della testa durante tutto il video.Un movimento rapido della testa è definito come un movimento rapido e scattante della testa effettuato da un topo. Elaborare i dati come indicato nella sezione scritta del protocollo. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa dell'espressione del transgene mediata da HSV nella corteccia frontale.È stato iniettato HSV mGlu2 GFP nella corteccia frontale e l'espressione di GFP è stata rivelata mediante immunocitochimica. Questa barra della scala rappresenta 200 micrometri. Questa immagine mostra un blot occidentale dell'espressione del transgene mediata da HSV e della reattività anti-mGlu2 nella corteccia frontale di topi knock-out per mGlu2.Qui abbiamo misurato l'immunoreattività di mGlu2 in forma di monomero. Questo istogramma mostra che l'espressione mediata da virus di mGlu2, ma non quella di mGlu2 chimerico nella corteccia frontale di topi knockout per mGlu2, ripristina in modo significativo la risposta al movimento scattante della testa indotta dall'agonista del recettore della serotonina 2a allucinogeno DOI. I passaggi più critici di questo esperimento sono i tempi tra le iniezioni virali, la risposta al movimento scattante della testa e il momento in cui i topi vengono sacrificati.Ogni ritardo può alterare i risultati dell'esperimento o introdurre ambiguità nei dati. Una volta acquisita padronanza, l'intervento chirurgico sul topo richiederà circa 30 minuti per l'iniezione del virus. Anche l'esperimento del tremore della testa dovrebbe richiedere circa 35 minuti per topo.Si consiglia di eseguire interventi chirurgici a scaglioni, ovvero operare più di un topo contemporaneamente. In questo modo è possibile rispettare una tempistica che permette di effettuare gli esperimenti sullo head twitch tra i tre e i quattro giorni successivi all'intervento chirurgico, periodo in cui si verifica l'espressione massima del costrutto virale. Grazie per averci seguito e buona fortuna con il vostro esperimento.

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