HSV-mediata Transgene Espressione di chimerici costrutti di studio comportamentale funzione di GPCR Heteromers nei topi

L'obiettivo generale di questo metodo è osservare come il trasferimento genico mediato da virus influisca sui fenotipi comportamentali che richiedono l'eterodimerizzazione di recettori accoppiati a proteine G in modelli murini. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurofarmacologia e psicofarmacologia, in particolare riguardo al modo in cui i recettori accoppiati a proteine G interagiscono tra loro a livello molecolare.

Utilizzando questo metodo, possiamo comprendere come questa interazione influisca sul comportamento in modelli di disturbi psichiatrici, come la schizofrenia e la depressione. Mediante questo approccio, analizzeremo specificamente il recettore della serotonina 2a e il recettore metabotropico del glutammato 2, entrambi coinvolti nel meccanismo d'azione dei farmaci utilizzati per trattare pazienti affetti da schizofrenia. Iniziare anestetizzando correttamente il topo secondo metodi approvati.

Assicurarsi che sia stato raggiunto un piano chirurgico di anestesia eseguendo una compressione del dito del piede e osservando l'assenza di risposta. Applicare quindi un gel oftalmico per proteggere gli occhi. Fissare il topo al telaio stereotassico, avendo cura di regolare l'inclinazione della testa in modo che il cranio sia in posizione orizzontale e piatta.

Applicare iodopovidone sul cuoio capelluto esposto. Utilizzando un bisturi, eseguire un'incisione sagittale lungo la linea mediana del cranio nella zona rasata esposta. Quindi applicare pinze pureit ai lembi cutanei nel sito dell'incisione per assicurarsi che il cranio rimanga esposto.

Applicare perossido di idrogeno per rimuovere il periostio ed esporre le suture del cranio. Ora che il bregma e le suture sono visibili, regolare con cura il telaio stereotassico per assicurarsi che il cranio sia in posizione orizzontale. Allineare le punte degli aghi delle siringhe con il bregma e registrare le coordinate del bregma.

Per eseguire un'iniezione bilaterale della corteccia frontale, aggiungere 1,6 mm alla coordinata rostro-caudale registrata del bregma e 2,6 mm alla coordinata mediale-laterale registrata del bregma. Segnare i siti di iniezione sul cranio quindi praticare piccoli fori nei punti di iniezione. Con un applicatore a punta di cotone, rimuovere eventuali tracce di sangue o frammenti ossei.

Portare l'ago fino alla superficie del cervello e abbassarlo alla profondità della coordinata dorso-ventrale. Iniettare quindi lentamente il contenuto della siringa ruotando lo stantuffo dell'ago per somministrare 0,1 microlitri al minuto per cinque minuti, per un'iniezione totale di 0,5 microlitri. Lasciare la siringa in posizione per cinque minuti.

Trascorso il tempo previsto, rimuovere l'animale dalla stereotassia, chiudere l'incisione e posizionarlo su un tappetino riscaldante. Somministrare analgesia postoperatoria secondo il protocollo per animali approvato. Eseguire i test comportamentali due o tre giorni dopo l'iniezione stereotassica di particelle virali.

Abituare i topi alla stanza per almeno quattro ore prima dell'inizio dell'esperimento. Iniziare sciogliendo il DOI in una soluzione salina allo 0,9 percento fino a due milligrammi per chilogrammo. Preparare una gabbia domestica senza lettiera e, utilizzando un treppiede, regolare una telecamera in modo che si trovi direttamente sopra la gabbia domestica.

Calibrare la telecamera in modo che l'intera gabbia di casa sia nel campo visivo. Pesare il topo e iniettare intraperitonealmente la dose appropriata di soluzione salina allo 0,9 percento o di DOI. Rimettere il topo nella gabbia di casa per dieci minuti.

Dopo dieci minuti, posizionare il topo al centro della gabbia domestica vuota e assicurarsi che non ci siano punti ciechi nel campo visivo della telecamera. Premere il tasto di registrazione sul videoregistratore e lasciare la stanza. Dopo 30 minuti, interrompere la registrazione e rimettere il topo nella gabbia domestica originale.

Ripetere il test comportamentale sul topo successivo. Far rivedere i video al giudice in cieco rispetto alle condizioni sperimentali. Registrare manualmente ogni scatto della testa durante tutto il video.

Un movimento rapido della testa è definito come un movimento rapido e scattante della testa effettuato da un topo. Elaborare i dati come indicato nella sezione scritta del protocollo. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa dell'espressione del transgene mediata da HSV nella corteccia frontale.

È stato iniettato HSV mGlu2 GFP nella corteccia frontale e l'espressione di GFP è stata rivelata mediante immunocitochimica. Questa barra della scala rappresenta 200 micrometri. Questa immagine mostra un blot occidentale dell'espressione del transgene mediata da HSV e della reattività anti-mGlu2 nella corteccia frontale di topi knock-out per mGlu2.

Qui abbiamo misurato l'immunoreattività di mGlu2 in forma di monomero. Questo istogramma mostra che l'espressione mediata da virus di mGlu2, ma non quella di mGlu2 chimerico nella corteccia frontale di topi knockout per mGlu2, ripristina in modo significativo la risposta al movimento scattante della testa indotta dall'agonista del recettore della serotonina 2a allucinogeno DOI. I passaggi più critici di questo esperimento sono i tempi tra le iniezioni virali, la risposta al movimento scattante della testa e il momento in cui i topi vengono sacrificati.

Ogni ritardo può alterare i risultati dell'esperimento o introdurre ambiguità nei dati. Una volta acquisita padronanza, l'intervento chirurgico sul topo richiederà circa 30 minuti per l'iniezione del virus. Anche l'esperimento del tremore della testa dovrebbe richiedere circa 35 minuti per topo.

Si consiglia di eseguire interventi chirurgici a scaglioni, ovvero operare più di un topo contemporaneamente. In questo modo è possibile rispettare una tempistica che permette di effettuare gli esperimenti sullo head twitch tra i tre e i quattro giorni successivi all'intervento chirurgico, periodo in cui si verifica l'espressione massima del costrutto virale. Grazie per averci seguito e buona fortuna con il vostro esperimento.