HSV-mediata Transgene Espressione di chimerici costrutti di studio comportamentale funzione di GPCR Heteromers nei topi
9 luglio 2016
Questo articolo viene descritto come iniettare vettori virali nel mouse corteccia frontale per testare test comportamentali che richiedono la formazione eteromerico GPCR.
L'obiettivo generale di questo metodo è osservare come il trasferimento genico mediato da virus influenzi i fenotipi comportamentali che richiedono l'eterodimerizzazione dei recettori accoppiati a proteine G in modelli murini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuro e della psicofarmacologia. In particolare, come i recettori accoppiati alle proteine g interagiscono tra loro a livello molecolare.
Utilizzando questo metodo possiamo capire come questa interazione influenzi il comportamento in modelli di disturbi psichiatrici, come la schizofrenia e la depressione. Utilizzando questo metodo esamineremo in particolare la serotonina 2a e il recettore metabotropico del glutammato 2, entrambi i quali hanno dimostrato di essere implicati nel meccanismo d'azione dei farmaci usati per trattare i pazienti con schizofrenia. Inizia anestetizzando correttamente il topo secondo i metodi approvati.
Assicurarsi che sia stato ottenuto un piano chirurgico di anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi e notando l'assenza di risposta. Quindi applicare il gel oftalmico per proteggere gli occhi. Attacca il mouse alla cornice stereotassica, assicurandoti di regolare l'inclinazione della testa in modo che il cranio sia livellato e piatto.
Applicare lo iodio povidone sul cuoio capelluto esposto. Usando un bisturi, praticare un'incisione sagittale lungo la linea mediana del cranio all'interno dell'area rasata esposta. Quindi attacca i morsetti pureit alla pelle nel sito dell'incisione per assicurarti che il cranio rimanga esposto.
Applicare perossido di idrogeno per sciogliere il periostio ed esporre le suture del cranio. Ora che il bregma e le suture sono visibili, assicurati di regolare il telaio stereotassico per assicurarti che il cranio sia a livello. Allineare le punte dell'ago delle siringhe con bregma e registrare le coordinate di bregma.
Per iniettare bilateralmente la corteccia frontale, aggiungere 1,6 mm alla coordinata bregma caudale rostrale registrata e 2,6 mm alla coordinata bregma laterale mediale registrata. Contrassegnare i siti di iniezione sul cranio e quindi praticare piccoli fori nei siti di iniezione. Con un applicatore con punta di cotone, rimuovere il sangue in eccesso o i frammenti ossei.
Porta l'ago sulla superficie del cervello e abbassalo fino alla profondità della coordinata ventrale dorsale. Quindi iniettare lentamente il contenuto della siringa ruotando lo stantuffo dell'ago per somministrare 0,1 microlitri al minuto per cinque minuti, per un'iniezione di 0,5 microlitri. Lasciare che la siringa rimanga in posizione per cinque minuti.
Trascorso il tempo assegnato, rimuovere l'animale dalla stereotassi, chiudere l'incisione e posizionarlo su un cuscinetto riscaldante. Somministrare l'analgesia post-operatoria secondo il protocollo approvato per gli animali. Eseguire test comportamentali due o tre giorni dopo l'iniezione stereotassica di particelle virali.
Abituare i topi alla stanza per almeno quattro ore prima dell'inizio dell'esperimento. Inizia sciogliendo il DOI in una soluzione salina allo 0,9% a due milligrammi per chilogrammo. Prepara una gabbia domestica senza lettiera e, utilizzando un treppiede, regola una fotocamera in modo che sia direttamente sopra la gabbia domestica.
Calibrare la telecamera in modo che l'intera gabbia domestica si trovi nel campo visivo. Pesare il topo e iniettare per via intraperitoneale la dose appropriata di soluzione fisiologica allo 0,9% o DOI. Rimetti il mouse nella gabbia di casa per dieci minuti.
Dopo dieci minuti, posiziona il mouse al centro della gabbia domestica vuota e assicurati che non ci siano punti ciechi nel campo visivo della telecamera. Premere il tasto di registrazione sulla videocamera e lasciare la stanza. Dopo 30 minuti, interrompere la registrazione e riposizionare il mouse nella gabbia domestica originale.
Ripetere il test comportamentale sul mouse successivo. Chiedi all'arbitro di rivedere i video alla cieca delle condizioni sperimentali. Registra manualmente ogni contrazione della testa durante il video.
Una contrazione della testa è definita come un rapido movimento di scuotimento della testa condotto da un topo. Elaborare i dati come descritto nella parte scritta del protocollo. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa dell'espressione del transgene mediata da HSV nella corteccia frontale.
La GFP mGlu2 dell'HSV è stata iniettata nella corteccia frontale e l'espressione della GFP è stata rivelata dall'immunocitochimica. Questa barra di scala rappresenta 200 micron. Questa immagine mostra un western blot dell'espressione del transgene mediata da HSV e della reattività anti-mGlu2 nella corteccia frontale di topi knockout per mGlu2.
Qui abbiamo misurato l'immunoreattività di mGlu2 come monomero. Questo istogramma mostra che l'espressione virale mediata di mGlu2, ma non di mGlu2 chimerica nella corteccia frontale di topi knockout per mGlu2, salva significativamente la risposta di contrazione della testa indotta dall'agonista allucinogeno del recettore della serotonina 2a DOI. I passaggi più critici di questo esperimento sono i tempi tra le iniezioni virali, la risposta alla contrazione della testa e il momento in cui i topi vengono sacrificati.
Qualsiasi ritardo può alterare i risultati dell'esperimento o introdurre ambiguità nei dati. Una volta padroneggiato, l'intervento chirurgico sul topo richiederà circa 30 minuti per iniettare il virus. Anche l'esperimento di contrazione della testa dovrebbe durare circa 35 minuti per topo.
Si consiglia di scaglionare gli interventi chirurgici o di operare su più di un mouse alla volta. In questo modo è possibile mantenere una sequenza temporale che consente di eseguire gli esperimenti di contrazione della testa nei tre o quattro giorni dopo l'intervento chirurgico, che è il momento di massima espressione del costrutto virale. Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per iniettare vettori virali nella corteccia frontale del topo per studiare i saggi comportamentali legati alla formazione eteromerica dei GPCR. L'approccio mira a chiarire le interazioni molecolari dei recettori accoppiati alle proteine G e il loro impatto sul comportamento nei modelli psichiatrici.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Farmacologia
- Scienza Comportamentale
Background
- I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) svolgono un ruolo cruciale nella neurotrasmissione.
- Comprendere le interazioni dei GPCR può fornire informazioni sui disturbi psichiatrici.
- L'eterodimerizzazione dei GPCR può influenzare i risultati comportamentali.
- Questo metodo utilizza vettori virali per il trasferimento genico nei modelli di topo.
Scopo dello studio
- Indagare gli effetti del trasferimento genico mediato da virus sui fenotipi comportamentali.
- Esplorare l'interazione tra il recettore serotonina 2A e il recettore metabotropico del glutammato 2.
- Affrontare questioni nella neuro e psicofarmacologia.
Metodi utilizzati
- Corretta anestesia dei topi secondo metodi approvati.
- Iniezione di vettori virali nella corteccia frontale.
- Saggi comportamentali per valutare l'impatto delle interazioni dei GPCR.
- Analisi dei fenotipi comportamentali legati ai disturbi psichiatrici.
Risultati principali
- Informazioni sulla formazione eteromerica dei GPCR e le sue implicazioni comportamentali.
- Comprendere il ruolo del recettore serotonina 2A e del recettore metabotropico del glutammato 2.
- Possibili collegamenti tra le interazioni dei GPCR e le condizioni psichiatriche.
- Contributo al campo della neurofarmacologia attraverso i risultati sperimentali.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un quadro per studiare le interazioni dei GPCR in vivo.
- I risultati possono informare le strategie terapeutiche per i disturbi psichiatrici.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare le implicazioni di queste interazioni.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Dissecting the behavioral function of GPCR heteromers using HSV-mediated transgene expression in mice addresses a critical challenge in neuropsychiatric drug discovery: establishing mechanistic links between receptor complexes and disease-relevant phenotypes. This approach enables predictive confidence in target validation for psychiatric disorders by isolating the functional necessity of specific receptor interactions. The method supports risk-adjusted portfolio decisions at the interface of early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of GPCR heteromer function in vivo for mechanistic de-risking.
- Clarifies the necessity of specific receptor complexes for disease-relevant behavioral phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection for neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Establishes validated behavioral assays linked to molecular interventions for downstream screening.
- Provides quantitative behavioral outputs (head-twitch response) for assay standardization.
- Facilitates reproducible evaluation of genetic and pharmacological manipulations in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical behavioral models with human disease mechanisms via receptor complex interrogation.
- Enables continuity from molecular discovery to behavioral validation in animal models.
- Supports translational biomarker development by linking molecular interventions to quantifiable phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling hypothesis-driven testing of receptor complex function in disease-relevant behavioral systems.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for GPCR heteromer involvement in psychiatric phenotypes.
- Screening: Provides a platform for quantitative behavioral readouts following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Delivers measurable endpoints (head-twitch counts) for statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects molecular interventions to behavioral outcomes relevant to psychiatric disorders.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for interrogating other receptor complexes in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity for neuropsychiatric drug programs.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping linked to molecular interventions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the necessity of receptor complexes for disease-relevant behaviors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms for advancement in CNS pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and behavioral phenotyping in rodents.
- Demands access to viral vector production and molecular validation infrastructure (immunocytochemistry, western blotting).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of injection timing, behavioral testing, and data analysis.
- Adaptation to other receptor complexes or behavioral assays may require protocol optimization.
- Precise timing between viral delivery, behavioral assessment, and tissue collection is critical for data integrity.
